Name: 원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 배우세요 원뿔형 플레이트 점도계를 사용하여 용액 상태의 인간 혈소판에 균일한 전단 응력을 적용하는 방법을. 이 기술은 혈소판 활성화 마커의 상향 조절을 연구하고 기계적 자극에 대한 세포 반응을 조사하는 데 유용합니다.

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이 연구에 관련 된 작업은 국가 보건 연구소 (NIH) 국립 심장, 폐 및 혈액 학회 보조금 HL082808, HL123984 (R.L.) 및 F31HL134241 (M.E.Q.)에 의해 부분적으로 지원 되었습니다. 자금 조달은 또한 NIH 국립 연구소 일반 의료 과학 교부 금 T32GM008367 (M.E.Q.)에 의해 제공; 애 틀 란 타 및에 모리 대학교 소아과 유 세포 분석 코어의 아동 건강 관리에서 파일럿 보조금을 지급 합니다. 저자는 6B4 항 체를 공유 하는 Dr. Hans Deckmyn과 기술 지원을 위한 Emory 아 이들의 소아과 연구 센터 유 세포 분석 코어를 감사 하 고 싶습니다.

본 원에 기재 된 기증자 유래 인간 혈소판을 사용 하는 모든 방법은에 모리 대학교/아 틀 란 타의 어린이 건강 관리 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 혈액 채취 및 혈소판 분리
<ol><li>실험 당일에에 동의 건강 한 성인 기증자를 통해 인간의 혈액을 그립니다 3.8% 트리 구 연산 나트륨. 혈액의 1 개의 4.5 mL 관은 혈소판이 1 μ l 당 250 x 10에 가까운 기증자에 있는 20-25 조건에 대 한 충분 한 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 산출 하기 위하여 충분 합니다. 참고: 좁은 게이지 바늘 (21G 보다 작음)을 통해 혈액을 채취 하지 마십시오.</li>
	<li>22 ° c에서의 원심 분리를 통해 PRP를 준비 하 고, 긴 브레이크로 12 분 동안 140 x g . 이것은 두 개의 별개의 층으로 이어질 것입니다, 아래에 적혈구와 상단에 밝은 색깔의 PRP.</li>
	<li>45 ° 각도로 절단 된 피 펫 팁을 통해 신중한 파이 펫 팅을 통해 PRP의 위, 흐린, 노란 층을 분리 하 고 완전 한 혈 수 (CBC)를 통해 혈소판 수를 얻습니다.</li>
	<li>필요한 경우에는 파이프에서 혈소판을 세척 하 고, 2.9 0.34 134 Tyrode의 프로 스타 글란 딘 E1 (PGE1)과 소생의 존재 하에 완충 식 염 분 (150 mM의 염화 나트륨, 20mm 파이프)에,1mmmgcl 2, 5mm 포도 당,12mm 3, 20 MM 헵 스, pH 7.35) 5 mm 글루코스를 사용 하는 경우, 1.5 단계로 진행 합니다. 다음 단계는 간단한 세척을 설명 합니다.<ol>
<li>PRP 볼륨을 10 mL의 파이프 완충 식 염 수로 조정 하 고 0.6 μ m PGE1를 추가 합니다.</li>
		<li>1900 x g에서 8 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버리고 5 분 동안 Tyrode 및 글루코스 용액의 400 μ l에 혈소판 펠 렛을 둡니다.</li>
		<li>혈소판 펠 렛을 부드럽게 소생 시켜 30 분 동안 그대로 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈소판 계수를 풀링 된 인간 혈소판-불 쌍 한 혈장 (PPP)과 함께 μ l 당 10 ~ 250 x 103으로 조절 하 고 방해 받지 않는 또는 완만 한 회전 하에서 22 ° c에서 현 탁 액을 유지 한다.</li>
</ol>2. 리간드 및 균일 한 전단 처리
참고: 파이 펫 팅을 필요로 하는 섹션 2의 모든 단계는 어떤 전단도 도입 하지 않도록 천천히 이루어져야 합니다.
<ol><li>PRP 또는 세척 된 혈소판에 원하는 항 체 또는 리간드를 추가 하 고 피 펫 팁으로 위아래로 피 펫 팅 하 여 부드럽게 섞 습니다. 5-10 분 동안 실 온에서 그대로 두십시오. 동등한 양의 PPP 또는 Tyrode의 버퍼를 음수 컨트롤에 추가 합니다.</li>
	<li>콘 플레이트 점도 계의 전원을 켜고, 플레이트 온도를 22 ° c로 설정 하 고, 플레이트가이 온도에 도달 하 게 할 시간을 허용 합니다.</li>
	<li>처리 된 PRP 또는 세척 된 혈소판을 플레이트의 중앙에 직접 온도 조절 된 원추 판 점도 계에 피 펫 한다. 모든 샘플이 콘과 플레이트 사이에 접촉 지점에 침착 되 고 원뿔의 림의 바깥쪽이 아니라는 것을 확인 합니다.</li>
	<li>적절 한 속도와 지속 시간에 전단.<ol>
<li>점도 계 설명서에 표시 된 대로 또는 앞에서15,16으로 표시 된 대로 전단을 계산 합니다.</li>
		<li>뉴턴의 점도 법칙을 통해 점도 및 원하는 전단 응력에서 전단 속도를 결정 합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59704/59704eq1.jpg">; 플라즈마 점도는 1.5 ~ 1.6 센 포 이즈 (cP)17입니다. 예를 들어, 인간의 순환에 대 한 일반적인 전단 범위는 5-30 dyn/cm2 이 고 전단은 단일 자릿수 분 시간 척도에 적용 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플이 플레이트와 콘 모두와 접촉 하 게 유지 되도록 플레이트 약간 (~ 2mm)의 콘을 들어올려, 샘플 부피의 중심에서 5-10 μ l를 수집 하기 위해 겔 로딩 또는 다른 긴 피 펫 팁을 사용 한다.</li>
	<li>실 온에서 20 분 동안 원하는 마커로 전단 된 시료를 배양 합니다. 포스 파티 딜 세 린, β-갈 락 토즈 및 P-셀 렉 틴 (LactC2)을 0.08 μ m에서 C2 도메인에사용 하 고, 6.25 μ g/m l에서, 그리고 안티 피-셀 리 틴 항 체 (20 µ를 각각)에 노출 시켰다.</li>
	<li>희석 또는 냉장 보관 전에 RT에서 20 분 동안 2% 파라 포 름 알 데히드로 샘플을 고정 하 고, 3.1 단계까지 진행 하거나 4°c에서 12 시간 이상 동안 시료를 보관 하십시오.</li>
</ol>3. 유 세포 분석을 통한 표면 마커 및 가교의 검출
<ol><li>유 세포 분석기를 통해 샘플을 분석 하 고 각 조건에 대해 최소 2만 이벤트를 수집 합니다.</li>
	<li>각 형광 물질의 세기에 대 한 높이 값 또는 기하학적 평균 형광 강도 (MFI)를 사용 하는 형광체 마커의 정량 신호 강도.</li>
	<li>전단 처리 후에 혈소판 가교 결합을 검출 하는 것을 목표로 하는 경우, 이미징 가능한 유 세포 계와 수량자로 면적 및 종횡비 매개 변수로 샘플을 분석 합니다.<ol>
<li>면적 및/또는 종횡비의 히스토그램을 플로팅합니다.</li>
		<li>소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 차량이 대부분의 완전 원형 이벤트를 제외 하 고 게이트를 그리는 네거티브 컨트롤을 사용 하 여 (이 게이트는 일반적으로 종횡비 ~ 0.819에서 그려진,20)이 게이트의 내부 이벤트의 비율을 정량화. 종횡비가 낮은 이벤트는 가교 화 될 가능성이 더 높습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-voltage-gated+Ca2%2B+influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li>
<li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li>
<li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+Cell+Transduction%2C+Tuning%2C+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li>
<li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li>
<li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li>
<li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301(2018).</li>
<li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870(2016).</li>
<li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584(2016).</li>
<li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li>
<li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li>
<li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li>
<li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863(2016).</li>
<li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li>
<li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterhof%2C+N+%22Snapshots+of+hemodynamics%3A+an+aid+for+clinical+research+and+graduate+education%22">Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education</a>. , Springer Science, Business Media. (2010).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li>
<li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li>
<li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li>
<li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 원고에 설명 된 프로토콜은 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 층 류 전단 효과의 신속 하 고 다양 한 평가를 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 특정 대표적인 결과는 다이 성체 또는이가 리간드의 영향이 전단 흐름에 의해 영향을 받을 수 있는 방법을 강조 한다. 이 응용 분야 외에도 균일 한 전단 분석은 전단 의존적 효과를 관찰 하는 광범위 한 응용 분야를가지고 있습니다. 알려진 리간드-수용 체 쌍의 부재 하에서, 균일 한 전단 분석은 또한 특히 유 세포 분석 분석과 쌍을 이루는 경우 세포 형태 및 신호와 같은 요인에 대 한 전단의 영향을 검출할 수 있습니다. 그림 5b에 의해 부분적으로 언급 되는 균일 한 전단 분석은 이미징, 생화학 및 세포 기반을 포함 하 여이 프로토콜에 설명 된 표준 유 세포 측정 분석을 보완 하는 것 이외의 다양 한 검출 방법에 적합 합니다. 분석.
<strong class...

기계 수용 체는 압력 또는 기계적인 섭 동/변형과 같은 기계적인 자극에 반응 하는 단백질입니다. 일부 기계 수용 체의 경우, 이러한 기계적 섭 동을 감지 하는 것은 그들이 발현 되는 세포 유형의 기능에 명시 적 이다. 복용, 예를 들어, baroreceptor 뉴런의 스트레칭 수용 체; 이러한 기계 과민 이온 채널은 혈관 "스트레칭"1,2를 감지 하 여 혈압을 조절 합니다. 내이에서 머리카락 세포의 이온 채널은 음파3으로 인 한 기계적 변형을 감지 하 고 피부 낮은 임계 기계 수용 체 (ltmrs)는 촉각 정보4의 전달을 용이 하 게 합니다. 다른 경우에, 기계 수용 체는 접착 또는 성장의 설치를 위해 세포에 중요 한 정보를 제공 합니다. 세포는 그들의 국부 환경의 강성을 감지할 수 있고, 성장 또는5확산을 지시 하는 액 틴 세포 골격 및 인 테 그린을 통해 수축 힘에 의존할 수 있다.
세포 또는 조직 기반 모델에서 수용 체-리간드 상호 작용을 연구 할 때, 온도, pH, 리간드 농도, 음조, 막 전위 및 기타 여러 매개 변수를 변경 하는 효과를 신속 하 고 정확 하 게 보고할 수 있는 일반적인 분석 법이 존재 합니다. 생체 내에서 다를 수 있습니다. 그러나,이 같은 분석은 수용 체 활성화에 기계적인 힘의 기여를 검출 하는 관해서 짧은 떨어질 수 있습니다. 세포가 그들의 미세 환경을 감지 하 고, 음파를 감지 하거나, 스트레칭에 반응 하 든, 앞서 언급 한 기계 수 용기가 공통적으로가지고 있는 것은 리간드, 수용 체 또는 둘 모두가 상호 작용에 참여 한다는 것입니다. 표면. 수용 체 상호 작용에 기계적인 힘의 효력을 시험 하기 위하여 개발 된 분석은 수시로이 패러다임을 반영 합니다. 미세 유체 및 유량 챔버는 세포 및 수용 체7,8에 대 한 전단 흐름의 효과를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이러한 유형의 실험은 확립 된 흐름 속도를 통해 전단 속도를 미세 조정할 수 있는 이점이 있습니다. 다른 기술은 형광 분자 프로브를 사용 하 여 리간드가 풍부한 표면에 세포가가 해지는 힘을 감지 하 고 상호 작용9,10에 관련 된 힘의 크기와 방향을 정확 하 게 판독 합니다.
하나 또는 두 파트너가 표면에 고정 되는 경우 발생 하는 기계 감각 외에도 전단 응력은 용액의 단백질과 세포에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 수시로 순환에서 지속적으로 혈액 세포/단백질에서 관찰 되 고, 일반적으로 표면 앵커 링 되는 기계 수용 체의 활성화를 통해 나타날 수 있다11, 또는 아래 폐색 되는 대상 시퀀스의 노출을 통해 정적 조건12. 그러나 상대적으로 적은 기법은 용액 내 입자에 대 한 전단 력의 영향을 분석 합니다. 일부 인-솔루션 접근법은 다양 한 속도와 기간으로 유체 현 탁 액의 볼 텍 싱 세포를 통해 전단을 도입 하지만, 이러한 접근법은 생성 된 전단 응력의 매우 정밀한 결정을 허용 하지 않을 수 있다. 회전 점도 계 유체에 특정 전단 력을 적용 하 여 점도를 측정 합니다. 본 명세서에서는 용액 중의 세포 또는 세포 단편에 대 한 특정 층 류 전단 율의 효과를 결정 하기 위한 적용 방법을 설명 한다.
혈소판 표면에 가장 높게 발현 된 단백질 중 하나는 당단백질 (GP) Ib-IX 복합체 이다. GPIb-IX는 본 플라즈마 단백질에 대 한 1 차 수용 체 폰 빌 레 브란트 팩터 (VWF) 이다. 함께,이 수용 체-리간드 쌍은 전단 응력 (13)에 대 한 혈소판 반응의 기초로 서 오랫동안 인식 되 고 있다. 혈관 손상이 발생 하는 경우, VWF는 부 내 피 매트릭스14의 노출 된 콜라겐에 결합 하 여 Vwf-GPIB-IX 상호작용을 통해 부상 부위를 혈소판으로 모집 합니다. VWF는 GPIbα 서브 유닛에서의 결합 부 위에 참여 하 여 생리 적 전단 응력 하에서 GPIb-IX는 멤브레인 근 위부 (MSD) 도메인의 전개를 유도 하 고이는 GPIb-IX15를 차례로 활성화 시킨다. 최근의 연구에서, 우리는 많은 면역 혈소판 감소 증 (ITP) 환자에서 생성 된 것과 같은 GPIbα에 대 한 항 체가 또한 전단 응력11하에서 MSD를 통해 서 발생 하는 혈소판 신호를 유도할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그러나 일반적인 순환 하에서 복합체를 고 정화 함으로써 전단 유도 된 GPIb-IX 활성화를 용이 하 게 하는 VWF와는 달리,이가 항 체는 GPIb-IX를 통해 혈소판을 가교 결합 하 고, 순환 하 여 MSD를 펼칠 수 있습니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 전단 하에서 표면 고 정화에 의해 활성화 되는 기계 수용 체는 용액에서 활성화 될 수 있다. 본 보고서에서는 용액에서의 수용 체 활성화에 대 한 특정 수준의 전단 응력의 영향을 검출 하기 위해 점도 계 기반 균일 전단 분석을 활용 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td><td>BioLegend</td><td>304910</td><td></td></tr><tr><td>Brookfield Cap 2000+ 점도계</td> Brookfield-FITC-conjugated <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1141</td><td></td></tr><tr><td>Pooled Normal Human Plasma</td><td>Precision Biologic</td><td>CCN-10</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td><td>BD</td><td>369714</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer 혈액 채취 세트, 21G x &frac34; " 니들</td><td>BD</td><td>367287</td><td></td></tr></tbody></table>

원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

많은 생물학 세포/조직은 기계 수용 체를 통해 그들의 현지 환경의 기계적인 속성을, 압력 또는 기계적인 섭 동 같은 힘에 반응할 수 있는 단백질을 감지 합니다. 기계 수용 체는 자극을 감지 하 고 다양 한 메커니즘을 통해 신호를 전송 합니다. 기계 수용 체에 대 한 가장 일반적인 역할 중 일부는 신경 반응에, 터치와 통증 같은, 또는 균형 및 청각에서 기능 하는 머리 세포. 기계 감각은 또한 정기적으로 혈관 내 피 세포와 같은 전단 응력에 노출 되는 세포 종류에 대 한 중요 한, 어떤 라인 혈액 혈관, 또는 정상적인 순환에 전단을 경험 하는 혈액 세포. 점도 계는 유체의 점도를 감지 하는 장치입니다. 회전 점도 계는 또한 유체에 공지 된 전단 력을 적용 하기 위해 사용 될 수 있다. 유체에 균일 한 전단을 소개 하는이 계기의 능력은 혈액과 플라스마를 포함 하 여 많은 생물학 액체를 연구 하기 위하여 착취 되었습니다. 점도는 또한 용액 내의 세포에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍에 전단의 영향을 시험 하기 위해 사용 될 수 있다. 여기에서, 우리는 콘 플레이트 점도 혈소판 기계 감각 수용 체 복잡 한 GPIb에 대하여 항 체로 처리 한 혈소판에 전단 응력의 내 인 성 수준의 효력을 시험 하기 위하여 이용 합니다.

도 1 은 상기 혈관 벽에 앵커 되었을 때 전단 의존적 수용 체 활성화를 설명 하기 위해 처음 도입 된 GPIB-IX 활성화의 트리거 모델을 개략적으로 설명 하 고, 또한 다가 리간드에 의해 가교 된 혈소판의 활성화를 지원할 수 있다. 도 2 는 GPIB-IX (6B4 및 11A8)의 N-말단 도메인을 표적화 하 고 전단 및 정적 조건 하에서 하나의 대조 항 체 (정상 IgG)를 대상으로 하는 2 개의 항 체에 의해 처리 된 인간 혈소판 활성화의 판독을 보여준다. 도 3에서, 혈소판은 6b4 및 비 결합 력이 지나치게 낮은 항 체로 처리 하 여 GPIB-IX 활성화를 AK2. 그림 4 에는 시간 코스가 나와 있습니다. 혈소판 활성화의 마커는 11A8 또는 AK2로 전단 처리 시 진보적인 시점에서 프로브 및 검출 되었다...

우리는 원뿔 판 점도를 사용 하 여 혈소판 표면 수용 체에 균일 한 전단을 적용 하는 인 솔루션 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 다른 세포 유형 및 세포 단편에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍을 표적으로 할 필요가 없는 더 광범위 하 게 사용 될 수 있다.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

이 프로토콜을 사용하면 전단이 용액의 세포에서 작동하는 방식에 대한 다양한 질문에 답할 수 있으며 전단 지속 시간과 크기에 대한 상당한 제어를 제공합니다. 고정된 세포에 대한 전단의 효과를 감지하는 다른 기술과 달리 이 기술은 용액의 세포에 전단을 적용할 수 있게 해주며 다운스트림 신호 검출 방법의 스펙트럼에 빌려줍니다. 동의에서 말초 혈액을 얻은 후, 3.8%의 트리나트륨 구연산의 4.5 밀리리터 튜브에서 건강한 성인 기증자, 혈소판이 풍부한 혈장을 얻기 위해 혈액 원심분리기, 45도 각도로 자른 파이펫 팁을 사용하여 결과 상단, 흐린, 노란색 혈소판이 풍부한 플라즈마 층을 조심스럽게 제거한다.완전한 혈액 수를 통해 혈소판 수를 얻고, 혈소판 수를 약 2.5 배 10으로 조정하여 마이크로리터 당 다섯 번째 혈소판당 제5 혈소판으로 풀이 된 인간 혈소판이 없는 플라즈마를 갖는다. 그런 다음 서스펜션을 섭씨 22도에 부드럽게 회전시 놓습니다. 리간드 처리를 위해 혈소판이 풍부한 혈장에 관심 있는 항체 또는 리간드를 천천히 추가하고 혈소판을 부드럽게 섞습니다.인큐베이션 중에 원뿔판 비스코마를 켜고 플레이트 온도를 섭씨 22도로 설정합니다. 5-10분 후, 처리된 혈소판이 풍부한 플라즈마를 플레이트 중앙에 직접 온도 조절 된 콘 플레이트 비스코머에 전달하여 모든 샘플이 접촉 지점에서 콘과 플레이트 사이에 증착되는 것을 주의하십시오. 샘플에 전단을 적용하려면 비스혜성 매뉴얼에 따라 전단을 계산하고 적절한 속도와 지속 시간으로 샘플에 전단을 적용합니다.응용 프로그램의 끝에서, 샘플이 플레이트와 콘 둘 다와 접촉유지되도록 플레이트에서 약 2밀리미터 원뿔을 들어 올리고, 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 샘플 부피의 중심에서 5~10 마이크로리터를 수집한다. 그런 다음 실온에서 20 분 동안 관심있는 표면 마커에 대한 항체로 전단 샘플을 배양하고 실온에서 20 분 동안 2 %의 파라 포름알데히드로 샘플을 수정합니다. 유동 세포측정에 의해 샘플을 분석하려면 각 조건에 대해 적어도 20, 000개의 이벤트를 수집하고 각 형광마커의 신호 강도를 정량화하고 각 형광의 강도에 대한 높이 값을 이용하여 정량화한다.그런 다음 소 세럼 알부민 또는 차량으로 음의 제어를 사용하여 부정적인 배경 형광 이벤트를 제외하고 게이트를 그리고 모든 실험 조건에 대한 게이트 내부의 이벤트의 백분율을 정량화합니다. 전단 력 응용 프로그램에 대한 응답으로 혈소판 활성화 마커 발현은 시간에 따라 조절되지 않습니다. 여기서, 혈당 단백질 1b-IX의 N단말 도메인을 표적으로 하는 2개의 항체의 존재하에 인간 혈소판 활성화의 대표적인 판독및 정전기 조건 하에서 하나의 대조항체가 도시된다.3개의 활성화 마커 의 발현은 정전기 조건 또는 제어 항체의 존재에 비해 전단력 및 표적 항체의 존재에서 현저하게 증가하였다. 특히, 혈당 단백질 1b-IX 활성화를 유발하기에너무 낮은 결합력으로 항체를 사용하여 처리하면 정적 또는 전단 힘 조건 하에서 혈소판 활성화 마커 업조절을 유발하지 않습니다. 또한, 당단백질 1b-IX에 대하여 항체를 포함하는 면역 혈전 세포성페니아 환자로부터 혈장은 당단백질 1b-IX 표적화 항체가 없는 환자로부터 혈장과 대조적으로 전단 의존반응을 유발한다.유량 분석 외에도 전단에 노출된 세포는 단백질 레벨의 변화를 결정하기 위해 서부 얼룩, ELISA 및 질량 스펙 분석을 위해 용액을 제거할 수 있습니다. 언제나처럼, 혈액 이나 인간의 샘플을 사용 하는 경우, 적절 한 보호 장비를 착용 하 고 실험실 안전 및 혈액 태어난 병원 체 지침을 따라야 합니다.

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연구

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Biology

생물학

혈소판 유착 계단식는 전단 흐름의 존재에서 일어나는, 요인은 종래의 (정적) 잘 철판 assays에서 차지하는 없습니다. 이 문서의 생리 전단 흐름 조건을 에뮬레이트하는 microfluidic 잘 플레이트 형식을 이용한 혈소판 - 집계 분석에 대한 보고서.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

이 비디오는 전단 응력이 혈소판에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. 항체 처리는 기계수용체 복합체의 해리 및 구조적 변화를 유도하여 혈소판을 활성화하고 표면의 마커를 발현합니다. 이러한 마커는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 관찰됩니다.

기계감각수용체에 대한 항체로 처리된 혈소판에 대한 전단 응력의 영향

우리는 탁도 의해 작용제 - 유도 된 혈소판 응집을 측정 하였다 인간 혈액으로부터 세척 혈소판 분리하는 간단한 방법을 설명한다. 예를 들어 우리는 Pannexin1 채널 억제제 브릴리언트 블루 FCF와 미리 인큐베이션 한 후 콜라겐 인간 혈소판 응집 반응을 연구하는데이 방법을 적용한다.

콜라겐 - 유도 된 응집에 Pannexin1 억제제의 효과 브릴리언트 블루 FCF : 탁도는 인간 혈소판에 씻어

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

이 프로토콜은 시험관 내에서 암성 및 비암성 세포주의 기계적 특성의 정량화를 설명합니다. 암세포와 정상 세포의 역학에서 보존된 차이는 예후와 진단에 영향을 미칠 수 있는 바이오마커로 작용할 수 있습니다.

단세포 물질 특성 측정을 위한 전단 분석 프로토콜

프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

혈류 하의 혈소판 기능을 평가하고 시뮬레이션된 지혈 소생술을 외상 및 수혈 의학에 응용하는 미세유체 장치를 사용하여 모델링할 수 있습니다.

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

혈소판 대사는 특히 출혈 및 혈전성 질환에서 혈소판 과잉 및 저활동의 역할과 관련이 있기 때문에 관심이 있습니다. 혈장에서 혈소판을 분리하는 것은 일부 대사 분석에 필요합니다. 여기에 제시된 것은 세척된 혈소판에서 세포 내 대사 산물을 분리하는 방법입니다.

정량적 대사 플럭스 연구를 위한 세척된 인간 혈소판의 준비

혈소판에 대한 다색 유세포 분석은 고전적인 혈소판 하위 집단 내에서 휴지 혈소판, 응집성 혈소판, 단백질 응고제 및 자가사멸성 혈소판과 같은 새로운 혈소판 하위 유형을 식별할 수 있습니다. 이를 통해 다양한 혈소판 작용제에 의해 유도된 다양한 하위 집단 패턴을 비교할 수 있습니다. 여기에서는 multi-color 유세포 분석 패널을 설정하는 절차를 자세히 설명합니다.

Multi-color 유세포분석법을 통한 혈소판 하위 모집단 분석

본 프로토콜은 괴사, 세포사멸 및 혈소판 활성화의 중복된 특징을 나타내는 procoagulant 혈소판을 분석하는 데 필요한 포괄적인 절차를 제공합니다.

괴사, 세포사멸 및 혈소판 활성화의 특징을 보이는 Procoagulant Platelets의 포괄적인 분석

배우세요 원뿔형 플레이트 점도계를 사용하여 용액 상태의 인간 혈소판에 균일한 전단 응력을 적용하는 방법을. 이 기술은 혈소판 활성화 마커의 상향 조절을 연구하고 기계적 자극에 대한 세포 반응을 조사하는 데 유용합니다.

원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

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