체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석

우리의 프로토콜은 인체 생물학과 인간 창자 microbiota 사이 상호 작용의 높은 처리량 그리고 급속한 검열을 위해 넓게 이용될 수 있습니다. 낮은 비용과 호스트의 신진 대사에서 간섭 효과의 회피. 이 절차는 진단에 사용될 가능성이 있습니다.

첫째, BIF EPS를 용해하고 자기 교반기의 뜨거운 물에 개별적으로 전분을 녹여 리터 당 8 그램의 농도를 모두 만듭니다. 준비된 기본 배양 매체 VI에서 BIF EPS 솔루션 100밀리리터를 추가하여 배양 VI BIF 솔루션을 만듭니다. 배양 VI 전분 솔루션을 만들기 위해 전분 솔루션의 100 밀리리터를 추가합니다.

탄소원으로 두 개의 미디어를 오토클레이브하고 탄소원이 없는 매체는 15분 동안 섭씨 121도에서 제어합니다. 실온으로 식히고 건초와 시스테인을 추가하십시오. 각 배지의 5밀리리터의 하위 샘플을 배양 튜브로 전송합니다.

그리고 혐기성 인큐베이터에 보관하십시오. 나머지 미디어를 섭씨 4도에 저장합니다. 인간의 배설물 시료를 준비하기 위해 신선한 배설물 샘플 1그램을 0.1 의 어음 혐기성 PBS 10밀리리터로 유리 비커로 pH 7에 옮킨다.

그런 다음 유리 막대를 사용하여 슬러리를 만드시게 합니다. 혐기성 챔버에서 필터링 된 배설물 슬러리의 500 마이크로 리터를 개별적으로 세 가지 준비 된 발효 매체에 추가하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 배양하십시오.

24 시간 48 시간 후에 혐기성 챔버에서 발효 시료 2 밀리리터를 수집하십시오. 그리고 챔버 외부원심분리기는 6000회 G로 3분간. 수퍼네이션을 다당증 분해 분석 및 짧은 사슬 지방산 측정에 사용할 새로운 원심분리기 튜브로 조심스럽게 전달합니다.

원심 분리 펠릿을 섭씨 80도에 보관하십시오. 발효 된 슈퍼 나티츠의 0.2 마이크로 리터를 각 미리 코팅 된 실리카 젤 60 TLC 알루미늄 플레이트에 적재하고 확산됩니다. 그런 다음 뜨거운 공기가있는 헤어 드라이어를 사용하여 건조하십시오.

샘플링된 플레이트의 한쪽 끝을 포믹산의 20 밀리리터에 담근다: n-butanol:물 용액은 전기포고가 거의 다른 쪽 끝까지 확장될 때까지 몇 분 동안 한다. 그런 다음 집게로 접시를 꺼내 헤어 드라이어로 말립니다. 그런 다음 오시놀 시약에 접시를 담그고 2 분간 염색합니다.

다시 건조. 접시를 120°C의 베이킹 오븐에 옮기고 3분간 가열합니다. 그런 다음 TLC 대역을 측정하여 EPS의 분해를 평가하기 위해 접시의 사진을 찍습니다.

SCFA 생산에 대한 EPS의 효과를 연구하려면 발효 된 수퍼나티1 밀리리터를 2 밀리리터 원심분리기 튜브에 추가하고 각 샘플에 메타포스포릭 산의 무게 /볼륨 퍼센트 25 밀리리터를 추가하십시오. 소용돌이가 솔루션을 철저히 혼합합니다. 혼합물을 13, 000배 G에서 20분간 원심분리합니다.

한편, 튜브에 120 밀리머 아세스틱, 프로피오닉, 부티릭, 이소부티릭, 발릭 및 이소발성산의 용액을 준비한다. 그런 다음 25 중량/부피 퍼센트 메타포스포릭 산의 1.2 밀리리터를 포함하는 튜브에 각 준비된 산의 1 밀리리터를 추가합니다. 그리고 표준 칵테일로 가스 크로마토그래피 기기의 샘플 병에 로드합니다.

원심분리기에서 튜브를 꺼내 서너너타지를 신선한 튜브로 옮기십시오. 0.22 미크론 필터가 장착된 주사기를 사용하여 기체 크로마토그래피 분석을 위해 수퍼네티츠를 새로운 튜브로 필터링합니다. 본 연구에서는, 점막 EPS의 생산은 72시간 동안 혐기성 인큐베이션 후 PYG 플레이트에 있는 bifidobacterium 긴 배양에서 관찰되었다.

배양 스크랩의 원심 분리, 에탄올 침전 및 건조, 셀룰로오스 와 같은 EPS의 수집 결과. TLC 분석은 인간 대변 microbiota에 의하여 전분의 분해 비율이 BIF EPS의 그것 보다는 더 빠르다는 것을 밝혔습니다. 수석 좌표 분석은 배양 VI BIF와 배양 VI 전분 그룹이 서로 별도로 클러스터되어 EPS와 전분 가용성이 인간 배설물 세균 계를 차별화한다는 것을 나타냅니다.

효과 크기에 대한 선형 차별 분석은 제네라 콜린젤라, 코로코커스, 파라박테로이드 및 진도균이 배양 VI 전분 샘플보다 배양 VI BIF 샘플에서 훨씬 더 풍부했다는 것을 나타낸다. 또한, GC 측정은 아세스틱, 프로피오닉, 이소부티릭, 부티릭, 이소발릭 및 발레산이 포함된 발효 배양에서 측정된 SCFA를 보여줍니다. 24시간 48시간 동안 발효한 후, 6개의 SCFA 농도 중 5개는 유사하고 배양 VI BIF, 배양 VI 전분 및 배양 VI 그룹 간에 통계적으로 다르지 않았다.

그러나, 프로프리오닉산 농도는 48시간의 발효 후 배양 VI 전분 군보다 배양 VI BIF 군에서 상당히 높았다. 혐기성 조건하에서이 실험을 수행 한 다음 고정 된 샘플을 가능한 한 빨리 혐기성 인큐베이터로 옮기습니다. 일부 TLC 시약은 위험합니다.

당신은 그들을 사용하는 주의해야한다.