Name: 암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 배우세요 암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망을 평가하는 최적화된 프로토콜을. 이 방법은 종양 미세환경을 재현하여 항암제 효능 평가와 생체 내 연구로의 전환을 개선합니다.

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우리는 우수한 기술 지원을 위한 캐서린 프랭클린 마크와 아네트 바텔스와 그림 1D에서 실험을 수행에 대한 Asbjørn Nøhr-닐슨에 감사드립니다. 이 작품은 에이나르 윌럼슨 재단, 노보 노디스크 재단, 주훔 재단(모두 SFP)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li>
<li>Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+glucose+and+oxygen+supply+conditions+on+the+oxygenation+of+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids.</a> British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).</li>
<li>Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+reveals+differences+in+protein+expression+in+spheroid+versus+monolayer+cultures+of+low-passage+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000293(2008).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+create+the+correct+microenvironment%3A+three-dimensional+heterotypic+collagen+assays+for+human+breast+epithelial+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia.</a> Methods. 30 (3), 247-255 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Jacobi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+three-dimensional+cancer+cell+cultures+mirror+drug+responses+in+vivo%3A+lessons+learned+from+the+inhibition+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling.</a> Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+transition+in+multi-cellular+human+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids.</a> Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+intermediates+between+monolayer+culture+and+in+vivo+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor.</a> Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).</li>
<li>Andersen, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+acid-extruding+ion+transporters+in+regulation+of+breast+cancer+cell+growth+in+a+3-dimensional+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment.</a> Molecular Cancer. 15 (1), 45(2016).</li>
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<li>Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+in+multicellular+spheroids+of+oncogene-transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+induces+novel+proliferative+and+metabolic+alterations+associated+with+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation.</a> International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+pancreatic+cancer+spheroids+mimic+growth+pattern+of+circulating+tumor+cell+clusters+and+macrometastases%3A+displaying+heterogeneity+and+crater-like+structure+on+inner+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+cell+adhesion+and+the+extracellular+matrix+in+the+three-dimensional+growth+of+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroendocrine+tumor+cell+lines+as+a+three-dimensional+model+for+the+study+of+human+neuroendocrine+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy.</a> Journal of Visual Experiments. (66), e4218(2012).</li>
<li>Friedrich, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+tool+to+determine+cell+viability+in+complex+3-d+culture%3A+the+acid+phosphatase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).</li>
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<li>Bochet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+fibroblasts+promote+tumor+progression+and+contribute+to+the+desmoplastic+reaction+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer.</a> Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3D+angiogenesis+model+to+study+tumour+-+endothelial+cell+interactions+and+the+effects+of+anti-angiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2963(2017).</li>
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<li>Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+CO2%2FHCO3%28-%29+formula+buffer+in+the+regulation+of+intracellular+pH+of+three-dimensional+tumor+growths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).</li>
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<li>Michel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+modeling+of+the+proliferation+gradient+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).</li>
<li>Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tumor+culture+systems+for+functional+drug+testing+and+therapy+response+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

3D 암 세포 스페로이드의 사용은 항암제 스크리닝뿐만 아니라 종양을 모방한 조건하에서 암세포 사멸 및 생존가능성에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위한 귀중하고 다양한 도구임이 입증되었습니다. 미세 환경. 이것은 화학요법 약의 접근성, 세포 장악 및 세포내 효력이 pH, 산소 긴장, tortuosity 및 물리적 인 및 종양에 있는 physico 화학 조건에 의해 심오하게 영향을 미치기 때문에 특히 중요합니다 화학 세포 세포상호 작용 9,17. 예를 들어, 많은 고형 종양25,26,27,28,29에서6-6.5의 낮은 값에 도달 할 수있는 세포 외 pH의 산도는 ...

암 생물학에서 다세포 스페로이드 모델의 사용은 수십년 된 1,2,그러나 최근 몇 년 동안 상당한 모멘텀을 얻고있다. 큰 부분에서, 이것은 암세포의 표현형이 그들의 미세 환경 및 특정 성장 조건에 얼마나 강하게 의존하는지의 증가한 의식을 반영합니다. 고형 종양의 미세 환경은 상응하는 정상 조직에서의 미세 환경과 근본적으로 다릅니다. 여기에는 pH, 산소 장력과 같은 물리 화학 적 조건뿐만 아니라 간질 압력, 영양분, 노산물 및 분비 된 신호 화합물 (성장 인자, 사이토 카인)과 같은 수용성 인자의 농도 구배가 포함됩니다. 더욱이, 종양3,4의세포외 기질(ECM), 세포-세포 상호작용 및 세포간 신호화, 및 특정 3차원(3D) 아키텍처의 다른 양상들의 조직을포함한다. 5,6. 암세포가 존재하는 특정 미세 환경 조건은 유전자 발현 프로필 및 기능적 특성에 심오하게 영향을 미치며, 2D로 자란 세포의 표현형에 비해 3D 스페로이드의 표현형이 훨씬 더 밀접하게 모방된다는 것은 분명합니다. 생체 내 종양의7,8,9,10,11. 2D 모델은 저산소증, 산성 pH 및 높은 젖산 농도를 사용하여 종양 미세 환경의 알려진 측면을 모방하더라도 종양 내에서 발생하는 물리 화학 적 매개 변수와 3D 종양의 구배를 포착하지 못합니다. 아키텍처. 다른 한편으로는, 동물 모형은 비용이 많이 들고, 느리고, 윤리적으로 문제가 있고, 일반적으로, 또한 인간 적인 종양 조건을 되풀이하는 그들의 기능에 있는 결점이 있습니다. 따라서, 3D 스페로이드는 대부분의 고형암9,11, 12,13의광범위한 특성에 대한 연구에서 중간 복잡성 모델로적용되었습니다. 14,15,16,17.
3D 스페로이드의 널리 사용되는 사용은 항암 치료 효능 9,18,19,20의스크리닝 검문 검사에 있다. 처리 반응은 종양 미세 환경에 특히 민감하며, 불법 행위의 영향, 제한된 확산, 높은 간질 압력 및 약물 전달에 대한 산성 환경 pH, 저산소증 및 기타 의 영향을 모두 반영합니다. 세포 사멸 반응에 대한미세 환경의 양상 9,17. 3D 스페로이드 내의 환경은 본질적으로 이러한 속성 7,8,9,10,11을모두 개발하기 때문에 3D 세포 배양을 채택할 수 있습니다. 결과의 결과를 생체 내 조건으로 실질적으로 향상시키면서도 순 성장의 효율적이고 저렴한 고처리량 스크리닝을 허용합니다. 그러나, 암세포의 약물 반응에 대한 연구의 대부분은 여전히 2D 조건 하에서 수행된다. 이것은 몇몇 분석실험이 3D 세포 배양을 위해 상대적으로 쉽게 구현될 수 있는 동안, 생존성 분석실험, 서쪽 blotting 및 면역형광 분석과 같은 많은 것이 3D에서 보다는 2D에서 훨씬 더 편리하게 행해질 수 있다는 것을 반영합니다.
본 연구의 목적은 암세포 생존력및 생존에 대한 항암제 치료의 효과를 분석하기 위한 용이한 분석및 정밀한 프로토콜을 3D 종양 모방 설정에서 제공하는 것이다. 구체적으로, 우리는 스페로이드 형성을 위한 3개의 다른 방법을 제공하고 비교하고, 성장, 생존력 및 약물 반응의 정성적 및 정량적 분석을 위한 방법에 선행합니다.

<table><tbody><tr><td>2-(4-아미디노페닐)-1H-인돌-6-카르복사미딘 (DAPI)</td><td>인비트로겐</td><td># C10595&nbsp;</td><td>핵 염색용</td></tr><tr><td>5-Fluorouracil (5-FU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F6627</td><td>화학요법 치료의 구성 요소</td></tr><tr><td>5-(N-에틸-이소프로필) 아밀로라이드(EIPA)</td><td>Life Technologies</td><td>#E3111</td><td></td></tr><tr><td>PARP 및 cPARP</td><td>세포 신호</td>에 대한 NHE1 항체 억제제<td>#9542</td><td>웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>세포 신호</td>에 대한 항체<td>#9449</td><td>IHC</td></tr><tr><td>에 사용p53</td><td>세포 신호에 대한 항체&nbsp;</td><td>#2524&nbsp;</td><td>IHC에 사용</td></tr><tr><td>&beta;-actin Sigma에 대한 항체</td><td>&nbsp;</td><td>A5441</td><td>웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>Bactoagar</td><td>BD Bioscience</td><td>#214010</td><td>아가로스 겔 준비에 사용</td></tr><tr><td>벤치마크 단백질 사다리</td><td>Invitrogen</td><td>#10747-012</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC 단백질 분석 키트</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>#500-0113, #500-0114, #500-0115&nbsp; &nbsp;</td><td>용해물에서 단백질 측정에 사용</td></tr><tr><td>B&uuml; rker 챔버</td><td>Marienfeld</td><td>610311</td><td>세포 계수용&nbsp;</td></tr><tr><td>BX63 에피플루오레센스 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>형광 이미징에 사용되는</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 세포 생존력 분석</td><td>Promega</td><td>#G9681</td><td>세포 생존력 분석</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>에 사용됩니다#P4394&nbsp;</td><td>화학요법 치료의 구성 요소</td></tr><tr><td>코닝 스페로이드 마이크로플레이트, 96 웰, 투명한 둥근 바닥이 있는 검은색,&nbsp; 초저 부착, 뚜껑 포함, 멸균</td><td>Corning</td><td>#4520</td><td>발광 측정을 종점으로 하는 스페로이드 성장에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Corning 96 웰, 투명한 둥근 바닥,&nbsp; 초저 부착성 마이크로 플레이트, 뚜껑 포함, 멸균</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>발광 측정 없이 스페로이드 성장에 충분 종점으로 측정</td></tr><tr><td>기준 TGX 프리캐스트 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>5671025</td><td>SDS-PAGE에 사용</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Abcam</td><td>#120629</td><td>화학 요법 치료의 구성 요소</td></tr><tr><td>FLUOStar Optima Microplate 리더</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>발광 기록에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>포름알데히드&nbsp;</td><td>VWR 화학&nbsp;</td><td>#9713.1000&nbsp;</td><td>세포 고정에 사용</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Gibco</td><td>#A1413202</td><td>4°C 유지 & deg; C는 응고를 방지합니다. 프로토콜에서 rBM이라고 합니다.</td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Sigma</td><td>#F9665</td><td>성장 매체용 세럼</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Scientific 이미지 분석</td></tr><tr><td>Medim Uni-safe 케이스</td><td>Medim Histotechnologie</td><td>10-0114</td><td>임베디드 스페로이드 저장용으로 사용</td></tr><tr><td>미니 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche Diagnostics GmBH&nbsp;</td><td># 11836153001</td><td>용해 버퍼 준비에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>MZ16 현미경</td><td>Leica</td><td></td>는 <td>광학 현미경 이미지에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>NuPAGE LDS 4x 샘플 버퍼&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#NP0007</td><td>웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>Pierce ECL 웨스턴 블로팅 기질</td><td>Thermo scientific</td><td>#32106</td><td>웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P7170-1L</td><td>단백질 밴드 염색에 사용</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Scientific 그래프 및 통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>Propidium iodide(물 속 1mg/ml 용액)</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>P3566</td><td>감광성&nbsp;</td></tr><tr><td>멸균 저장소, 다채널</td><td>SPL lifesciences</td><td>21002</td><td>스페로이드 형성을 위한 세포 파종에 사용</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra-Plus 접착 슬라이드&nbsp;</td><td>멘젤-Gl &auml; ser</td><td>#J3800AMNZ</td> Tamoxifen Sigma-Aldrich를 <td>끼워넣는 데 사용되는 현미경 유리 슬라이드</td></tr><tr><td></td><td></td><td>#T5648</td><td>화학 요법 처리로 사용되는</td></tr><tr><td>트랜스 블롯 터보 0.2 &마이크로; m 니트로셀룰로오스 막</td><td>Bio-Rad</td><td>#170-4159</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS 러닝 버퍼에 사용&nbsp;</td><td>바이오 라드&nbsp;</td><td>#161 0732</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액</td><td>Sigma</td><td>에 사용#T4174&nbsp;</td><td>세포 해리 효소</td></tr></tbody></table>

암세포의 3d 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3차원 스페로이드는 암 약물 스크린과 암 세포 생물학에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위한 중요한 도구입니다. 이 준비의 힘은 상대적으로 높은 처리량 검열을 허용하기 위하여 충분히 빠르고, 싸고, 다재다능하면서 종양의 생체 내 조건의 많은 양상을 모방하는 그것의 기능에 있습니다. 스페로이드 배양 조건은 종양에 있는 물리 화학 구배를 되풀이할 수 있습니다, 세포외 산도 증가 포함, 증가한 젖산, 및 포도당 과 산소 가용성 감소, 그것의 코어에 구형 주변에서. 또한, 생체 내 종양의 기계적 특성 및 세포-세포 상호 작용은 부분적으로 이 모델에 의해 모방된다. 특정 특성 및 결과적으로 최적의 성장 조건, 3D 스페로이드의, 암 세포의 다른 유형 사이 크게 다릅니다. 게다가, 3D 스페로이드에 있는 세포 생존성 그리고 죽음의 평가는 2D 문화를 위해 채택된 것과 부분적으로 다른 방법을 요구합니다. 여기에서 우리는 암세포의 3D 스페로이드를 준비하기 위한 몇몇 프로토콜을 기술하고, 항암제의 효험을 평가하는 맥락에서 세포 생존력 및 죽음을 평가하기 위하여 그 같은 문화를 이용하기 위한.

도 1A 및 도 1B에도시된 스페로이드 형성 프로토콜에 기초한 스페로이드 성장 분석은 3D 종양에서 항암 약물 치료의 효과를 분석하기 위한 출발점으로 사용되었습니다. 설정을 모방합니다. 스페로이드가 형성되는 용이성은 세포주 특이적이며, 일부 세포주는 일관된 스페로이드22를형성하기 위해 rBM을 보충해야 합니다. 추가된 rBM의 농도는 스페로이드의 형태에 심오하게 영향을 미칠 수 있습니다. 도 1C 및 도 1D에도시된 바와 같이, rBM의 농도가 0~4% 사이를 변화하면 세포 유형 의존적 방식으로 스페로이드의 소형화 및 형태가 변화한다. <strong cla...

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

여기에 제시된 프로토콜은 3D 문화에 최적화되어 있으며 3D 환경에서 암 세포 성장, 증식 및 사망과 관련된 프로세스에 대한 효율적이고 저렴한 조사를 허용합니다. 3D 배양을 사용하는 주요 장점은 체외에서 종양 미세 환경의 주요 측면을 재구성할 수 있는 독특한 가능성이라는 것입니다. 3D 스페로이드는 암 치료 연구에서 시험관 내 및 생체 내 조건 사이의 번역을 개선하는 데 점점 더 익숙해지고있는 암 약물 검진을위한 중요한 도구입니다.일부 프로토콜에는 일정량의 연습과 기술이 필요합니다. 이는 특히 손 낙하 방법에 의한 스페로이드를 생산하고 면역조직화학용 스페로이드를 내장하는 데 특히 해당된다. 이러한 절차의 핵심 요소는 구체를 아가로즈 한 방울에 삽입하는 방법과 같이 서면으로 설명하기 어렵기 때문에 시각적 데모는 연구원이 이러한 절차를 수행하는 데 도움이 됩니다.최적의 세포 밀도를 얻기 위해 15 밀리리터 튜브에서 준비된 세포 현탁액을 희석시. 희석된 셀 현탁액을 멸균 저장소로 옮기고 다중 채널 파이펫을 사용하여 이전에 준비된 플레이트에 200 마이크로리터를 분배합니다. 이산화탄소 5%와 습도 95%로 섭씨 37도에서 배양합니다.2~3일마다 스페로이드의 가벼운 현미경 이미지를 수집합니다. 이미지를 수집한 후 각 웰에서 소비된 매체의 100마이크로리터를 제거하고 신선한 매체의 100마이크로리터로 교체합니다. 첫째, 얼음에 재구성 된 지하 막을 해동.사용하기 전에 개별적으로 포장 된 접시와 저수지를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 최적의 세포 밀도를 얻기 위해 15 밀리리터 튜브에서 준비된 세포 현탁액을 희석한다. 희석된 세포 현탁액을 함유한 튜브를 얼음 위에 놓습니다.플라스틱 용기를 얼음으로 채우고 후드로 옮습니다. 차가운 접시와 저수지를 세포 배양 후드로 옮춥니다. 접시와 저수지를 얼음 위에 다시 놓습니다.균질성 젤을 보장하기 위해 rBM을 부드럽게 다시 중단합니다. 차가운 세포 현탁액에 rBM의 최적 농도를 추가합니다. rBM 및 세포 현탁액이 제대로 혼합되었는지 확인하기 위해 튜브를 반전시하십시오.그런 다음 이 혼합물을 멸균 저장소로 옮기고 멀티채널 파이펫을 사용하여 200마이크로리터를 냉정하고 극저부착된 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. rBM이 경화될 때 세포가 함께 클러스터되도록 15분 동안 750배 g의 플레이트원심분리기. 원심분리기 소프트 하강 또는 최소한의 제동 기능을 사용합니다.첫째, 세포 배양 접시에 PBS의 6 밀리리터를 추가합니다. 적절한 희석을 얻기 위해 준비된 세포 현탁액을 희석시. 실용적인 희석은 밀리리터당 50, 000세포입니다.세포 현탁액을 멸균 저장소에 붓고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 세포 배양 접시의 뚜껑에 최대 30 방울의 현탁액을 조심스럽게 배치하여 드롭 당 2000 세포의 농도를 초래합니다. 빠르지만 조절된 움직임으로 뚜껑을 뒤집고 PBS가 함유된 세포 배양 접시 위에 놓습니다. 4~6일 동안 이산화탄소 5%, 습도 95%로 섭씨 37도에서 배양합니다.스페로이드가 단백질 용액이나 임베딩에 사용되어야 하는 경우 뚜껑을 제거하고 기울인 다음 가열 된 매체의 1 밀리리터로 방울을 씻어 서 서 가져옵니다. 생성된 스페로이드 함유 배지를 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 스페로이드가 단백질 리자또는 포함을 진행하기 전에 튜브 의 바닥에 정착하게하십시오.P200 파이펫 팁의 끝을 잘라 구조를 방해하지 않고 스페로이드를 보다 쉽게 캡처합니다. 각 조건에 대해 최소 12개를 당기지만 1.5 밀리리터 튜브에서 18에서 24 개의 스페로이드 사이를 이상적으로 당깁니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 스페로이드가 바닥에 정착하도록 합니다.다음으로 멸균 세포 실험실에서 일반 실험실로 이동합니다. 스페로이드를 얼음-차가운 1개 X PBS 1밀리리터로 두 번 세척하여 각 세척 단계 사이에 PBS를 제거하기 전에 스페로이드가 정착하도록 하십시오. 그런 다음 스페로이드를 방해하거나 제거하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 흡인합니다.스페로이드 당 인산염 및 프로테아제 억제제와 가열 된 용해 버퍼 5 마이크로 리터를 추가합니다. 스페로이드를 30초 동안 소용돌이치게 한 다음 10초 동안 빠른 원심분리를 수행합니다. 소용돌이와 원심분리의 간격을 5-10분 동안 또는 스페로이드가 용해될 때까지 반복합니다.PI 용액을 준비한 후 96웰 플레이트에서 각 웰에서 100 마이크로리터의 배지를 제거하여 스페로이드를 제거하지 않도록 하십시오. 각 우물에 100 마이크로리터의 가열 된 X PBS를 넣고 우물에서 100 마이크로 리터의 액체를 제거합니다. 남은 매체를 씻어 내려면 이 세탁 단계를 세 번 반복하십시오.다음으로 각 웰에 PI 솔루션의 마이크로리터 100개를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 섭씨 37도에 이산화탄소 5%, 습도 95%를 10~15분간 배양합니다. 그 후, 이전에 설명한 바와 같이, 가열된 X PBS를 3회 가열하여 세척 과정을 반복하여 PI 용액을 세척하고 이미징 시 배경 신호를 감소시한다.피플루오렌스 현미경을 사용하여 스페로이드를 이미지합니다. 이미징 소프트웨어 내에서 멀티 채널 메뉴를 엽니다. 관련 채널의 노출 시간을 설정하고 각 채널을 조정한 후 읽기 설정을 누릅니다.Z 스택 메뉴를 열고 이미지 포커스를 조정하여 시작 및 끝을 정의합니다. 처음에는 스페로이드가 초점에서 벗어난 다음 이미지가 다시 흐려질 때까지 전체 스페로이드를 통해 초점 지점을 이동합니다. 그런 다음 단계 크기를 18~35마이크로미터 사이로 조정하고 시작을 누릅니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 첫날 연기 후드에 스페로이드를 수정합니다. 둘째 날, 아가로즈 젤을 전자레인지에 물로 채워진 비커에 넣고 가열하고 필요할 때까지 섭씨 60도로 설정된 벤치 탑 난방 판에 젤을 따뜻하게 유지합니다. 세척당 얼음 차가운 1 밀리리터 X PBS를 사용하여 연기 후드에 스페로이드를 두 번 씻으세요.그런 다음 대부분의 PBS를 흡인합니다. 20 마이크로리터 파이펫 팁을 경사로 절단하여 더 큰 구멍이 있는 뾰족한 팁을 얻습니다. 그 후, 현미경 슬라이드에 아가로즈 젤 드롭을 합니다.아가로즈가 고화되는 것을 방지하기 위해 따뜻한 난방 블록에 슬라이드를 놓습니다. 수정된 파이펫 팁을 사용하여 15~20마이크로리터의 부피로 가능한 한 많은 스페로이드를 잡습니다. 조심스럽게 아가로즈 젤 드롭의 중앙에 스페로이드를 주입, 현미경 슬라이드를 만지지 않도록.실온또는 4도에서 5~10분간 배양하여 아가로즈 젤드롭이 굳어지게 합니다. 젤 드롭이 다소 고화되었지만 여전히 부드러워지면 메스를 사용하여 현미경 슬라이드에서 플라스틱 조직 카세트로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 티슈 카세트를 에탄올로 채워진 비커로 옮기고 실온에서 보관하십시오.본 연구에서는, 3D 배양에서 암세포 생존가능성 및 사망에 대한 항암 치료 유도 변화의 분석을 위한 일련의 방법이 제시된다. 추가된 rBM의 농도는 스페로이드의 형태에 심오하게 영향을 미칠 수 있습니다. 최대 2.5%rBM을 첨가하면 SKBr-3 유방암 세포에서 스페로이드 형성이 가능하며, 더 높은 농도에서는 더 이상 효과가 없습니다.대조적으로, BxPC-3 췌장암세포는 자발적으로 작은 소형 스페로이드를 형성한다. 이 세포 유형에서 rBM을 1.5% 이상으로 늘리면 스페로이드에서 돌출 및 질이 있는 더 복잡한 구조로 뚜렷한 형태학적 변화가 유도됩니다. 화학요법 효능의 스크리닝을 위한 스페로이드 배양의 사용의 예가 여기에 나와 있다.광 현미경 이미지는 MDA-MB-231 유방암 세포에서 50% 감소된 생존가능성을 결정하기 위해 수행된 투여량 반응 실험 중에 2~3일마다 획득된다. 억제제의 농도가 증가함에 따라 죽은 세포의 공간 배치는 PI 염색을 사용하여 시각화될 수 있다. 본 바와 같이, 대조구 스페로이드는 제한된 괴사, 후기 세포 핵을 나타내며, 죽은 세포는 억제제의 농도가 증가함에 따라 스페로이드 전체에 분포된다.여기에 표시된 스페로이드 기술은 3D 침입, 마이그레이션 또는 미세 포레틱 분석과 같은 많은 다른 분석법에 적용 될 수 있습니다. 또한 종양 미세 환경에서 세포 상호 작용에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있는 섬유 아세포, 지방 세포 또는 면역 세포와 공동 배양에 적용됩니다. 이 기술의 발달은 유전자 발현, 침략 및 처리 원조를 포함하여 암 발달의 수많은 양상에서 종양 미세 환경의 역할을 해명하는 데 매우 중요했습니다.

assessing-cell-viability-death-3d-spheroid-cultures-cancer

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

여기에서 방법은 유산균 세포 없는 상체 (LCFS)의 항암 효과를 이해하기 위하여 제시됩니다. 대장암 세포선은 3D 배양에서 LCFS로 치료할 때 세포 사망을 보여줍니다. 스퍼로이드를 생성하는 과정은 스캐폴드와 제시된 분석 방법에 따라 최적화될 수 있으며 관련 시그널링 경로를 평가하는 데 유용하다.

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

배우세요 암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망을 평가하는 최적화된 프로토콜을. 이 방법은 종양 미세환경을 재현하여 항암제 효능 평가와 생체 내 연구로의 전환을 개선합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

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