Name: KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 학습하세요 KSHV 감염 인간 세포에서 형광 시투 혼성화(FISH)와 면역형광(IF)을 이용한 바이러스 RNA 정량 분석 방법을. 이 기술은 숙주-바이러스 상호작용 연구에 필수적입니다.

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조나단 로덴펠스, 카지미에츠 티코스키, 요한나 B. 위더스에게 데이터 분석에 대한 조언을 해주셔서 감사합니다. 우리는 또한 반대로 SSB 항체를 위한 G. Hayward 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (TKV)과 NIH 교부금 (CA16038)에서 T32GM007223 및 T32AI05403 (JAS에)에 의해 지원되었습니다. JAS는 하워드 휴즈 의학 연구소의 조사자입니다. 그림 1-3 및 표 1은 다음 출판물에서 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스에 따라 미국 미생물학 협회의 허가를 받아 복제되었습니다: Vallery, T. K., 위더스, J. B., 안도, J. A., 스테이츠, J. A. 카포시의 육종 관련 핵 포시에 헤르페스 바이러스 mRNA 축적은 바이러스 DNA 복제 및 바이러스 비코딩 폴리아데닐화 핵 RNA에 의해 영향을 받습니다. 바이러스학의 전표. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

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</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

본 보고서에 기재된 프로토콜은 상이한 세포 유형에 적응될 수 있으며, 단일클론 및 폴리클로날 1차 항체를 모두 사용하는 경우와 함께 이중 RNA FISH 및 RNA FISH에 대한 단계를 포함한다. 준비된 슬라이드는 전형적으로 공초점 현미경으로 이미지화되지만, 증가된 항체 농도 및 상이한 장착 매체의 변형 후 STED(자극방출 고갈) 현미경으로 영상을 수행할 수 있다. 개별 세포의 향상된 분석을 위해, 이 프로토콜로 준비된 견본은 또한 Borah 및 동료16에의해 도시된 바와 같이 적당한 변경을 가진 세포 선별기 또는 유동 세포계에 의해 분류, 화상 및 분석될 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜은 살아있는 세포 화상 진찰을 위해 채택될 수 없습니다.
정량화 방법은 관찰 편향을 제거하고 잠재적인 뉴클레오세포 시질 변화를 검증하는 역할을 한다. 뉴클레오세포 질 비율은 또한 생체 분자가 특정 세포 외 구획에 국소화하기 위하여 고르게 분산되는 에...

그들의 용리 (활성) 단계에서, 헤르페스 바이러스는 숙주 세포를 납치하여 세포 형태와 생물학적 분자의 국소화의 변화를 일으켜 비리온을 생성합니다. 작전의 기초는 이중 가닥 DNA 바이러스 게놈이 capsid1에게불린 단백질 껍질로 복제되고 포장되는 핵입니다. 시작하기 위하여, 바이러스는 그것의 자신의 단백질을 표현하고, 호스트 기계를 납치하고 비필수 호스트 유전자의 발현을 방지합니다, 프로세스는 호스트 차단 효력을 불릴. 이 활동의 대다수는 특정 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)가 없는 바이러스 성 복제 구획이라고 불리는, 호스트 및 바이러스 성 단백질,RNA 및 바이러스 DNA 2로 구성된 지역화된다. 셀은 복제 구획에 대한 공간과 자원을 제공하기 위해 정밀 검사되어 바이러스 성 캡시드의 조립을 합니다. 일단 capsid가 핵을 종료하면, 캡시드가 세포질에서 어떻게 비리온이라고도 하는 막 결합된 바이러스성 입자를 생성하기 위하여 포위되는지, 불분명합니다. 용해 단계 도중 호스트와 바이러스성 생체 분자 둘 다의 현지화 그리고 공간 교대의 이해는 복제 구획의 배열, 호스트 차단 효력, virion-egress 통로 및 그밖에 더 깊은 기계론적인 통찰력을 제공합니다 헤르페스 바이러스 감염 및 복제와 관련된 프로세스.
현재 이러한 변화를 감지하고 연구하는 가장 좋은 방법은 각각 동형형형화(FISH)에서 면역형광(IF)과 형광을 가진 감염된 세포에서 단백질과 RNA의 시각화입니다. 이러한 기술을 사용한 타임 코스를 사용하면 용해 단계의 핵심 지점에서 생체 분자의 국소화 또는 단순히 시공간 적 데이터를 알 수 있습니다. FISH 및 IF는 세포 과정의 억제(예를 들어, 바이러스 DNA 복제의 억제), RT-qPCR(실시간 중합효소 연쇄 반응), RNA 시퀀싱, 북부 블롯, 질량 분광법, 웨스턴 블로팅, 및 바이러스 DNA 생산의 분석, 그 세포 활동의 더 글로벌 그림을 제공할 수 있습니다.
우리는 특정 유전자에서 RNA 제품을 검사하는 RNA FISH 전략 및 특정 유전자 생성물의 뉴클레오세포 비율을 정량적으로 계산하는 계산 분석을 개발했습니다. Steitz 및 동료3,4에의해 이전 간행물에서 수정된 샘플 준비는 상대적으로 용이하며 부착 및 부유 셀 모두에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 IF 전략과 다중 RNA FISH 전략 (이중 RNA FISH) 또는 RNA FISH의 동시 사용에 적응할 수 있습니다. 특정 FISH 전략의 개발은 어렵지만 성공을 개선하기 위한 제안이 설명되어 있습니다. 여기에 설명된 데이터 분석은 형광 비드와 구획 경계의 강력한 마커를 사용하고 현미경 조사에 대한 추가 통찰력을 제공하는 경우 정량적이며 관찰 편향을 제거하는 통찰력을 제공합니다. 상세 프로토콜은 Kaposi의 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)에 의해 감염된 잠재 세포와 용염 세포를 위해 설계되었으며 다른 헤르페스 바이러스에 감염된 감염되지 않은 세포 또는 세포와 함께 사용할 수있습니다5. 정량의 방법은 대부분의 세포에 있는 subcellular 구획 사이 뉴클레오세포 세포 교대 또는 재국소화에 연구 결과에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor594-5-dUTP</td><td>Life Technologies</td><td>C1100</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG FITC&nbsp;</td><td>Jackson Lab Immunologicals</td><td>200-092-156</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Goat</td></tr><tr><td>Anti-SSB 항체</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ref. Chiou et al. 2002</td></tr><tr><td>BLASTn</td><td>NIH NCBI</td><td>N/A</td><td>Free Sequence Alignment Software</td></tr><tr><td>Dextran Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>DIG-올리고뉴클레오티드 테일링 키트</td><td>Sigma Roche</td><td>#03353583910</td><td>2세대</td></tr><tr><td>여덟 개의 챔버 슬라이드</td><td>Nunc Lab Tek II</td><td>#154453</td><td>블루 씰은 표면 장력을 촉진하지만 투명 젤에 의한 분리도 가능합니다.</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>F9037</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>GAPDH 프로브</td><td>스텔라리스</td><td>SMF-2019-1</td><td>프로토콜, Quasar 670</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp와</td> 호환 가능;<td>NIH, Bethesda, MD</td><td>N/A</td><td>무료 이미지 분석 소프트웨어, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td></tr><tr><td>OligoAnalyzer</td><td>IDT N</td><td>/A</td><td>무료 올리고뉴클레오티드 분석기&nbsp;</td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>A-150228</td><td></td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>Amaxa</td><td>VDF-1012</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>말단 전이효소</td><td>Sigma Roche</td><td>#003333574001</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl Ribonucleoside 복합체&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>벡타쉴</td>드 <td>벡터 연구소, Inc.&nbsp;</td>마운팅 미디어 내의 <td>H-1000</td><td>DAPI는 빛을 산란시키고 대비를 줄입니다.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kshv 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (fish) 및 면역 형광 (if)의 정량형 형광

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

기계론적 통찰력은 특정 RNA 및 단백질의 신중한 연구 및 정량화에서 옵니다. 특정 시간에 세포 를 통해 이 생체 분자의 상대적인 위치는 위치 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)에 있는 형광으로 붙잡을 수 있습니다. lytic 헤르페스 바이러스 감염 도중, 바이러스는 우대적으로 바이러스성 유전자를 표현하기 위하여 호스트 세포를 납치하고, 생체 분자의 세포 형태 그리고 행동에 있는 변경을 일으키는 원인이 됩니다. Lytic 활동은 원자력 공장을 중심으로, 물고기와 IF로만 식별 할 수있는 바이러스 복제 구획이라고합니다. 여기에서 우리는 카포시의 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)에 대한 RNA FISH 및 IF 기술의 적응 프로토콜을 설명합니다, 모두 부착 및 현탁액. 이 방법은 특정 안티 센스 올리고뉴클레오티드, 이중 RNA FISH, IF를 이용한 RNA FISH, 및 형광 강도의 정량적 계산의 개발을 위한 단계를 포함한다. 이 프로토콜은 여러 세포 유형, 감염되지 않은 세포, 잠복 세포, 용리 세포, 시간 과정 및 억제물로 처리된 세포에 성공적으로 적용되어 인간 숙주 및 단백질 모두에서 특정 RNA 및 단백질의 시공간 활동을 분석했습니다. KSHV.

이 원고에 자세히 설명된 FISH 및 IF 방법은 형광 강도의 선 자취에 의한 결과의 정량화와 함께 그림 1에 나와 있습니다. 여기에 제시된 결과는 반정적이며, 실험이 슬라이드 준비에 형광 비드를 포함하지 않았기 때문에 다른 형광 얼룩의 강도 사이의 비교보다는 지역화에 대한 통찰력을 제공합니다. 도 1은 또한 세포질 및 핵 영역 및 이들의 비율이 잠재 및 용해 KSHV 감염 세포에 대해 상이하다는 것을 보여준다. 따라서, 영역은 도2에 전시된 뉴클레오세포비에서 조절된다. 도 2는 핵 대조군, 바이러스 성 폴리아데닐화 핵(PAN) RNA, 및 세포질 조절, 숙주 GAPDH mRNA를 사용하여 핵세포질 비에 대해 본 원고에 상세히 설명된 계산을 검증한다. <str...

우리는 현탁액 또는 부착물에서 서정적으로 감염된 인간 세포 내의 다중 헤르페스 바이러스 RNA를 시각화하기 위해 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뉴클레오세포질을 생성하는 형광의 정량화를 포함하고 면역형광(IF)을 가진 숙주 및 바이러스 성 단백질의 동시 시각화를 위해 확장될 수 있다.

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

프로토콜은 특히 헤르페스 바이러스와 관련하여 숙주 세포의 맥락에서 바이러스 유전자 제품의 시간적 조절에 대한 정량적 통찰력을 얻는 데 도움이됩니다. 이 기술은 호스트와 바이러스성 RNA 및 단백질 둘 다에 관련있는 연구 질문을 해결하는 것을 도울 수 있습니다. 더욱이, 이 기술은 동시 생화학적 인 분석을 호환합니다.8개의 챔버 슬라이드에 세포를 부착하려면, 멸균의 각 챔버에 내재된 세포 현탁액 200마이크로리터를 적용하고, 8개의 챔버 슬라이드를 바르고, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 12-24시간 동안 종자 성장을 허용한다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼 나탄과 부착되지 않은 세포를 흡인하고, 즉시 얼음에 PBS에서 미리 냉각 된 4 % 포름 알데히드로 세포를 수정, 30 분. 고정의 끝에서, 세척 당 섭씨 4도 PBS의 200 마이크로 리터에 3, 5 분 세척으로 세포를 씻어.마지막 세척 후, 고정 된 세포를 200 마이크로 리터의 PBS에서 0.5 % 트리톤-X로 얼음에 10 분 동안 투과화하십시오. 투과화의 끝에서, 조심스럽게 슬라이드를 균열하지 않고 챔버를 제거하고, 미리 차가운 PBS로 세포를 헹구십시오. PBS에서 30분 동안 PBS에서 4%BSA를 미리 냉각한 헹구는 세포를 4도에서 30분 동안 차단한 다음, PBS에서 0.1%BSA에 대한 적절한 다각성 1차 항체를 4°C에서 4도에서 배양한다.인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS로 세포를 세 번 세척하고 적절한 이차 항체로 세포를 배양하고 4°C에서 1시간 동안 항체를 검출하는 FISH와 호환되는 플루오라포릭과 결합된 적절한 이차 항체로 세포를 배양한다. 시연된 바와 같이 세 가지 PBS 세차재 후, PBS에서 4%포름알데히드로 샘플을 다시 수정하여 10-15분 동안 두 번째 permeablization 전에 수정합니다. 그런 다음 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮어 형광 신호를 보존하고 광표백을 방지합니다.그리고 혼성화 용액45 마이크로 리터를 적용하기 전에 2 배 식염수 나트륨 구연산나트륨으로 세포를 세척하십시오. 가습 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 후, 10 마이크로 리터에 데우음 볼륨을 가지고 관심의 안티 센스 올리고 뉴클레오티드에 증류수를 추가합니다. 슬라이드 당 신선한 혼성화 용액의 35 마이크로 리터를 추가하기 전에 5 분 동안 섭씨 95도에서 올리고 뉴클레오티드를 해독합니다.그런 다음 호일로 보호되는 섭씨 37도에서 가습 챔버에서 10-24 시간에서 샘플을 배양합니다. 다음 날, 2, 10 분으로 세포를 씻으시면 됩니다. 식염수 나트륨 은 실온에서 세척하고, 섭씨 25도에서 10 분 동안 1 배 식염수 나트륨 구연산나트륨으로 1 회 세척합니다.마지막 세척 후, PBS에서 미리 냉각 된 4 % 포름 알데히드로 세포를 수정하고 얼음에 10-15 분 동안, 신선한 PBS와 세 세척. 다음으로, 입증된 바와 같이 시료를 투약화하고, 이산화방지FTC를 배양하고 PBS에서 0.1%BSA를 사전 냉각하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 구비합니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 PBX에서 슬라이드를 세 번 세척하고 PBS에서 미리 냉각된 4%파라포름알데히드로 샘플을 섭씨 4도에서 10-15분 동안 수정합니다.PBS에서 세 번의 세차재 후, DAPI의 밀리리터 당 0.4 마이크로그램으로 핵을 라벨을 붙이고 PBS에서 0.5%트리톤-X를 얼음으로 15분 간 미리 냉각한 다음 PBS에서 세 번의 최종 세차재가 뒤따릅니다. 형광 구슬이 있는 슬라이드를 실험적으로 관련이 있고 적절한 마운팅 매체로 마운트합니다. 멸균 물티슈로 과도한 장착 매체를 제거한 후, 투명 매니큐어의 여러 코팅으로 각 슬라이드에 하나의 커버슬립을 밀봉하고 형광 현미경을 사용하여 실험의 성공적인 실행을 확인합니다.그런 다음 이미지는 공초점 현미경으로 촬영하여 장착 후 1시간에서 1주일 이내에 630배 배율로 샘플의 이미지를 수집할 수 있습니다. 이러한 대표적인 FISH 및 면역 형광 결과는 반정성이며, 이러한 실험이 슬라이드 제제에 형광 구슬을 포함하지 않았기 때문에 상이한 형광 얼룩의 강도 사이의 비교보다는 올리고뉴클레오티드 국소화에 대한 통찰력을 제공한다. 이러한 실험에서, 세포질 및 핵 영역 및 그들의 비율은 잠복및 lytic KSHV 감염한 세포를 위해 달랐습니다.이 그림에서 설명한 바와 같이, 영역은 뉴클레오사이클라즘 비에서 조절된다. KSHV DNA 복제가 리틱 단계에서 억제되면 KSHV 올리고뉴클레오티드 전사체의 초기 리틱 단백질이 주로 세포질 국소화로 전환됩니다. KSHV 폴리아데니화 RNA는 바이러스 DNA 복제의 억제에도 불구하고 특정 핵 부위에 국소화된다.슬라이드에서 챔버를 제거 할 때 도구에 접착제 잔류물이 거의 없다는 것을 주의하고 에탄올을 사용하여 세포를 퍼미블화하고 접착제를 약화시십시오. QPCR, 웨스턴 블롯 및 고처리량 시퀀싱과 같은 생화학 적 분석체는 마이크로그래프로부터 수집된 정량적 데이터를 보강하기 위해 나란히 수행될 수 있다.

quantitative-fluorescence-situ-hybridization-fish-immunofluorescence

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

숙주 세포 요인은 설치 및 Kaposi의 육종 (KS)의 유지에 중요한 역할을한다. 우리는 KSHV에 감염된 DMVEC 전지 변경 숙주 세포 요소를 식별하는 방법을 설명하고, KS 종양 조직 인치 바이러스에 의해 변경 세포 유전자 소설 치료제에 대한 잠재적인 대상 (S) 역할을합니다.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

이 비디오에서는 MCPyV 비리온에 감염된 세포를 현장 혼성화 연쇄 반응을 통해 MCPyV 특이적 게놈을 검출했습니다. 또한 DNA-HCR 기술을 FISH와 결합하여 감염된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 시각화했습니다.

HCR-DNA FISH: 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 검출하기 위한 형광 현장 혼성화 기술

이 비디오는 SARS-CoV-2 아게놈 RNA의 공간 분포를 시각화하기 위한 HCR(Hybridization Chain Reaction)-FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)의 적용을 보여줍니다. HCR과 면역형광 기술을 결합하면 단일 세포 수준에서 숙주-바이러스 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Immuno-RNA Fluorescence In Situ Hybridization을 사용하여 SARS-CoV-2 시각화

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

이 프로토콜은 BAC16 유래 비리온을 사용하여 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스의 새로운 용해 감염을 모델링하는 시험관 내 시스템을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 초기 바이러스 복제 및 전파를 조사할 수 있습니다. 감염성 바이러스 생산은 GFP 기반 감염 단위 분석 및 캡슐화된 바이러스 게놈의 실시간 PCR에 의해 정량화됩니다.

무세포 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 새로운 용해 감염의 확립 및 정량화

학습하세요 KSHV 감염 인간 세포에서 형광 시투 혼성화(FISH)와 면역형광(IF)을 이용한 바이러스 RNA 정량 분석 방법을. 이 기술은 숙주-바이러스 상호작용 연구에 필수적입니다.

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

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