KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

프로토콜은 특히 헤르페스 바이러스와 관련하여 숙주 세포의 맥락에서 바이러스 유전자 제품의 시간적 조절에 대한 정량적 통찰력을 얻는 데 도움이됩니다. 이 기술은 호스트와 바이러스성 RNA 및 단백질 둘 다에 관련있는 연구 질문을 해결하는 것을 도울 수 있습니다. 더욱이, 이 기술은 동시 생화학적 인 분석을 호환합니다.

8개의 챔버 슬라이드에 세포를 부착하려면, 멸균의 각 챔버에 내재된 세포 현탁액 200마이크로리터를 적용하고, 8개의 챔버 슬라이드를 바르고, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 12-24시간 동안 종자 성장을 허용한다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼 나탄과 부착되지 않은 세포를 흡인하고, 즉시 얼음에 PBS에서 미리 냉각 된 4 % 포름 알데히드로 세포를 수정, 30 분. 고정의 끝에서, 세척 당 섭씨 4도 PBS의 200 마이크로 리터에 3, 5 분 세척으로 세포를 씻어.

마지막 세척 후, 고정 된 세포를 200 마이크로 리터의 PBS에서 0.5 % 트리톤-X로 얼음에 10 분 동안 투과화하십시오. 투과화의 끝에서, 조심스럽게 슬라이드를 균열하지 않고 챔버를 제거하고, 미리 차가운 PBS로 세포를 헹구십시오. PBS에서 30분 동안 PBS에서 4%BSA를 미리 냉각한 헹구는 세포를 4도에서 30분 동안 차단한 다음, PBS에서 0.1%BSA에 대한 적절한 다각성 1차 항체를 4°C에서 4도에서 배양한다.

인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS로 세포를 세 번 세척하고 적절한 이차 항체로 세포를 배양하고 4°C에서 1시간 동안 항체를 검출하는 FISH와 호환되는 플루오라포릭과 결합된 적절한 이차 항체로 세포를 배양한다. 시연된 바와 같이 세 가지 PBS 세차재 후, PBS에서 4%포름알데히드로 샘플을 다시 수정하여 10-15분 동안 두 번째 permeablization 전에 수정합니다. 그런 다음 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮어 형광 신호를 보존하고 광표백을 방지합니다.

그리고 혼성화 용액45 마이크로 리터를 적용하기 전에 2 배 식염수 나트륨 구연산나트륨으로 세포를 세척하십시오. 가습 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 후, 10 마이크로 리터에 데우음 볼륨을 가지고 관심의 안티 센스 올리고 뉴클레오티드에 증류수를 추가합니다. 슬라이드 당 신선한 혼성화 용액의 35 마이크로 리터를 추가하기 전에 5 분 동안 섭씨 95도에서 올리고 뉴클레오티드를 해독합니다.

그런 다음 호일로 보호되는 섭씨 37도에서 가습 챔버에서 10-24 시간에서 샘플을 배양합니다. 다음 날, 2, 10 분으로 세포를 씻으시면 됩니다. 식염수 나트륨 은 실온에서 세척하고, 섭씨 25도에서 10 분 동안 1 배 식염수 나트륨 구연산나트륨으로 1 회 세척합니다.

마지막 세척 후, PBS에서 미리 냉각 된 4 % 포름 알데히드로 세포를 수정하고 얼음에 10-15 분 동안, 신선한 PBS와 세 세척. 다음으로, 입증된 바와 같이 시료를 투약화하고, 이산화방지FTC를 배양하고 PBS에서 0.1%BSA를 사전 냉각하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 구비합니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 PBX에서 슬라이드를 세 번 세척하고 PBS에서 미리 냉각된 4%파라포름알데히드로 샘플을 섭씨 4도에서 10-15분 동안 수정합니다.

PBS에서 세 번의 세차재 후, DAPI의 밀리리터 당 0.4 마이크로그램으로 핵을 라벨을 붙이고 PBS에서 0.5%트리톤-X를 얼음으로 15분 간 미리 냉각한 다음 PBS에서 세 번의 최종 세차재가 뒤따릅니다. 형광 구슬이 있는 슬라이드를 실험적으로 관련이 있고 적절한 마운팅 매체로 마운트합니다. 멸균 물티슈로 과도한 장착 매체를 제거한 후, 투명 매니큐어의 여러 코팅으로 각 슬라이드에 하나의 커버슬립을 밀봉하고 형광 현미경을 사용하여 실험의 성공적인 실행을 확인합니다.

그런 다음 이미지는 공초점 현미경으로 촬영하여 장착 후 1시간에서 1주일 이내에 630배 배율로 샘플의 이미지를 수집할 수 있습니다. 이러한 대표적인 FISH 및 면역 형광 결과는 반정성이며, 이러한 실험이 슬라이드 제제에 형광 구슬을 포함하지 않았기 때문에 상이한 형광 얼룩의 강도 사이의 비교보다는 올리고뉴클레오티드 국소화에 대한 통찰력을 제공한다. 이러한 실험에서, 세포질 및 핵 영역 및 그들의 비율은 잠복및 lytic KSHV 감염한 세포를 위해 달랐습니다.

이 그림에서 설명한 바와 같이, 영역은 뉴클레오사이클라즘 비에서 조절된다. KSHV DNA 복제가 리틱 단계에서 억제되면 KSHV 올리고뉴클레오티드 전사체의 초기 리틱 단백질이 주로 세포질 국소화로 전환됩니다. KSHV 폴리아데니화 RNA는 바이러스 DNA 복제의 억제에도 불구하고 특정 핵 부위에 국소화된다.

슬라이드에서 챔버를 제거 할 때 도구에 접착제 잔류물이 거의 없다는 것을 주의하고 에탄올을 사용하여 세포를 퍼미블화하고 접착제를 약화시십시오. QPCR, 웨스턴 블롯 및 고처리량 시퀀싱과 같은 생화학 적 분석체는 마이크로그래프로부터 수집된 정량적 데이터를 보강하기 위해 나란히 수행될 수 있다.