Name: 부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 학습하세요 쥐 피부 표피와 진피를 열립신으로 분리하여 부위별 염증성 mRNA와 단백질을 검출하는 방법을. 4°C에서 분리하여 RNA와 단백질 무결성을 유지하고 피부 염증 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구를 위한 자금조달은 건강 NIH-AR047410 (KEM)의 국가 학회에 의해 제공되었습니다

이 프로토콜은 오클라호마 주립 대학 건강 과학 IACUC (#2016-03)의 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 카라게난 유발 염증 (C-II)
<ol><li>남성 및/또는 여성 스프라그 Dawley 쥐 (200-250 g; 8-9 주 이전) 이소플루란 (또는 주 사용 가능한 마취).</li>
<li>각막을 만지고 왼쪽 뒷발을 가볍게 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물이 적절하게 마취되면 각막이나 발 반응이 관찰되지 않습니다.</li>
<li>피하로 오른쪽 글래브로우스, 힌드 발 100 μL 1% (w/v) 인산완충식식염(PBS)20에서희석된 λ-carrageenan을 피하한다.<ol><li>이 보고서에서 이소플루란이 없는 순진한 쥐와 같은 적절한 컨트롤이 사용되는지 확인하십시오. 예비 연구에 따르면 이소플루란의 유무에 관계없이 순진한 쥐는 표피 IL-6 및 NGF의 기저 식을 가지고 있음을 나타냅니다. 참고: 순진한 쥐는 피하 식염수 또는 PBS가 국소 염증을 유발하기 때문에 염증 연구를 위한 바람직한대조군이다 23,37.</li></ol>
</li>
<li>카라게난의 효과를 보장하기 위해 C-II 쥐의 부종을 평가한다(도 1)20. 후드 발 중족골 두께를 캘리퍼로 측정하여 부종의 양을 결정합니다.</li>
<li>6-12h에서, CO2 (또는 주 사용 가능한 마취 과다 복용)로 쥐를 안락사시키고 날카로운 메스로 글래브로스 뒷발 피부 1mm x 2mm 조각을 잘라냅니다. 털이 많은 피부를 사용하는 경우 1mm x 2mm 의 피부를 절단하기 전에 면도하십시오. 참고: 특정 연구에 따라 적절한 시간점을 선택해야 합니다.</li>
<li>미세 절개 집게를 사용하여, 얼음에 미세 원심 분리기 튜브에 차가운 덜벡코의 수정 독수리 매체 (DMEM)의 1 mL로 피부를 전송하고 15-60 분 동안 차가운 유지.</li></ol>2. 표피와 진피의 열리신 분리
<ol><li>열리신을 준비하고 활성화합니다.<ol>
<li>pH = 8 (농도 500 μg /mL)에서 PBS의 10 mL에 지오바실러스 스티어 더모필러스 5 mg을 추가하여 열량분해용액을 준비합니다.</li>
<li>1.11g을 증류된 H2O의10mL에 첨가하여 염화칼슘(CaCl2 무수)의 1M 용액을 준비한다.</li>
<li>열분해를 방지하기 위해 10 μL의 염화물 칼슘을 열분해 용액 10mL에 추가하십시오. 염화칼슘 최종 농도는 1mM입니다.</li>
<li>알리쿼트 1 mL의 활성 열리신10개의 우물로 얼음위에 24개의 잘 된 세포 배양 플레이트.</li>
</ol></li>
<li>열분해 효소 소화를 사용하여 표피를 진피와 분리하십시오.<ol>
<li>미세 절 집게를 사용하여, 활성화 된 열량의 각 우물에 하나의 피부 샘플을 전송합니다. 열리 신 용액에 피부에 담그지 않도록 하십시오.</li>
<li>부드럽게 우물의 측면에 피부를 탭하여 모립용액에 떠있는 집게에서 피부 샘플을 방출하는 데 도움이됩니다.</li>
<li>지층 각질(외부 표피)을 위로 올려 놓고 진피를 아래로 향하게 하여 피부를 열분해액에 넣습니다. 진피가 아래로 향하거나 효과적인 분리가 일어나지 않는 것이 중요합니다. 참고: 열량 분권에 대한 시간 의 양은 최종 사용자가 경험적으로 결정해야 합니다. 글래스브로스, 스프라그 Dawley 쥐의 뒷발 피부 (200-250 g; 8-9 주 이전)는 종종 분리를 위해 2.0-2.5 h가 필요합니다. 인큐베이션 시간은 종과 나이에 따라 달라질 것으로 예상됩니다.</li>
<li>열량에 적절한 잠복 시간 후, 마이크로 절개 집게를 사용하여 1 개의 피부 샘플을 7-8 mL의 감기 (4 °C) DMEM을 가진 6 웰 세포 배양 판의 우물로 옮춥니다. 이를 통해 진피에서 표피를 분리할 수 있는 더 많은 공간을 확보할 수 있습니다.</li>
<li>DMEM에 피부를 담그고 있습니다.</li>
<li>국경에서 거의 반투명 표피가 관찰될 때까지 피부 둘레의 집게로 표피를 부드럽게 브러시합니다. 이 것을 달성할 수 없는 경우에, 또 다른 15-30 분 동안 열리 신 용액에 피부 견본을 반환합니다.</li>
<li>표피가 진피에서 눈에 띄게 분리되면 미세 절 집게로 표피와 진피를 조심스럽게 잡고 진피에서 표피를 매우 천천히 당깁니다.</li>
<li>격리된 표피의 투명도를 평가하고 광학적으로 일관되지 않도록 하십시오. 쥐 표피의 1mm x 2mm 샘플의 예를 보려면 그림 2를 참조하십시오. 투명도에 변화가 있는 경우 적절한 분리가 발생하지 않았습니다.</li>
</ol></li>
<li>표피와 진피의 분리 된 조각에서 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA)을 사용하여 열리 신을 비활성화합니다. 주의: 표피와 진피에 남아 있는 열량은 여전히 활성화되어 있으며 비활성화되지 않으면 층을 손상시킬 수 있습니다.<ol>
<li>0.5 M EDTA 스톡 솔루션을 준비합니다. 이렇게 하려면 0.93 g EDTA를 5mL의 이중 증류수에 천천히 넣습니다. 수산화 나트륨이 지울 때까지 용액에 추가합니다. 용액의 pH가 ~8.0인지 확인합니다.</li>
<li>DMEM에서 5mM EDTA 솔루션을 만드세요. DMEM의 25mL에 0.5 M EDTA 스톡 솔루션0.25mL를 추가합니다.</li>
<li>분리된 표피와 진피를 5mM EDTA/DMEM 용액에 4°C에 30분 동안 배치하여 열분해진의 활성을 비활성화합니다.</li>
</ol></li>
<li>팅크토리술8, 9,10으로표피를 평가한다.<ol>
<li>표피의 일부를 10% 중립 포름알린, 4% 파라포름알데히드 또는 0.25% 파라포름알데히드에 0.8% 피크산 용액으로 실온(RT)에서 1시간 동안 반으로 수정한다.</li>
<li>고정 표피를 PBS에 10% 자당에 배치하여 RT에서 1시간 동안 교반합니다.</li>
<li>단면화를 위해 조직 포함 매트릭스에 표피를 동결. 젤라틴 코팅 유리 현미경 슬라이드에 저온 및 해동 마운트 섹션을 사용하여 14 μm 단면을 잘라.</li>
<li>90 s에 대 한 toluidine 블루 (TB; 10% 염화 나트륨에서 10% TB)의 작업 용액으로 슬라이드 워머와 얼룩에 건조 섹션. 수성 장착 매체로 커버립을 포지팅합니다.</li>
<li>50x-250x에서 밝은 필드 현미경 검사법을 가진 표피를 관찰하십시오. 참고 : 적절한 분리가 발생한 경우, 표피는 진피에서 깨끗하게 분할되고 다섯 층이 검출됩니다 : 층 배세, 지층 스피노섬, 지층 과립, 지층 루시덤 및 지층 각막. 분리된 쥐 피부 표피의 예는 도 3에서볼 수 있다.</li>
</ol></li></ol>3. 단백질 추출 및 서부 얼룩 분석
<ol><li>이전에 게시된프로토콜(21)을사용하여 분리된 조직 샘플에서 서부 블로팅을 수행한다.</li>
<li>용해 완충제의 50 μL에서 표피를 균질화 (25mM Tris HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 1 % 트리톤 X-100) 인산염 및 프로테아제 억제제 칵테일을 함유.</li>
<li>원심분리기 는 4°C에서 15분 동안 최대 속도로 시료를 측정하고 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도에 대한 상체를 평가한다.</li>
<li>SDS 젤에 단백질(30 μg)의 동등한 농도를 적재하고, 전기전도를 수행한 다음 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮긴다.</li>
<li>2h용 5% 우유로 막막을 차단하고 1차 항체(마우스 안티NGF, E12, 1:1000)에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
<li>PBS로 3배 를 10분 동안 세척하고, 라벨이 부착된 이차 항체(예: 알칼리성 인스파타제 라벨이 부착된 토끼 안티마우스 IgG)로 인큐베이션을 한다.</li>
<li>스캐닝 시스템을 사용하여 서부 블롯 신호(예: ECF 기판 및 이미징 플랫폼)를 평가합니다.</li></ol>4. 면역 화학
<ol><li>최적의 면역 반응성 고정에 조직 샘플을 배치 : 0.96 % (w / v) 피릭 산과 0.2 % (w / v) 포름 알데히드 0.1 M 나트륨 인산염 완충, pH = 7.321,22,23 RT에서 4 h. RT에서 하룻밤 사이에 PBS에서 10 % 자당으로 전송.</li>
<li>조직섹션(21,22,23)에표준 면역 조직 화학을 수행한다.</li>
<li>동물의 표피를 포함 매트릭스의 단일 냉동 블록에 포함하고 극저온에 10-30 μm 섹션을 잘라. 젤라틴 코팅, 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트하고 2 시간 동안 37 ° C에서 건조.</li>
<li>PBS에서 3, 10분 헹구고 1차 항세라에서 24-96h의 배양을 위해 섹션을 세척하고, [예를 들어, 마우스 안티NGF(E12), 1:2000]과 토끼 항단백질 유전자 생성물 9.9(PGP 9.5, 1:2000)는 PBS에서 0.3% (w/v) 트리톤 X-100(PBS-T) PBS-T0.5% 소세루앨범(BSA) 및 0.5%의 폴리비닐(PVP)을 함유하고 있다.</li>
<li>1차 항세럼 인큐베이션 후, PBS에서 10분 동안 3회 섹션을 헹구고, 알렉사 플루어 488 당나귀 안티래빗 IgG(1:1000)와 알렉사 플루어 555 당나귀 항마우스 IgG(1:1000)의 RT에서 1h를 PBS에서 3회 배양한다.</li>
<li>10분 동안 PBS에서 세 번 헹구고 면역 형광의 변색을 지연시키는 비 퇴색 마운팅 배지가 있는 부착 커버립을 부착합니다.</li></ol>5. RNA 절연 및 cDNA 합성
<ol><li>피부샘플(21)에서표준 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행한다. 페놀, 구아니딘 이소티오카네이트 용액을 사용하여 총 RNA를 분리한다.</li>
<li>몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사에 의해 보완적인 DNA 합성을 수행하십시오.</li>
<li>NGF 및 IL-6 증폭에 대해 다음 프라이머 시퀀스를 사용합니다. NGF (센스) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAAAAAACGGGG NGF (안티센스) – GTGAGTCCTGTTGAGAGATTGTACCATG IL-6 (센스) - GCAATTTGATTGTATGAACAGGATGC; IL-6 (안티센스) – GTAGAAAACGGAACTCCAAGACCAAGA가그</li>
<li>NGF와 IL-6 mRNA의 수준을 β-액틴 하우스키핑 유전자와 비교하십시오. β-액틴 (감각) - TGCGTGACATTAAAAGGTGTTATG β-액틴 (안티 센스) – 가ACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA</li>
<li>qRT-PCR 시스템을 사용하여 열 사이클러및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 사용하여 질적 RT-PCR로 평가합니다.</li></ol>

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연구 결과에 따르면, 2.5h에 4°C에서 염화칼슘 1m로 PBS에서 써모리신(0.5 mG/mL)을 사용하여 진피로부터 쥐 뒷발 글래브루스 피부의 표피를 쉽게 분리하였다고 판단했다. 조직학적 평가는 표피가 지하 막의 진피로부터 분리되었고 표피 레테 능선이 손상되지 않았다는 것을 나타냈다. 열량은 그람 양성(Geo)바실러스 열염기 용해성 분석기(24)에의해 생성된 세포 외 금속 loendopeptidase이다. 그 활동은 4 °C에서 안정적이지만10,24,25의넓은 범위에서 기능적입니다. 이 효소는 단백질 화학24,25에광범위하게 사용되어 왔지만, 몇몇 그룹은 표피 및/또는 진피 시트<s...

염증성 진피 및 표피1,2,3에서발견되는 세포 유형의 이질성으로 인해 피부로부터의 염증성 중식 및 신경영양인의 평가가 제한될 수 있다. 평가를 위해 세포 해리를 수행하기 위해 2층의 분리 또는 수행을 위한 여러 효소, 화학적, 열 또는 기계적 기술이 최근4개검토되고 있다. 산, 알칼리, 중성염 및 열은 표피를 진피로부터 빠르게 나눌 수 있지만 세포 및 세포 외 부종은 종종5,6에서발생합니다. 트립신, 췌장, 엘라스타제, 각질, 콜라게나아제, 프라나제, 디스파제 및 열량리신은 표피-진피 분리4,7에사용된 효소이다. 트립신 및 기타 광범위한 스케일 의 성기 분석 효소는 37-40 °C에서 활성화되지만 표피 층의 해리를 방지하기 위해 주의 깊게 모니터링해야합니다. 디스파스는 라미나 덴사에서 표피를 갈라놓지만, 감기4,8 또는 37°C4,9에서더 짧은 시간점에서 분리를 위해 24h가 필요하다. 이러한 모든 기술의 제한 적인 특징은 조직 형태학의 잠재적인 중단 및 mRNA와 단백질의 무결성의 손실.
mRNA와 단백질의 무결성을 유지하기 위해, 피부 분리 방법은 짧은 시간 동안 추위에서 수행되어야한다. 염증 연구를 위한 피부 분리 기술을 평가할 때, 써모리신은 추운 온도4에서진피로부터 표피를 분리하는 효과적인 효소이다. 열리신은 4°C에서 활성화되며, 라미나 루치다로부터 표피 이미데스모좀을 갈라지고, 표피를 1-3h4,8,10내의 진피로부터 분리한다. 이 보고서의 목표는 염증성 중재자 및 신경 영양 요인에 대한 mRNA 및 단백질 수준을 검출하기 위해 진피에서 염증이 있는 쥐 표피의 분리를 위한 열립혈증의 사용을 최적화하는 것입니다. 여러 예비 보고서는11,12,13,14,15를제시했다. 이 원고의 목적은 열분해신을 이용한 최적의 피부 분리 기법을 설명하고 염증의 1) 마커, 2) 인터류킨-6(IL-6) mRNA, 및 3) 신경 성장 인자(NGF) mRNA 및 단백질을 카라게난 유발 염증(C-II)16,17의표피에서 시연하는 것이다. 완전한 Freund의 보조 모델을 사용하여 예비 보고서는 NGF mRNA및 단백질 수준이 염증15도중 일찌기 증가한다는 것을 나타냅니다. 마우스에서, oxazolone의 국소 적용을 이용한 피부 민감화는 시투혼성화(36)에서사용하는 IL-6 mRNA에서 조기 상승을 일으킨다. IL-6과 NGF 는 모두 C-II18,19에서연루되었지만 C-II의 급성 단계 동안 표피로부터 특히 IL-6 또는 NGF에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 설명하는 보고는 없었습니다.
열리 신 기술은 저렴 하 고 수행 하기 간단. 더욱이, 진피로부터 표피의 열리신 분리는염증(15)의과정에서 염증 중과및 신경영양인의 mRNA, 서부 블롯 및 면역히스트토화학적 분석을 허용한다. 연구원은 쉽게 피부 염증의 전임상 및 임상 연구 모두에서이 기술을 사용할 수 있어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lambda;-carrageenan</td><td>Millipore Sigma</td><td>22049</td><td>카라기난의 피하 주사는 염증을 유발합니다</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107</td><td>RT-PCR 분석을 위해</td></tr> 염화<tr><td>칼슘(CaCl2), 무수</td><td>Millipore Sigma</td><td>499609</td><td>thermolysin</td></tr><tr><td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td><td>의 자가분해를 방지합니다.Millipore Sigma</td><td>C0612</td><td>톨루이딘 블루 염색 후 수성 장착 매체</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td>면역조직화학을 위한 2차 항체</td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>면역조직화학을 위한 2차 항체</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11966-025</td><td>조직 무결성을 유지하기 위해</td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산</td><td>Millipore Sigma</td><td>E6758</td><td>열 분해 반응을 중지합니다</td></tr><tr><td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td>보완 DNA 합성</td></tr><tr><td>마우스 안티 NGF 항체 (E-12)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365944</td><td>neurotrophin 면역조직화학</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td> 면역형광 <td>담금질 지연용</td></tr><tr><td>토끼 안티-PGP 9.5</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL7756AP</td><td>표피내 신경 염색용</td></tr><tr><td>SAS Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River</td><td>Strain Code 400</td><td>염증 연구에 사용되는 동물</td></tr><tr><td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1310TS</td><td>틴크토리얼 및 면역 조직화학을 위한 조직 임베딩 매트릭스</td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24811</td><td>RT-PCR 분석용</td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472908</td><td>RT-PCR 분석용</td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Millipore Sigma</td><td>T7902</td><td>Geobacillus stearothermophilus</td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Millipore Sigma</td><td>89640</td><td>명시야 현미경 검사용 tinctorial staining용</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>RTPCR용 총 RNA 추출용</td></tr></tbody></table>

부위별 염증성 mrna 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

사용이 간편하고 저렴한 기술은 피부 손상, 염증 및/또는 민감화 중에 염증 성 중재자 및 신경 영양증의 사이트 별 생산을 결정하는 데 필요합니다. 이 연구의 목적은 4°C에서 활성단백질인 써모리신을 사용하여 표피-진피 분리 프로토콜을 설명하는 것이다. 이 절차를 설명하기 위해, 스프라그 Dawley 쥐는 마취되고, 오른쪽 뒷발은 카라지난으로 주입됩니다. 주입 후 6 시간 및 12 시간, 염증과 순진한 쥐를 가진 쥐는 안락사되고, 뒷발, 글라브루스 피부는 차가운 덜벡코의 수정 된 독수리 매체에 배치됩니다. 표피는 염화칼슘을 가진 PBS에 있는 열분해에 의해 진피에서 지하 막에서 분리됩니다. 다음으로, 진피는 미세 절 집게에 의해 고정되고 표피가 부드럽게 조롱됩니다. 조직 섹션의 Toluidine 파란색 염색은 표피가 지하 막의 진피에서 깨끗하게 분리되어 있음을 보여줍니다. 모든 각질 세포 층은 그대로 유지되며, 진피 유두의 들여쓰기와 함께 표피 리트 능선이 명확하게 관찰됩니다. 질적 및 실시간 RT-PCR은 신경 성장 인자와 인터류키-6 발현 수준을 결정하는 데 사용됩니다. 서양 블로팅 및 면역 히토화학은 마침내 신경 성장 인자의 양을 검출하기 위해 수행됩니다. 이 보고는 감기 열분해 소화가 염증 도중 mRNA및 단백질 변경의 평가를 위한 진피에서 표피를 분리하는 효과적인 방법이다는 것을 보여줍니다.

쥐 뒷발에 카라게난 주사는 발적과 부종16,17과같은 염증의 고전적인 증상을 일으켰다. 뒷발의 붓기는 기계식캘리퍼(20)로측정되었다. 발 두께의 기준값은 카라게난 치료 전에 각 쥐에 대해 얻어지고 6h 및 12h에서 다시 측정하였다. 발 두께는 기준값(도1)에비해 크게 증가하였다.
쥐 글래브로스 뒷발 피부의 열량은 표피 시트를 생성했다. 브라이트필드 현미경 검사는 표피 와 진피의 열량 분리의 효과를 평가하기 위해사용되었다(도 2). 표피의 층은 더 높은 배율에서 시트를 통해 초점을 맞추면서 결정될 수 있었다. 표피 단면의 Toluidine 파란색 염색은 표피가 지하 막에서 진피로부터 분리된 것으로<strong class="xfi...

여기에 제시된 표피의 분리를 위한 프로토콜이 진피로부터 염증성 중재자 생산을 평가하기 위한 것이다. 염증에 따라, 쥐 뒷발 표피는 4°C에서 열리신에 의해 진피로부터 분리된다. 표피는 그 때 서쪽 blot 및 면역 작용화학에 의하여 RT-PCR 및 단백질 평가에 의하여 mRNA 분석을 위해 이용됩니다.

부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

우리의 프로토콜은 피부 염증 중 염증 성 중재자와 신경 영양의 사이트 별 생산을 결정하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 표피 - 진피 분리 기술입니다. 이 기술의 주요 장점은 진피로부터 표피의 효소 분리가 4°C에서 수행되어 mRNA 와 단백질의 무결성을 유지한다는 것입니다. 이 방법은 새로운 치료 내정간섭의 발달을 위한 급성 및 만성 염증 도중 1 차적인 발포성 단자 감속하는 중재자의 모형에 통찰력을 제공합니다.상처 치유, 피부 질환, 만성 상처 및 화상은이 연구에서 유익할 수 있습니다. 그리고 이 방법은 기관 및 각막과 같은 다른 상피 표면에 적용될 수 있었다. 최적의 분리 시간은 실험실 간에 약간 다를 수 있습니다.분리의 품질을 결정하기 위해 2D 형태 평가와 결합된 다른 시간 지점을 비교하는 예비 실험이 권장됩니다. 마취 된 8 ~ 9 주 된 스프라그 Dawley 쥐에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, PBS에서 희석 된 1X 람다 카라게난100 마이크로 리터로 오른쪽 글래브로우스 뒷발을 피하로 주입합니다. 캘리퍼를 사용하여 주사 후 6 시간 및 12 시간 후 뒷발 중족골 두께를 측정하여 자극에 대한 응답으로 부종의 부피를 결정합니다.적절한 실험 적 끝점에서, 주입 된 발에서 글래브로스 뒷발 피부의 하나 2 밀리미터 조각을 수확하고 마이크로 디즈 섹션 집게를 사용하여 15 ~ 60 분 동안 얼음에 미세 원심 분리 튜브에서 차가운 DMEM의 1 밀리리터로 피부를 전송합니다. 조직이 배양하는 동안, 얼음에 24 웰 세포 배양 판의 10 우물에 갓 준비 된 활성 열분해신 의 1 밀리리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 마이크로 절개 집게를 사용하여 1개의 피부 샘플을 용액에 침지하지 않고 활성화된 열량, 각막 면의 각 우물으로 옮기는 것입니다.피부가 열립에 침지되지 않고 지층 각막이 효과적인 분리를 달성하기 위해 직면하는 것이 중요합니다. 2~3시간 후, 미세 절개 집게를 사용하여 페트리 접시에 섭씨 4도의 7~8밀리리터에 한 개의 피부 샘플을 담그어 표피가 진피에서 분리할 수 있는 더 많은 공간을 허용합니다. 시료의 경계에서 거의 반투명 표피가 관찰될 때까지 집게를 사용하여 피부 둘레의 표피를 부드럽게 브러시합니다.표피가 진피에서 눈에 띄게 분리되면, 조심스럽게 한 쌍의 집게로 피부의 각 층을 잡고 천천히 진피에서 표피를 당긴 다음, 광적으로 일관적있는지 확인하기 위해 빛 현미경에 의해 격리 된 표피의 투명도를 평가합니다. 층이 제대로 분리된 경우 표피 및 진피 조직을 DMEM에 있는 5밀리미터 EDTA의 개별 용기에 30분 동안 섭씨 4도에 넣습니다. 열분해 후, 동요와 실온에서 1 시간 동안 적절한 고정에 표피의 일부를 수정합니다.인큐베이션의 끝에서, 교반과 실온에서 1 시간 동안 PBS에 고정 된 조직을 배치, 단면에 적합한 조직 포함 매트릭스에 샘플을 동결하기 전에. 저온을 사용하여 14 마이크로미터 두께의 단면을 얻고 해동하여 젤라틴 코팅 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하십시오. 슬라이드 워머에서 건조한 후 90초 동안 toluidine blue의 작동 용액으로 샘플을 얼룩지게 합니다.그 후, PBS로 슬라이드에서 톨루이딘 블루를 부드럽게 씻고 수성 장착 매체로 커버립을 반대한 다음 50~250X 배율로 브라이트필드 현미경으로 표피를 관찰합니다. 쥐 뒷발에 카라게난 주사는 염증의 고전적인 증상을 일으키는, 둘 다에 발적과 부종 등 6 그리고 12 시간 후 주입. 브라이트필드 현미경 검사는 쥐 글래브루스 뒷발 피부의 표피와 진피의 열량 분리의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있다.실제로, 표피 단면의 토루이딘 블루 염색은 표피가 기준막의 진피로부터 분리되어 있지만, 표피 레테 능선과 진피 유두로부터의 들여쓰기가 그대로 유지된다는 것을 보여준다. 또한, 모든 각질 세포 층이 관찰된다. 열리 신 분리 표피의 서쪽 얼룩은 4 섭씨에서 기술 도중 안정적인 단백질 수준을 나타내는 일관된 결과를 생성합니다.아주 작은 NGF 단백질은 순진한 쥐 표피에서 검출됩니다, 그러나 NGF 단백질 수준은 카라지난 유도한 염증의 6 시간 후에 현저하게 강화됩니다. 주입 후 12시간 후, NGF 수준은 6시간 동안 관찰된 수준에 비해 감소되지만 컨트롤에 비해 높은 수준을 유지합니다. 서양 블롯 분석에서 예상대로, NGF 면역 반응성은 순진한 대조표 조직 샘플에서 검출되지 않지만, 카라게난 유도 염증 후 6 시간 에서 NGF 면역 반응성은 지층 과립 및 지층 루시덤의 대부분의 각질 세포에서 관찰됩니다.지층 스피노섬에 있는 몇몇 세포는 또한 NGF 면역반응성이다. 열리신을 사용하여 손상되지 않은 표피를 분리하는 경우 최적의 분리 시간이 최종 사용자가 경험적으로 결정해야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 다양한 프로테오믹 및 분자 기술은 특정 단백질 및/또는 1차 유전자 전사체의 발현을 검증하여 이 절차가 기저 발현을 변경하지 않는다는 것을 확인하는 데 사용될 수 있다.표피 진피 분리의이 기술은 연구원이 다른 피부 염증 모델에서 신경 trophins 및 선동적인 중재자의 사이트 특정 표현에 관하여 추가 질문에 대답할 수 있습니다. 피릭산과 파라포름알데히드는 위험합니다. 연기 후드에 두 화학 물질과 함께 작업, 개인 보호 복과 장갑을 사용하고 처리 후 얼굴과 손을 씻어.

separation-rat-epidermis-dermis-with-thermolysin-to-detect-site

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서에서는 쥐의 장간막에 angiogenesis을 자극하기위한 간단한 모델을 설명합니다. 모델은 아래로 단일 세포 수준까지 전체 microvascular 네트워크의 얼굴 시각화 중이다있게 조직에서 비교적 짧은 시간 코스 이상의 모세관 돋아, 혈관 영역과 혈관 밀도의 극적인 증가를 생성합니다.

쥐의 장간막의 Exteriorization : Angiogenesis에 관련된 세포 역학을 조사하기위한 모델

피부는 복잡한 면역 세포 네트워크의 본거지입니다. 우리는 단일 세포 현탁액을 얻고 유세포 분석을 통해 피부에 거주하는 다양한 백혈구 집단을 분석하기 위해 동물의 신체의 여러 부분에서 마우스 피부를 소화하기 위한 효율적인 방법론을 설명합니다.

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망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

학습하세요 쥐 피부 표피와 진피를 열립신으로 분리하여 부위별 염증성 mRNA와 단백질을 검출하는 방법을. 4°C에서 분리하여 RNA와 단백질 무결성을 유지하고 피부 염증 연구에 활용할 수 있습니다.

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