Name: 전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 전립선암 마우스 모델에서 종양 오르가노이드를 생성하는 방법을. 이 프로토콜은 생체 외 암 치료법 테스트와 새로운 약물 개발 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 HEK293 세포가 HA 마우스 Noggin-Fc 또는 HA 마우스 Rspo1-Fc로 안정적으로 형질감염된 것을 제공한 스탠포드 대학의 캘빈 쿠오 연구소에 감사드립니다. 우리는 또한 우리가 그의 실험실에 있는 형광 해부 현미경에 접근할 수 있게 해 준 딘 탕 박사에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 암 연구소에서 D.W.G.에 CA179907에 의해 지원되었다. 로스웰 파크 종합 암 센터의 공유 자원은 국립 보건원 암 센터 지원 보조금 CA016056에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+genome+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li>
<li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li>
<li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li>
<li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242(2018).</li>
<li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li>
<li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+mouse+cancer+models%3A+a+maze+of+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li>
<li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+cancer+models+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+prostate%3A+a+basic+anatomical+and+histological+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Bosnian+Journal+of+Basic+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li>
<li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+Bone%3A+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents%2C+Methods%2C+and+Their+Effects+on+Bone+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li>
<li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li>
<li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K%2FmTOR+and+AR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li>
<li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 재정적 인 관계가 없습니다.

전립선 종양 해부 및 오르가노이드 생성을 위한 프로토콜 내의 중요한 단계 비 전립선 조직의 제거 및 마우스 전립선 종양의 미세 해부는 비 전립선 상피 세포와 정상 전립선 상피 세포 모두 오르가노이드를 생성하기 때문에 암 오르가노이드의 최적 생성에 매우 중요합니다. 특히 고형 전립선 종양의 경우, 생존 가능한 세포의 수를 줄일 괴사 조직오염을 제거하기 위해 실행 가능한 종양의 영역을 분리하는 것이 중요합니다. 오르가노이드 생성 도중, 콜라게나아제에 장기간 노출되면 세포 생존을 제한하기 때문에 콜라게나아제로 조직 소화를 부지런히 모니터링해야 합니다. 암 GEMM에서 파생된 오르가노이드의 경우, 마우스에서 설계된 모든 전형 및 변형된 대중 유전자가 오르가노이드에 존재하도록 각 라인을 완전히 유전자형화하는 것이 중요합니다. 유전 형질 변형이 유지되도록 하기 위해 장기간 통과 한 후 유전 형질 티핑을 반복하는 것도 필요합니다.
전립선 종양...

1980 년대 후반 이후, 상동 재조합에 의해 유전자를 변경하는 능력은크게 생물학적 시스템의 연구를 진행했다 1. 유도성, 조직 또는 세포 특이적 운동 시스템 및 Cre-loxP와 같은 부위 별 재조합제는 현적으로 및 공간적으로모두유전 적 변형에 대한 제어를 용이하게하여 유전자 연구를 진행했다 2, 3 ,3, 4. 이러한 유전 전략의 조합은 실험 모델 시스템 5,6,7의 다양한 배열을 만들었습니다.
유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)는 개별 유전자 또는 유전자 그룹이 포유류 발달과 질병에 미치는 영향을 평가하는 필수적인 도구입니다. 전 임상 암 연구에서 GEMM은 암 발병, 진행 및 치료를 연구하는 가장 생리학적으로 관련성이 있고 엄격한 방법입니다8. 우리의 실험실은 암 GEM을 생성하고 특성화하는 것을 전문으로합니다.
미국에 있는 남자 중 가장 높게 진단된 비 절단암은 전립선암입니다 (PCa). PCa를 가진 환자의 대다수는 저위험 질병 및 생존의 높은 가능성을 가지고 있습니다, 그러나 질병이 향상된 단계에서 진단될 때 또는 표적으로 한 호르몬 치료가 공격적인, 비 치료가능한 PCa에 진행을 유도하는 경우에 생존율은 급격히 감소합니다 하위 유형9,10. 우리의 실험실은 하나 이상의 종양 억제 유전자의 floxed 대틀을 이용하는 GEMM를 개발했습니다. 종양 억제 유전자 발현의 재조합 및 손실은 전립선 상피 세포에서만 활성화된 프로바신 프로모터의 Cre 재조합 하류를 가진 이식유전자를 도입했기 때문에 전립선에서 구체적으로 발생한다(11). 12. 우리는 또한 Cre 13을 가진 세포에서 Cre 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현이 결여된 세포에서 토마토 형광 단백질발현을 유도하는 mT/mG라는 Cre 리포터 이식유전자를 함유하기 위해 우리의 GEMM을 사육하였다. 이 방법의 프리젠 테이션과 우리의 대표적인 결과는 우리가 우리의 실험실에서 공부하는 GEMM을 보여주지만, 이 프로토콜은 어떤 마우스 모형든지에서 전립선암 오르가노이드를 생성하는 것을 이용될 수 있습니다. 그러나, 우리의 대표적인 결과 섹션에서 상세히 논의된 바와 같이, 우리는 특정 종양 특성이 전립선암 오르가노이드 생성에 최적이라는 것을 관찰하였다.
지난 10 년 동안, 상피 기원의 조직에서 세포를 배양하는 새로운 방법은 시험관 내 기관 시스템을 모델링하는 능력의 상당한 발전을 주도했다14,15. 용어 "3D 세포 배양"은 일반적으로 장기 특이적 세포 계보에 의해 구동 되는 이차 아키텍처를 조립 하는 세포로 구성 된 구조로 정의될 수 있는 오르가노이드를 확립 하고 유지에 관련 된 기술에 기인 했다 특성16. 이러한 새로운 방법은 세포가 장기 성장을 위해 변형 또는 불멸화를 필요로 하지 않는다는 점에서 고전적인 2D 세포 배양과 구별된다; 따라서, 정상 세포의 3D 배양은 병에 걸린 세포와 비교될 수 있다. 이것은 일반적인 세포 통제 문화가 전형적으로 유효하지 않은 암 연구에서 특히 귀중합니다. 또한, 오르가노이드는 적절하게 분화된 세포 유형을 가진 이차 조직 구조를 자발적으로 형성하여 2D 세포주(17)보다 시험관내 암을 이해하는 더 나은 모델 시스템이 다. 우리의 실험실은 우리의 생체 내 데이터를 보완하고 GEMM에서 실현 가능하지 않을 실험을 수행하기 위해 우리의 PCa GEMM에서 분리 된 종양 문제에서 3D organoid 라인을 만들었습니다.
이 문서에서는, 우리는 PCa GEMMs의 완전한 necropsy를 위한 서면및 시각적 프로토콜을 제시합니다, 명백한 마우스 전립선 엽 및 전이성 병변의 해부를 포함하여. 우리는 정상 마우스 전립선 상피 조직(18)으로부터 오르가노이드를 유도하기 위해 Drost et al.에 의해 이전에 발표된 프로토콜에 기초하여 마우스전립선 종양으로부터 오르가노이드를 생성하는 단계별 방법을 설명하고 보여준다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신+2.21mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>1 1/4인치, 23G, 일회용 주사기 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>Z192430</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>시그마</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>32% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>고급 DMEM/F12++</td><td>Gibco</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>30216623</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>해부 보드</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-1</td><td></td></tr><tr><td>EHS 육종 매트릭스, Pathclear Lot#19814A10</td><td>Trevigen 제조</td><td>프레더릭 국립 연구소(Frederick National Laboratory)의 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에서 요청</td><td>국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 보조금 보유자는 매트릭스</td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td>를 요청할 수 있습니다.<td>시그마</td><td>25-060</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 표피 성장 인자(EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>시그마</td><td>25-005</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인</td><td>시그마</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>정밀 저울</td><td>메틀러 톨레도</td><td>30216561</td><td></td></tr><tr><td>메스 #23</td><td>세계 정밀 기기</td><td>504176</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 #7, 16cm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500238</td><td></td></tr><tr><td>단일 모서리 탄소 면도날</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 해부 가위, 10cm, 직선</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 아이리스 집게, 10cm, 곡선 팁, 톱니 모양의</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 Nugent 유틸리티 집게, 직선 팁, 톱니 모양의</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Y-276632 (Rock Inhibitor)</td><td>APExBIO</td><td>A3008</td><td></td> (영어</tr></tbody></table>)

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

유전자를 수정하기 위해 상동 재조합에 기초한 방법은 생물학적 연구를 상당히 발전시켰습니다. 유전자 조작 마우스 모델 (GEMM)은 포유류 발달과 질병을 연구하기위한 엄격한 방법입니다. 우리의 실험실은 사이트 특이적인 Cre-loxP 재조합 시스템 및 전립선 특이적 프로모터를 사용하여 하나 또는 다중 종양 억제유전자의 발현이 결여된 전립선암(PCa)의 여러 GEMM을 개발하였다. 이 문서에서는, 우리는 주로 마우스 전립선 종양의 해부에 초점을 맞추고, 이러한 PCa GEMMs의 부검을위한 우리의 방법을 설명합니다. 지난 10년 동안 개발된 새로운 방법은 생체외에서 기관 시스템을 3차원으로 모델링하기 위해 상피 유래 세포의 배양을 촉진하였다. 우리는 또한 마우스 PCa GEMMs에서 종양 오르가노이드를 생성하는 3D 세포 배양 방법을 자세히 설명합니다. 전임상 암 연구는 2D 세포 배양 및 세포주 유래 또는 환자 유래 이종이식 모델에 의해 지배되고 있다. 이러한 방법은 종양 미세 환경이 부족하며, 전임상 연구에서 이러한 기술을 사용하는 데 제한이 있다. GEMM은 종양 발생 및 암 진행을 이해하는 데 더 생리학적으로 관련이 있습니다. 종양 오르가노이드 배양은 종양 건축 및 세포 계통 특성을 재량화하는 체외 모델 시스템입니다. 또한, 3D 세포 배양 방법은 종양 세포 배양에 비해 정상 세포의 성장을 허용하며, 2D 세포 배양 기술을 사용하는 경우는 거의 불가능합니다. 결합에서, 전 임상 연구에서 GEMM 및 3D 세포 배양을 사용하는 것은 암 생물학의 우리의 이해를 향상시킬 가능성이 있습니다.

전방 전립선 영역에서 큰 유체 충전 원발성 전립선 종양을 가진 마우스의 대표적인 부검 이미지는 도 2A에나타내고 있다. 대조적으로, 도 2B는, 개별 전립선 영역이 구별할 수 없는 큰 고체 원발성 전립선 종양을 가진 마우스의 대표적인 부검 이미지를 나타낸다. 형광 해부 이미지는 GFP를 발현하는 도 2B로부터 동일한 고형 전립선 종양을 나타내며, 종양 세포가 Cre를 발현한다는 것을 나타낸다(도2C). 방광과 같은 프로바신을 발현하지 않는 조직은 토마토를 발현하고 따라서 Cre를 발현하지 않는다(도2C). <stro...

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

마우스 오르가노이드 배양은 전통적인 세포 배양보다는 생체 내 세포 조직에서 더 가깝게 유사합니다. 암 연구에서, 오르가노이드는 2D 세포주 보다 더 나은 원래 종양을 모델링하고 새로운 약 처리를 개발하기 위하여 시험관 내에서 잠재적인 암 치료를 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 남성 마우스 비뇨 생식기 시스템의 en 블록 추출을 위해 방광의 양쪽에 지방 패드를 잡고 고환을 노출하기 위해 위쪽으로 당겨.각 고환을 비뇨 생식기 부위의 나머지 부분에서 조심스럽게 해부합니다. 비뇨 생식기 영역이 함께 상승되도록 방광을 부드럽게 들어 올려 그 아래에 요도가 노출됩니다. 방광을 들고 있는 동안, 요도를 절개하기 위해 등쪽 전립선의 밑면에 가위를 지향합니다.전체 비뇨 생식기 지역은 복강에서 방출될 것입니다. 비뇨 생식기 시스템을 제거 한 후, 골반 림프절은 비뇨 생식기 시스템 바로 뒤에 위치하고 척추의 양쪽에 노출됩니다. 림프절을 제거하려면 림프 조직 하에서 직선 집게를 직구하고 당깁니다.다음으로, 직선 집게로 직장을 잡고 절단하고, 창자 전체를 풀고 장 전체를 해명하여 장막림프절의 전이성 병변을 찾습니다. 전체 일리움이 제거되면 위장을 노출십인에 계속 당깁니다. 식도를 잘라 배를 완전히 제거합니다.림프절에 있는 어떤 전이성 병변이 관찰되는 경우에, PBS에 있는 저장을 위해 창자에서 멀리 이 노드를 주의 깊게 해부합니다. 위장이 제거되면 비장을 복부의 등쪽에서 수확하여 4%의 파라포름알데히드에 보관할 수 있습니다. PBS에서 보관을 위해 간을 제거하십시오.전이성 병변을 포함하는 신장 림프절과 더불어 척추의 양쪽에서 신장을 제거합니다. 흉부 구멍을 노출하려면 조심스럽게 흉곽을 따라 다이어프램을 잘라. 흉부 구멍 내에서 방출되는 부정적인 압력은 심장과 폐를 드러내게 됩니다.흉골을 위로 당겨 흉부 구멍을 더 엽니다. 흉부 림프절에서 전이성 병변을 위해 흉곽 구멍의 복부 면을 스캔하여 해부에 대해 말하십시오. 흉골을 들고 있는 동안 복부 흉곽을 잘라서 심장과 폐에 접근하고 심장을 위로 당겨 폐 밑을 자른다.완전히 심장과 폐를 제거하기 위해 en bloc는 기관내 전방 혈관을 모두 절단합니다. 폐 조직이나 폐 전이성 병변을 PBS 의 용기에 손상시키지 않고 심장을 조심스럽게 전달합니다. 전립선 종양의 해부에 대 한 해부 현미경 의 밑에 비뇨 생식기 영역을 배치합니다.직선 집게 한 쌍과 곡선 된 집게 한 쌍을 사용하여 비뇨 생식기 영역을 등색 표면으로 뒤집습니다. 요도의 분홍색-붉은 색으로 식별할 수 있는 근접 전립선 영역을 찾습니다. 구부러져 있는 집게로 비뇨생식기 조직을 조작할 수 있도록 요도를 단단히 잡습니다.정액 소포의 베이스를 찾아 조심스럽게 제거할 수 있도록 합니다. 그런 다음 집게의 곡선면을 사용하여 가능한 한 많은 지방 및 결합 조직을 제거하십시오. 요도와 근위 전립선 부위를 단단히 잡고 있지만, 요도에서 방광을 제거하기 위해 미세 뾰족한 가위를 사용합니다.근위 전립선 영역과 요도를 단단히 잡고 직선 집게로 앞쪽 전립선 부위를 잡아당기의 곡선면을 가진 전방 전립선 부위를 단단히 잡아 당광과 전립선의 나머지 부분에서 조직을 단단히 끌어당깁니다. PBS에 전방 전립선 조직을 놓고 복부 전립선 부위를 찾습니다. 같은 방식으로 복부 전립선 영역을 제거합니다.측면 영역이 등쪽 영역으로부터 구별될 수 있는 경우 양쪽의 측면 전립선 부위를 제거한다. 그런 다음 등쪽 전립선 부위를 제거하고 근위 전립선 부위를 4%의 파라포름알데히드에 배치합니다. 다진 후 종양 조각을 15 밀리리터 의 소화 완충관에 넣고 섭씨 37도에서 1-2 시간 소화합니다.소화의 끝에서, 퇴적물 원심 분리에 의해 소화 된 조직을 폐기하고 상체를 폐기. 튜브를 플릭하여 셀 펠릿을 풀어놓습니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 10 마이크로몰라 Y-27632 ROCK 억제제로 보충된 미리 따뜻워진 트립신의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.인큐베이션의 끝에서 표준 P1000 파이펫 팁으로 조직 슬러리를 다섯 번 세리라세레이트합니다. 튜브를 수조에 반납하여 5분 간 인큐베이션과 트리튜레이션을 추가로 준비합니다. 매트릭스 돔 도금은 차가운 매체의 9 밀리리터에서 소화 된 세포를 세척 한 다음 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.계산을 위한 신선한 매체의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 그리고 계산 한 후, 원심 분리에 의해 세포를 수집. 매트릭스의 적절한 부피에서 종양 세포를 희석.매트릭스 셀 용액 200마이크로리터를 55도의 각 웰에 조심스럽게 떨어뜨리면 6웰 플레이트를 데워집니다. 돔이 실온에서 2분 동안 고화된 후 플레이트를 섭씨 37도인큐베이터에 20분간 거꾸로 놓습니다. 돔이 완전히 고화되면 각각의 웰에 안드로겐 R1881 및 ROCK 억제제로 보충된 전립선 오르가노이드 배지의 2밀리리터를 첨가합니다.플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 형광 해부 이미지는 종양 세포가 Cre를 발현한다는 것을 나타내는 고형 전립선 종양에 의한 녹색 형광 단백질 또는 GFP 발현을 드러낸다. 같은 동물에서 간 및 폐는 이 종양이 1 차적인 전립선 종양에서 유래했다는 것을 보여주는 GFP를 표현하는 전이성 종양을 전시합니다.이 마우스에서 골반 림프절은 GFP를 표현하고 토마토가 아닌, 이 전이성 종양이 림프절을 추월하고 정상적인 조직이 남아 있지 않다는 것을 나타냅니다. 첫날에는 고형 전립선 종양에서 생성된 작은 오르가노이드가 종양 오르가노이드 배양에 존재하는 토마토와 GFP 발현 세포로 형성되기 시작합니다. 그러나 전립선 종양 오르가노이드가 완전히 형성되었을 때 7 일 이상까지, 오르가노이드는 GFP를 표현하지만 토마토는 아니지만, 오르가노이드가 일반적인 상피 세포가 아닌 Cre-expressing 종양 세포에서 유래했다는 것을 시사합니다.첫날에는 토마토와 GFP 발현 세포가 모두 유체로 채워진 전립선 종양에서 생성된 작은 오르가노이드 배양의 배양이 오르가노이드 배양 내에 존재한다. 그러나 유체가 채워진 전립선 종양의 오르가노이드는 GFP 또는 토마토를 7일 이상 표현하며, 이는 Cre를 발현하지 않는 세포에서 형성된 오르가노이드를 나타낸다. 전립선 조직을 수확 할 때 지향 상태를 유지하려면 항상 방광과 요도 위치를 알고 있어야합니다.그들의 생성 후에 오르가노이드는 화상 진찰 응용 프로그램, 분자 생물학 분석 및 약 스크린에서 이용될 수 있습니다.

generation-tumor-organoids-from-genetically-engineered-mouse-models

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

종양에서 유래한 오가노이드는 종양의 병리학적 특징과 장기 특이적 세포 계통을 유지할 수 있는 일종의 3D 세포 배양 모델입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 유전자 조작 마우스 모델로부터 전립선 종양으로부터 오가노이드를 생성하는 것을 볼 수 있습니다.

종양에서 오가노이드 준비: 3D 체외 종양 모델

이 비디오에서는 종양 발생에 대한 장기 환경의 역할을 연구하기 위해 배양된 방광 종양 오가노이드를 쥐 방광에 정소성 이식하는 방법을 설명합니다.

방광 종양 오가노이드 모델: 방광 오가노이드를 수용자 쥐 방광에 정소성 이식하는 방법

기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

마우스 전립선 오르가노이드는 분화를 조절하는 메커니즘을 평가하는 유망한 맥락을 나타낸다. 이 논문은 전립선 오르가노이드를 확립하기 위한 개선된 접근법을 설명하고, (1) 오르가노이드로부터 단백질 용해액을 수집하고, (2) 전체 마운트 공초점 현미경검사법에 대한 수정 및 얼룩 오르가노이드를 수집하는 방법을 소개합니다.

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

이 프로토콜은 발암물질 유도 뮤린 방광암에서 유래한 방광 종양 오르가노이드의 3차원 시험관 내 배양을 확립하기 위한 상세한 실험 단계를 제공한다. 종양 오르가노이드의 통과, 유전 공학 및 정형외 이식을 포함하는 배양 방법이 기재되어 있다.

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

환자 종양에서 생성된 오가노이드를 생쥐 간에 항소적으로 주입합니다. 종양이 없는 간 조직의 절제는 종양이 위치한 간 조직에 재생 환경을 조성합니다.

간 재생이 종양 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 간세포 암 환자 유래 오가노이드 이종이식 모델

전립선암 이질성과 치료 저항성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 주요 부모 종양 특성을 보존하는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 표준화된 모델은 약물 스크리닝 및 정밀 의학 발전을 지원합니다.

환자 유래 전립선암 오가노이드의 확립 및 유지: 상세한 실험 프로토콜

이 프로토콜은 2D에서 성장된 쥐 전립선 오가노이드 기반 모델 생성을 설명합니다. 이 과정에는 오가노이드 해리, 세포 시딩, 분화, 상피 완전성 평가, 그리고 요로병원성 대장균에 의한 시험관 내 감염이 포함됩니다. 이 모델은 끝부분 접근성을 제공하며 숙주-병원체 상호작용 연구에 적합하여 전통적인 3D 오르가노이드 시스템의 한계를 극복합니다.

숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 마우스 전립선 오가노이드 기반 모델 생성

학습하세요 전립선암 마우스 모델에서 종양 오르가노이드를 생성하는 방법을. 이 프로토콜은 생체 외 암 치료법 테스트와 새로운 약물 개발 연구에 활용됩니다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

더 많은 동영상 탐색