Name: 체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 학습하세요 체외 배치 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 고속 스크리닝하는 방법을. 이 프로토콜은 저비용으로 숙주 대사 간섭을 회피하며 진단 응용 가능성을 제공합니다.

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이 연구는 중국 국립자연과학재단(31741109호), 후난자연과학재단(2018JJ3200호), 후난대학교 과학공학부 에서 의뢰한 특성분야 조성 프로그램이다. 이 원고를 준비하는 동안 LetPub (www.letpub.com)의 언어 적 지원에 감사드립니다.

이 프로토콜은 후난 과학 공학 대학 (후난, 중국) 및 절강 공샹 대학 (절강, 중국)의 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 박테리아의 준비
<ol><li>비피도박테리움 배지 국물의 제조<ol>
<li>950 mL의 증류수에 다음 구성 요소를 결합하십시오 : 고기 추출물, 5 g / L; 효모 추출물, 5 g / L; 카제인 펩톤, 10 g/L; 콩톤, 5 g / L; 포도당, 10 g/L; K2HPO4,2.04 g/L; MgSO4·7H 2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; NaCl, 5 g/L; 트웬 80, 1 mL; 소금 용액, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g / L; KH2PO4,1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); 및 resazurin, 0.4 mL (2.5 mg /L). 2 M NaOH로 pH를 6.8로 조정합니다.</li>
<li>121°C에서 15분간 오토클레이브하고 국물을 혐기성 조건하에서 실온(RT)으로 냉각시키십시오(10% H2,10% CO2, 80% N 2). 필터 멸균 시스테인-HCl (0.5 g/L) 및 무크로신 (5 mg/L)을 배지에 추가합니다.</li>
</ol>
</li>
<li>혐기성 조건 하에서 5 mL의 비피도박테리움 배지 국물을 배양튜브에 냉동 비피도박테리움 롱룸의 aliquot(50 μL)를 첨가한 다음, 37°C에서 24시간 동안 혐기성 인큐베이터에서 배양한다.</li>
</ol>2. 비피도박테리아 EPS 의 준비
<ol><li>PYG 한천 배지의 준비<ol>
<li>다음을 결합: 펩톤, 20 g/L; 효모 추출물, 10 g / L; 포도당, 5 g/L; NaCl, 0.08 g/L; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4·7H 2O, 0.008 g/L; K2HPO4, 0.04 g/L; KH2PO4,0.04 g/L; NaHCO3, 0.4 g/L; 한천, 12 g/L. 10 M NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.</li>
<li>121°C에서 15분간 용지를 오토클레이브하고 ~50°C까지 냉각시. 그런 다음 배지 1L당 0.5 mL의 필터 멸균 비타민 K1 용액(99% 에탄올 99mL에 용해된 비타민 K1 1 개), 해민 용액 5 mL (1 mol /L NaOH 1 mL에 용해 된 해민 0.5 g)을 추가하십시오. , 증류수로 100 mL까지 키우고, 0.5 g의 시스테인-HCl을 키웠다.</li>
<li>PYG 플레이트를 붓기 전에 필터 멸균 된 5-브로모-4 클로로-3-β-D-galactopyraside (X-Gal, 0.06 g /L), LiCl·3H2O (5.7 g/L) 및 무피로신 (5 mg/L)을 배지에 추가하십시오. 참고 : X-Gal 및 LiCl.3H2O는 착색 변화를 통해 플레이트에 B. longum 식민지를 식별 할 수 있습니다.</li>
</ol>
</li>
<li>B. longum 균주의 20 μL을 PYG 플레이트에 접종하고 72 시간 동안 37 °C에서 혐기성 인큐베이터에 놓습니다.</li>
<li>계량 스쿱을 사용하여 PYG 플레이트에서 점막 세균 콜로니를 수집한 다음 와류 발진기를 사용하여 인산완충 식염수(PBS)의 10mL에서 완전히 다시 중단합니다. 참고: 섬유가 PBS에 완전히 용해될 때까지 세균 및 EPS 혼합물을 소용돌이 또는 위아래로 반복적으로 반복하여 완전히 다시 매달아야 합니다.</li>
<li>서스펜션을 6,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
<li>조심스럽게 새로운 원심 분리튜브에 초자연자를 옮기고 반복적인 반전과 블렌딩으로 3부량의 차가운 99% 에탄올과 완전히 섞어보십시오.</li>
<li>혼합물을 6,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 초자연자를 완전히 제거하십시오.</li>
<li>속도 진공을 사용하여 하룻밤 동안 EPS 추출물을 긁어 내고 건조시킴으로써 원심분리관에서 침전물을 제거한다.</li>
</ol>3. 발효매체의 준비
<ol><li>기본 배양 배지 VI의 준비<ol>
<li>다음을 결합: 펩톤, 3 g/L; 트립톤, 3 g/L; 효모 추출물, 4.5 g/L; 뮤신, 0.5 g/L; 담즙 염 제 3, 0.4 g/ L; NaCl, 4.5 g/L; KCl, 2.5 g/L; MgCl2·6H 2O, 4.5 g/L; 1 mL 트웬 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4,0.4 g/L; MgSO4·7H 2O, 3.0 g/L; MnCl2·4H 2O, 0.32 g/L; FeSO4·7H2O, 0.1 g/L; CoSO4·7H 2O, 0.18 g/L; CaCl2·2H 2O, 0.1 g/L; ZnSO4·7H 2O, 0.18 g/L; CuSO4·5H 2O, 0.01 g/L; NiCl2·6H 2O, 0.092 g/L. 1 M HCl으로 pH를 6.5로 조정합니다.</li>
<li>섹션 2.1에서 와 같이 해민과 시스테인을 준비하고 오토클레이브 및 냉각 후 추가합니다.</li>
</ol>
</li>
<li>VI 베이스 미디어를 통해 다양한 탄소 원을 포함하는 배양 배지를 준비합니다. 오토클레이브에 앞서, 비프 EPS 섬유 8 g/L을 중간 VI에 첨가하고, VI_Bif 군으로 구성된다. 또한 중간 VI에 8 g/L 전분을 추가하여 그룹 VI_Starch를 나타냅니다. 마지막으로, 탄소 원을 첨가하지 않고 중간 VI가 대조군(group VI)으로 사용된다. 참고: Bif EPS 및 전분은 먼저 자기 교반기를 사용하여 뜨거운 물에 용해된 다음 준비된 VI 배지와 혼합합니다.</li>
<li>121 °C에서 모든 매체를 15분 동안 오토클레이브하고 RT로 냉각시.</li>
<li>혐기성 인큐베이터에서 배양 튜브에 각 배지의 하위 샘플(5 mL)을 옮기고, 나머지 배지를 4°C에 저장한다.</li>
</ol>4. 인간 배설물 샘플 준비
<ol><li>대변 용기를 사용하여 건강한 성인 인간 자원 봉사자로부터 신선한 배변 직후 신선한 배설물을 수집하고 슬러리 준비에 사용합니다. 참고: 샘플 수집 전에, 모든 자원 봉사자는 샘플을 기증하기 전에 적어도 3 개월 동안 항생제, 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱 치료를 받지 않도록 선별해야 합니다. 또한 모든 기부자는 통보된 서면 동의를 제공해야 합니다.</li>
<li>신선한 배설물 샘플(1g)을 0.1 M 혐기성 PBS(pH 7.0)의 10 mL로 유리 비커에 옮긴 다음 유리 막대를 사용하여 10% (w/v) 슬러리를 준비합니다.</li>
<li>0.4 mM 체를 사용하여 배설물 슬러리를 필터링하십시오. 이어서, 여과된 슬러리의 서브샘플을 사용하여 배치 배양 발효 실험을 접종하고, 추가 분석을 위해 나머지를 -80°C에 저장한다. 참고 : 단계 4.2-4.3 혐기성 챔버에서 수행됩니다.</li>
</ol>5. 시험관 내 배치 발효
<ol><li>여과된 배설물 슬러리(500 μL)를 혐기성 챔버 내에서 단계 3.2에서 제조된 발효 배지에 첨가한 다음 37°C에서 배양합니다.</li>
<li>혐기성 챔버에서 24 시간 및 48 h에서 발효 샘플 2 mL을 수집 한 다음 챔버 외부의 원심 분리기를 6,000 x g에서 3 분 동안 수집합니다.</li>
<li>다당류 분해 분석 및 단쇄 지방산(SCFA) 측정에 사용될 새로운 원심분리관으로 조심스럽게 주축을 옮긴다.</li>
<li>원심분리 펠릿을 -80°C에 저장하고 이어서 세균게놈 DNA 추출에 사용한다.</li>
</ol>6. 인간 배설물 미생물에 의한 EPS 저하
<ol><li>미리 코팅된 실리카 젤-60 TLC 알루미늄 플레이트에 0.2 μL의 발효 된 과식제를 적재한 다음 헤어 드라이어를 사용하여 건조시십시오.</li>
<li>포름산/n-부탄올/물(6:4:1, v:v:v) 용액의 20 mL로 플레이트를 개발하고 헤어 드라이어를 사용하여 건조시십시오.</li>
<li>오크시놀 시약에 접시를 담그고 염색한 다음 헤어 드라이어를 사용하여 건조시다.<ol>
<li>25 mL의 증류수에 900 mg의 리세놀을 용해한 다음 375 mL의 에탄올을 추가하여 오시놀 시약을 준비하십시오. 그 후, 농축 된 황산을 천천히 첨가하고 용액을 철저히 혼합해야합니다.</li>
</ol>
</li>
<li>베이킹 오븐에서 120°C에서 3분 동안 열판을 가열하고 TLC 밴드를 측정하여 EPS의 열화를 평가합니다.</li>
</ol>7. 인간의 장 내 미생물에 EPS의 효과
<ol><li>4.3단계에서 제조된 본래 배설물 샘플을 동결해 및 5.4단계에서 제조된 발효 시료.</li>
<li>대변 세균 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 모든 샘플에서 세균 게놈 DNA(gDNA)를 추출하여 제조업체의 지시에 따른 다.</li>
<li>미세 분광광도계 및 한천 겔 전기 영동을 사용하여 DNA 농도, 통합및 크기 분포를 결정합니다.</li>
<li>앞서 설명한 다음을 사용하여 추출된 gDNA로부터 세균 16S rRNA 유전자의 PCR을 진행한다12: -포워드 프라이머(바코드 프라이머 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA -리버스 프라이머 (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT 다음 열 사이클러 조건을 사용합니다.<ol>
<li>94 °C에서 5 분.</li>
<li>30s에 대한 94 °C.</li>
<li>30s에 대한 55 °C.</li>
<li>72 °C에서 1 분.</li>
<li>35주기 동안 2-4 반복</li>
<li>72 °C에서 5 분.</li>
<li>열 사이클러에서 제거 될 때까지 4 °C 를 유지하십시오.</li>
</ol>
</li>
<li>초고처리량 미생물 커뮤니티 분석을 사용하여 DNA 시퀀싱 회사에서 PCR 제품의 고처리량 시퀀싱을 수행합니다.</li>
<li>미생물 생태학(QIIME) 서열 분석파이프라인(13)에대한 정량적 통찰력을 사용하여 깨끗하고 고품질의 시퀀스를 구한다.</li>
<li>Mothur 소프트웨어 제품군14와같은 생물정보학 도구를 사용하여 97% 이상의 뉴클레오티드 유사성을 가진 16S rRNA 유전자 서열에 대한 운영 분류학 단위(OTUs)를 정의한다.</li>
<li>각 OTU에서 대표 시퀀스를 선택하고 SILVA 분류 데이터베이스와 함께 RDP 분류기를 사용하여 대표 서열15를분류합니다.</li>
<li>생물정보학도구를사용하여 Good의 커버리지, 알파 다이버시티 메트릭(심슨 및 섀넌 지수 포함) 및 풍부성(OTUs 관찰 수)을 계산합니다.</li>
</ol>8. 인간의 장 내 미생물에 의해 SCFA 생산에 EPS의 효과
<ol><li>5.3~2 mL 원심분리기 튜브에서 제조된 발효 상피제(1 mL)를 첨가한다.</li>
<li>각 시료에 25%(v)의 메타포스포릭산을 0.2 mL 추가하고 와류를 통해 솔루션을 철저히 혼합합니다.</li>
<li>혼합물을 13,000 x g에서 20 분 동안 원심 분리하고 슈퍼 나탄제를 신선한 튜브로 옮니다.</li>
<li>이와 함께, 120 mM 아세틱, 프로피온, 부티릭, 이소부티릭, 발레릭 및 이소발레르산의 용액을 준비합니다. 그런 다음, 준비된 각 산의 1 mL을 25% (v) 메타포스포릭산의 1.2 mL에 넣고 표준 칵테일로 사용하십시오.</li>
<li>0.22 μM 멤브레인을 사용하여 샘플을 필터링합니다.</li>
<li>앞서 설명한 프로토콜11,17에따라 고성능 가스 크로마토그래피를 사용하여 SCFA 농도를 검출합니다. 참고: 불활성캡 FFAP 컬럼(0.25mM x 30m x 0.25 μM)은 가스 크로마토그래피(GC)에 사용됩니다. 그런 다음 GC 솔루션 소프트웨어 패키지의 단일 지점 내부 표준 방법을 사용하여 피크 영역을 기준으로 SCFA 농도를 정량화합니다.</li>
</ol>

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<li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-batch+fermentation+system+to+simulate+human+colonic+microbiota+for+high-throughput+evaluation+of+prebiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics.</a> PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).</li>
<li>Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+analysis+in+rats+with+methamphetamine-induced+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다. 수치는 Yin 외에서 인용되었다. 11.

지난 10년 동안 인간의 장내 미생물 구성과 활동을 이해하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 이러한 연구의 결과로, 홀로비오온 개념은 인간과 그들의 창자 microbiota 사이와 같은 호스트와 관련미생물 군사회사이 상호 작용을 나타내는 19,20. 더욱이, 인간은 지금도 초고생물(21)으로 여겨지고 있으며, 여기서 장내 미생물은 인간22,23에서기능성 기관 중 하나로 인식되고 있다. 인체는 약 10 개의13 미생물 세포(24)로구성된 복잡한 미생물 생태계를 호스팅합니다. 더욱이, 장내 미생물의 게놈은 호스트의 대사 능력을 확장하는 수많은 대사 관련 유전자를 인코딩하는인간으로부...

창자 미생물은 인간의 창자 기능과 숙주 건강에 중요한 역할을 합니다. 따라서, 창자 미생물은 최근 질병 예방 및 치료1의중요한 표적이되었습니다. 또한, 창 자 박테리아 호스트 장 세포와 상호 작용 하 고 기본적인 호스트 프로세스를 조절, 신진 대사 활동을포함 하 여, 영양소 가용성, 면역 체계 변조, 심지어 뇌 기능 및 의사 결정 2,3 . Endobiotics 세균 성 구성 및 창 자 microbiota의 다양성에 영향을 미칠 상당한 잠재력을 가지고. 따라서, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은4,5,6,7,8,9.
생체 윤리 및 경제적 제약으로 인해 생체 내 내 생물 학 및 인간의 창 자 microbiota 사이의 상호 작용을 평가 하기 어렵다. 예를 들어, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 실험은 식품의약품안전청의 허가 없이는 수행할 수 없으며, 자원봉사자 모집은 비용이 많이 듭니다. 따라서 동물 모델은 종종 그러한 조사에 사용됩니다. 그러나, 동물 모델의 사용은 동물-대 인간 관련 지역 사회에서 상이한 미생물 조성물 및 다양성으로 인해 제한된다. 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 탐구하는 대안체외 방법은 배치 배양 실험을 통해서이다.
외다당류(EPS)는 인간의 건강 유지에 크게 기여하는 프리바이오틱스(EPS)(10)이다. 상이한 단당류 조성물 및 구조로 구성된 뚜렷한 EPS는 뚜렷한 기능을 나타낼 수 있다. 이전 분석은 Bif EPS의 조성을 결정하였는데, 이는 현재 연구11에서표적화된 대표적인 xenobiotic이다. 그러나, 호스트 관련 신진 대사 효과 EPS 조성 및 다양성에 관한 고려 되지 않은.
여기에 설명된 프로토콜은 12명의 자원봉사자들로부터 Bif EPS를 발효시키기 위해 배설물 미생물을 사용합니다. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC), 16S rRNA 유전자 높은 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피 (GC)는 EPS와 인간 장 내 미생물 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 조합하여 사용됩니다. 생체 내 실험에 비해이 프로토콜의 뚜렷한 장점은 그것의 낮은 비용과 호스트의 신진 대사에서 방해 효과의 회피. 또한, 설명된 프로토콜은 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 조사하는 다른 연구에서 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 멤브레인 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>샘플 필터링에 사용</td></tr><tr><td>0.4-mm Sieve</td><td>Thermo Fischer</td><td>308080-99-1</td><td>인간 배설물 샘플 준비에 사용</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td><td>Solarbio</td><td>X1010</td><td>컬러 플레이트 준비에 사용</td></tr><tr><td>Acetic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71251</td><td>SCFA 한천용 표준 샘플</td></tr><tr><td></td><td>Solarbio</td><td>YZ-1012214</td><td></td></tr><tr><td>매체 혐기성 챔버</td><td>Electrotek의 구성 요소&nbsp;</td><td>AW 400SG</td><td>박테리아 배양 및 발효</td></tr><tr><td>오토클레이</td>브 <td></td><td>SANYO</td><td>MLS-3750</td></tr><tr><td>Bacto soytone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70178</td> 매체 베이킹 오븐<td>의 구성 요소</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td> 쇠고기 추출물 Solarbio G8270을 <td>가열하고 굽는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>Bifidobacterium longum Reuter</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; 51870&trade;</td><td>박테리아</td></tr><tr><td>담즙 염</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1071304</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>SCFA</td></tr><tr><td>CaCl2</td> <td>Solarbio</td><td>C7250</td><td>소금 용액 용</td></tr> 표준 샘플의 구성 요소 담즙 염 Solarbio C7250 <tr><td></td><td>SHIMADZU-GL</td><td>InertCap FFAP (0.25 mm &times; 30 m &times; 0.25 &mu; m)</td> <td>SCFA 검출에 사용</td></tr><tr><td>Casein Peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39396</td><td>중간</td></tr><tr><td>원심분리기</td>의 구성 요소 <td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 8</td><td>원심분리에 사용</td></tr><tr><td>CoSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>C7490</td><td>중간 CuSO의 구성 요소</td></tr><<tr><td>sub>4.5H2O</td><td>Solarbio</td><td>203165</td> 매체 <td></td></tr><tr><td>Cysteine-HCl</td>의 구성 요소 <td>Solarbio</td><td>L1550</td> 중간 <td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td>의 구성 요소 <td>비타민 K1</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>YZ-111614</td> 중간 <td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich</td>의 구성 요소<td>399388</td><td>TLC</td></tr><tr><td>가스 크로마토 그래</td>피에 사용 <td>Shimadzu Corporation</td><td>GC-2010 Plus</td><td>SCFA 검출에 사용</td></tr><tr><td>유리 비커</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB10050</td><td>슬러리 준비에 사용</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Solarbio</td><td>G8760</td><td>매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>Haemin</td><td>Solarbio</td><td>H8130</td><td>매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>HCl</td><td>의 구성 요소Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>완충액의 pH를 조정하는 데 사용되는 기본 용액</td></tr><tr><td>Isobutyric</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46935-U</td><td>SCFA</td></tr><tr><td>이소발레르산</td>용 표준 샘플 <td>Sigma-Aldrich</td><td>129542</td><td>SCFA</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Solarbio</td><td>D9880</td> 매체 <td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Solarbio</td>의 염 용액<td>P9921</td><td>매체</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Solarbio</td>의 <td>성분 P7392</td><td>매체</td></tr><tr><td>LiCl.3H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8380</td><td>컬러 플레이트 고기 추출물 제조에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>70164</td> 매체 <td></td></tr><tr><td>메타인산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>의 성분</td><td>SCFA</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8160</td><td>매체</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8300</td><td>염 용액</td>LnSO</tr>4 매체 <tr><td></td><td>Illumina</td><td>MiSeq 300PE 시스템</td><td>DNA 염</td></tr>기서열 <tr>분석의 B7350 표준 샘플<td>. H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8179</td><td>매체</td></tr><tr><td>Mupirocin</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1448901</td><td>항생제</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio</td><td>YZ-100376</td><td>매체</td></tr><tr><td>NaHCO의 소금 용액3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td>매체</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-2000</td><td>소금 용액 NanoDrop Technologies</td><td>ND-2000</td><td>DNA 농도 결정</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30620</td><td>완충액의 pH를 조정하는 데 사용되는 염기성 용액</td></tr><tr><td>n-부탄올</td><td>ChemSpider</td><td>71-36-3</td><td>TLC</td></tr><tr><td>NiCl2<</td><td>/sub>Solarbio</td><td>746460</td> 매체 <td></td></tr><tr><td>Orcinol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>447420</td>의 구성 요소 <td>오르시놀 시약을</td></tr> <tr><td>제조하는 데 사용됩니다.Propionic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94425</td><td>SCFA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 대변 미니 키트</td>용 표준 샘플 <td>QIAGEN</td><td>51504</td><td>추출물 박테리아 게놈 DNA</td></tr><tr><td>즉시 사용 가능한 PBS 분말</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A610100-0001</td><td>지질 현탁액을 제조하는 데 사용</td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Solarbio</td><td>R8150</td><td>혐기성 장비</td></tr><tr><td>속도 진공 농축기</td><td>LABCONCO</td><td>CentriVap</td><td>EPS 전분 제조에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Solarbio</td><td>YZ-140602</td><td>탄소원 사용</td></tr><tr><td>황산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>150692</td><td>오르시놀 시약을</td></tr> <tr>제조하는 데 사용<td>T100 PCR</td><td>BIO-RAD 1861096</td><td></td><td>PCR 증폭</td></tr><tr><td>TLC 알루미늄 시트</td><td>MerckMillipore</td><td>116835</td><td>TLC</td></tr><tr><td>Trypticase 펩톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z699209</td><td>매체</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>T7293</td><td>매체의 성분</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Solarbio</td><td>T8360</td><td>매체의 소금 용액</td></tr><tr><td>발레릭</td><td>시그마-알드리치</td><td>75054</td><td>SCFA</td></tr><tr><td>비타민 K1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3501</td><td>표준 샘플 매체</td></tr><tr><td>와류 발진기</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex.Genie2</td><td>사용</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td> 매체 <td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H의 구성 요소2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td>매체의 구성 요소</td></tr></tbody></table>

체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

인간의 장내 미생물은 최근 인간의 건강을 증진하고 질병을 예방하는 연구의 중요한 대상이되었습니다. 따라서, endobiotics 사이 상호 작용의 조사 (예를 들어, 마약과 prebiotics) 그리고 창 자 microbiota 중요 한 연구 주제가 되고있다. 그러나, 인간 자원 봉사자와 생체 내 실험은 생물 윤리 및 경제적 제약으로 인해 이러한 연구에 이상적이지 않습니다. 그 결과, 동물 모델은 생체 내에서 이러한 상호작용을 평가하는 데 사용되어 왔다. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델 연구는 여전히 생물 윤리 고려에 의해 제한 됩니다., 동물 대 인간에서 microbiota의 다른 조성및 다양 성 뿐만 아니라. 대체 연구 전략은 시험관내 내생생물학과 장내 미생물 간의 상호 작용을 평가할 수 있는 일괄 발효 실험의 사용입니다. 이러한 전략을 평가하기 위해, 비피도박테리아(Bif) 외다당류(EPS)를 대표적인 제노바이오틱으로 사용하였다. 그 후, Bif EPS와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은 16S rRNA 유전자고 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피와 같은 얇은 층 크로마토그래피(TLC), 세균 공동체 조성 분석과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 조사되었습니다. 짧은 사슬 지방산 (SCFA)의. 여기에 제시된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다. 중요 한 것은, 이 프로토콜은 또한 다른 endobiotics와 창 자 microbiota 사이 일반적인 상호 작용을 조사 하기 위해 수정될 수 있습니다.

점막 EPS의 생산은 72 시간 동안 혐기성 배양 후 PYG 플레이트에 대한 B. longum 배양물에서 관찰 될 수있다 (도1A). 배양 스크레이프의 원심분리, 에탄올 침전 및 건조에 이어, 셀룰로오스유사 EPS의수집을 초래하였다(도 1B). 건조된 EPS 및 수용성 전분은 발효 배양용 탄소 공급원으로 사용되었습니다. TLC는 낮은 비용과 신속한 결과 턴어라운드로 인해 올리고당 분리 및 순도 분석에 사용되었다18. 인간 배설물 미생물에 의한 전분의 분해 속도는 Bif EPS(그림2)보다 빠르지만, 일부 EPS 접종 샘플에 대해 Bif EPS 분해가 명확하게 관찰되었다.
16S rRNA 유전자를 통한 커뮤니티 조성 분석 고처리량 시퀀싱 및 주요 좌표 분석(PCoA...

여기서 설명된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다.

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

우리의 프로토콜은 인체 생물학과 인간 창자 microbiota 사이 상호 작용의 높은 처리량 그리고 급속한 검열을 위해 넓게 이용될 수 있습니다. 낮은 비용과 호스트의 신진 대사에서 간섭 효과의 회피. 이 절차는 진단에 사용될 가능성이 있습니다.첫째, BIF EPS를 용해하고 자기 교반기의 뜨거운 물에 개별적으로 전분을 녹여 리터 당 8 그램의 농도를 모두 만듭니다. 준비된 기본 배양 매체 VI에서 BIF EPS 솔루션 100밀리리터를 추가하여 배양 VI BIF 솔루션을 만듭니다. 배양 VI 전분 솔루션을 만들기 위해 전분 솔루션의 100 밀리리터를 추가합니다.탄소원으로 두 개의 미디어를 오토클레이브하고 탄소원이 없는 매체는 15분 동안 섭씨 121도에서 제어합니다. 실온으로 식히고 건초와 시스테인을 추가하십시오. 각 배지의 5밀리리터의 하위 샘플을 배양 튜브로 전송합니다.그리고 혐기성 인큐베이터에 보관하십시오. 나머지 미디어를 섭씨 4도에 저장합니다. 인간의 배설물 시료를 준비하기 위해 신선한 배설물 샘플 1그램을 0.1 의 어음 혐기성 PBS 10밀리리터로 유리 비커로 pH 7에 옮킨다.그런 다음 유리 막대를 사용하여 슬러리를 만드시게 합니다. 혐기성 챔버에서 필터링 된 배설물 슬러리의 500 마이크로 리터를 개별적으로 세 가지 준비 된 발효 매체에 추가하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 배양하십시오.24 시간 48 시간 후에 혐기성 챔버에서 발효 시료 2 밀리리터를 수집하십시오. 그리고 챔버 외부원심분리기는 6000회 G로 3분간. 수퍼네이션을 다당증 분해 분석 및 짧은 사슬 지방산 측정에 사용할 새로운 원심분리기 튜브로 조심스럽게 전달합니다.원심 분리 펠릿을 섭씨 80도에 보관하십시오. 발효 된 슈퍼 나티츠의 0.2 마이크로 리터를 각 미리 코팅 된 실리카 젤 60 TLC 알루미늄 플레이트에 적재하고 확산됩니다. 그런 다음 뜨거운 공기가있는 헤어 드라이어를 사용하여 건조하십시오.샘플링된 플레이트의 한쪽 끝을 포믹산의 20 밀리리터에 담근다: n-butanol:물 용액은 전기포고가 거의 다른 쪽 끝까지 확장될 때까지 몇 분 동안 한다. 그런 다음 집게로 접시를 꺼내 헤어 드라이어로 말립니다. 그런 다음 오시놀 시약에 접시를 담그고 2 분간 염색합니다.다시 건조. 접시를 120°C의 베이킹 오븐에 옮기고 3분간 가열합니다. 그런 다음 TLC 대역을 측정하여 EPS의 분해를 평가하기 위해 접시의 사진을 찍습니다.SCFA 생산에 대한 EPS의 효과를 연구하려면 발효 된 수퍼나티1 밀리리터를 2 밀리리터 원심분리기 튜브에 추가하고 각 샘플에 메타포스포릭 산의 무게 /볼륨 퍼센트 25 밀리리터를 추가하십시오. 소용돌이가 솔루션을 철저히 혼합합니다. 혼합물을 13, 000배 G에서 20분간 원심분리합니다.한편, 튜브에 120 밀리머 아세스틱, 프로피오닉, 부티릭, 이소부티릭, 발릭 및 이소발성산의 용액을 준비한다. 그런 다음 25 중량/부피 퍼센트 메타포스포릭 산의 1.2 밀리리터를 포함하는 튜브에 각 준비된 산의 1 밀리리터를 추가합니다. 그리고 표준 칵테일로 가스 크로마토그래피 기기의 샘플 병에 로드합니다.원심분리기에서 튜브를 꺼내 서너너타지를 신선한 튜브로 옮기십시오. 0.22 미크론 필터가 장착된 주사기를 사용하여 기체 크로마토그래피 분석을 위해 수퍼네티츠를 새로운 튜브로 필터링합니다. 본 연구에서는, 점막 EPS의 생산은 72시간 동안 혐기성 인큐베이션 후 PYG 플레이트에 있는 bifidobacterium 긴 배양에서 관찰되었다.배양 스크랩의 원심 분리, 에탄올 침전 및 건조, 셀룰로오스 와 같은 EPS의 수집 결과. TLC 분석은 인간 대변 microbiota에 의하여 전분의 분해 비율이 BIF EPS의 그것 보다는 더 빠르다는 것을 밝혔습니다. 수석 좌표 분석은 배양 VI BIF와 배양 VI 전분 그룹이 서로 별도로 클러스터되어 EPS와 전분 가용성이 인간 배설물 세균 계를 차별화한다는 것을 나타냅니다.효과 크기에 대한 선형 차별 분석은 제네라 콜린젤라, 코로코커스, 파라박테로이드 및 진도균이 배양 VI 전분 샘플보다 배양 VI BIF 샘플에서 훨씬 더 풍부했다는 것을 나타낸다. 또한, GC 측정은 아세스틱, 프로피오닉, 이소부티릭, 부티릭, 이소발릭 및 발레산이 포함된 발효 배양에서 측정된 SCFA를 보여줍니다. 24시간 48시간 동안 발효한 후, 6개의 SCFA 농도 중 5개는 유사하고 배양 VI BIF, 배양 VI 전분 및 배양 VI 그룹 간에 통계적으로 다르지 않았다.그러나, 프로프리오닉산 농도는 48시간의 발효 후 배양 VI 전분 군보다 배양 VI BIF 군에서 상당히 높았다. 혐기성 조건하에서이 실험을 수행 한 다음 고정 된 샘플을 가능한 한 빨리 혐기성 인큐베이터로 옮기습니다. 일부 TLC 시약은 위험합니다.당신은 그들을 사용하는 주의해야한다.

analysis-interactions-between-endobiotics-human-gut-microbiota-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 아흐마디, S. 외. 인체 대변 미생물군에 대한 중재적 요법의 효과를 추정하기 위한 시험관 내 배치 배양 모델. J. Vis. 경험 (2019).이 영상은 식이 발효성 섬유를 배양하여 장내 미생물 미생물의 대사물 생성을 연구하기 위해 장내 미생물 발효를 모델링하는 방법을 시연합니다.

시험관 내 인간 장내 미생물군에 의한 대장 발효를 모방하는 배치 배양 모델

출처: Hu, Y. 외. 시험관 욕조 발효 시스템을 이용한 내생제와 인간 장내 미생물 간 상호작용 분석. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 인간 대변 미생물군에 의한 외계다당류(EPS) 분해를 평가하기 위해 얇은 층 크로마토그래피(TLC)를 사용하는 방법을 시연합니다. 발효 상청액의 EPS 조각은 크기와 극성에 따라 TLC를 사용해 분리한 후, 탄수화물 특이적 염색 후 색이 있는 띠로 시각화됩니다.

박테리아 외계다당류 분해를 평가하기 위한 얇은 층 크로마토그래피 수행

출처: Hu, Y. et.al., 시험관 욕조 발효 시스템을 이용한 내도생제와 인간 장내 미생물군 간 상호작용 분석. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 외계다당류에 반응하여 인간 장내 미생물군이 단쇄 지방산 생성을 분석하는 과정을 보여줍니다. 이 연구는 가스 크로마토그래피를 이용한 미생물 발효물 분리 및 정량화를 강조합니다. 결과는 외다당류가 장내 숙주-병원체 역학에 영향을 미치는 미생물 대사산물을 조절한다는 것을 보여줍니다.

외계다당류에 대한 인간 장내 미생물 활성 조사

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MBRA(Minibioreactor Array)는 복잡한 미생물 군집의 배양을 가능하게 하는 고처리량, 맞춤형 연속 흐름 배양 시스템으로, 마이크로바이옴 역학, 치료 상호 작용 및 환경 요인에 대한 미생물 반응을 연구하기 위한 병렬 실험을 지원합니다.

Minibioreactor Array(MBRA)의 조립 및 사용을 위한 업데이트된 프로토콜

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체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석

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