Name: הזרקת גרללוס ביצי ביצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: למדו את פרוטוקול הזרקת ביצי גרללוס לחקר ביולוגיה התפתחותית ומניפולציה גנומית. שיטה זו מספקת בסיס לניסויים ב-RNAi ומחקרי עוברים בחסרי חוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקרים שדווחו בפרויקט זה נתמך על ידי פרס פיתוח מוסדי (רעיון) מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר מענק P20GM10342 כדי HH3, ועל ידי NSF מספר הפרס IOS-1257217 . בסדר.

<ol><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+August+Krogh+principle%3A+%E2%80%9CFor+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+B%3A+Molecular+and+Developmental+Evolution%22%5BJournal%5D)">The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
<li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+F+%22Cricket+neurobiology+and+behavior%22">Cricket neurobiology and behavior</a>. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).</li>
<li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorch%2C+HW+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22">The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior</a>. , Springer. Tokyo. (2017).</li>
<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017(2012).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li>
<li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory%3A+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885(2015).</li>
<li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+in+the+Cricket%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+the+Cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing+in+Animals%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li>
<li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch%2FDelta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li>
<li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Wingless%2FArmadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus+%28Orthoptera%29%2C+as+revealed+by+RNAi+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li>
<li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).</li>
<li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li>
<li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).</li>
<li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li>
<li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li>
<li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+and+tails%3A+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li>
<li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomical+Techniques%3A+Insect+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שני האתגרים העיקריים עם טכניקה זו הם הנושאים הקשורים של גודל מחט אופטימלית ושרידות. למרות מחטים קטנות לשפר את ההישרדות, מחטים עם צר לומן יש מידה רבה יותר של כוחות קפילר בעבודה, מה שהופך אותו סביר יותר כי החלמון יהיה לעבור לתוך המחט גורמת לו לסתום. במקרה הטוב, ניתן לנקות חסימות פשוט על-ידי הזרקת ביצה אחרת או על-ידי ניקוי המחט כמתואר לעיל. אפשר גם לנסות להגביר את לחץ המאזן על מיקרו מזרק עד החלמון הוא דחף מתוך המחט. האתגר העיקרי השני עם טכניקה זו הוא הישרדות. בידינו, שיעורי ההישרדות עבור ביצים מוזרק עם פתרונות ניסיוניים הם ...

היכולת לשנות את הגנום או השפעה הביטוי הגן באורגניזמים הוא הבסיס לעיצוב של סוגים רבים של ניסויים בדיקת סיבתיות תפקודית. הוא גם קריטי לעבודה השוואתית ואבולוציונית הרלוונטית שטכניקות שינוי גנומית ושאינן גנוגנות יהיו זמינות באורגניזמים מחוץ למערכות מודל גנטיות מסורתיות בעלי חיים מעבדה (למשל, Mus מוסקולוס, דניו ראריו, דרוזופילה מלאנוגסטר, ואלבורחבאבדיטיס. בין אם מדובר ברצון להבין את הגיוון האורגאיאלי1 או את הדבקות בעיקרון של krogh, כי עבור כל שאלה ביולוגית יש אורגניזם המתאים ביותר לפתרון2,3, היכולת לשנות גנום או השפיע על ביטוי הגנים חיוני לעיצובים ניסיוניים מודרניים.
הצרצר הקריקט הוא מערכת מודל המתעוררים. במהלך המאה האחרונה בניסויים נוירואתולוגיה4, שני העשורים האחרונים היו עדים לעניין ניסיוני מוגבר בקריקט, התמקד בעיקר באבולוציה ובהתפתחות של האורגניזם הזה5. הצרצר הוא חרק מיני המסתעף בholometabolous לחרקים בעלי לימודים היטב, כגון ד. מלאנוגסטר וטריבוליום6. בשל עמדתה השימושית על העץ האבולוציוני, מדענים מעוניינים לשאול שאלות נסיוניות מודרניות ומתוחכמות בחרק זה, אשר הוביל לעניין הולך וגובר בהתאמת כלים מולקולריים לשימוש ב -G. בימרו.
זריקות של ריאגנטים מולקולרי לתוך ביצי קריקט יכול לשמש ניסויים שינוי גנומית, כמו גם מניפולציות שאינן גנומית של הביטוי גנים העוברים. לדוגמה, הטרנסגניים G. בימרו על נושאים הוספות egfp נוצרו באמצעות הטרנספססה 7,8. החוקרים יצרו בהצלחה את הנוקאאוט G. בימרו שימוש בנוקלאוסים לאצבעות אבץ (ZFNs) ותמלול activator-כמו (טל) (talens) כדי להחדיר כפול תקוע הפסקות באזורים גנומית ספציפיים9. למרות ZFNs ו TALENs לאפשר פילוח ספציפי לאתר בעלי חיים מעבר מערכות ארבע מודל גדול, אלה ריאגנטים במהירות העלתה על ידי CRISPR/Cas9 system, אשר פשוט לשימוש, יעיל יותר, וגמיש מאוד10. Crispr שימש ב -G. בימרו כדי לייצר נוק אאוט11 , כמו גם להקיש על קווים12,13 בנוסף שינוי גנומית, dsrna ניתן להזריק ביצים כדי להפיל ביטוי mrna בפיתוח עוברים, המאפשרים לחוקרים להבין את התפקיד של תעתיקים ספציפיים במהלך פיתוח14,15. כמה פרטים מוגבלים על איך להזריק ביצי קריקט פורסמו בעבר12.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להזרקת ביצים מוקדמות. פרוטוקול זה יעיל וניתן בקלות להתאמה להגדרות מעבדה שונות, חומרי הזרקה, ואולי חרקים אחרים. בעוד פרטים נוספים עבור עיצוב ויישום של שינוי גנומית וניסויים בהוצאת מפורסמים פורסמו במקומות אחרים12,13, גישות אלה בסופו של דבר להסתמך על פרוטוקול ההזרקה מפורט כאן.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ חיתוך פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>סטריאומיקרוסקופ עם פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מקור אור חיצוני לפלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Narishige</td><td>IM-300-אביזרים</td> <td>עשויים לכלול מחזיק מחטי הזרקה, צינור כניסה (עם מחבר צינור), כבל מתח AC, מתג רגל, אטם גומי סיליקון-קוביית</td></tr> <tr><td></td><td>מסנן mCherryקוביית סינון Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td>עבור mCherry או צבע אדום דומה תעבוד</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>בשימוש עם מעמד מגנטי (Narishige, סוג GJ-8)</td></tr> <tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק פיפטה (מחזיק מחט)</td> צינורות <td>Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>לחיבור מקור אוויר למיקרו-מזרק</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביצה חותמת באר</td><td>תלת מימד מודפס</td><td>תלת מימד מותאם אישית</td><td>מודפס על Lulzbot Taz 5 באמצעות תרמופלסטי חומצה לקטית פולי לקטית</td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור שונים או חדר מבוקר טמפרטורה</td> טמפרטורות <td>שונות</td><td></td><td>של 23.5-26 מעלות; C נחוצים.</td></tr><tr><td>מזון צרצרים</td>, <td>מזון חתולים שונים או פתיתי דגים הם מזון מתאים.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים צרצרים</td><td></td><td></td><td>ניתן להחזיק מים בבקבוקונים ולהציג אותם לצרצרים באמצעות כדורי צמר גפן</td></tr><tr><td>מקלט קריקט</td><td>חומרי</td><td>מקלט יכולים לכלול מגבות נייר מקומטות או קרטוני ביצים</td>צינורות נימי זכוכית World Precision Instruments, Inc.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>פריט מס' 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&trade; נימי זכוכית בורוסיליקט, אורך 100 מ"מ, 0.58 מ"מ ID, 1.0 מ"מ OD, עם</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td> נימה <td>Flaming/Brown</td><td>דגם P-97</td><td>המופץ על ידי Sutter Instrument Co.</td></tr><tr><td>מטחנת Beveller/Micro</td><td>Narishige</td><td>דגם EG-45/EG-400</td><td>EG-400 כולל ראש מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>CellTreat</td><td>קוד מוצר 229693</td><td>קוטר 90 מ"מ</td></tr><tr><td>Play Sand</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td></td><td>B003U6QLVS חול משחק לבן</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>AB000972 ביואנליטי אמריקאי</td><td></td><td>Agarose GPG/LE מסננת ביצים אולטרה-טהורה</td></tr><tr><td>: מסננות חרוטיות רשת אריג עדינה במיוחד נירוסטה</td><td></td><td>אספקת מטבח דגם SS-C123</td><td>גודל הנקבוביות צריך להיות בין 0.5 - 1.0 מ"מ</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>Ref 15070-063</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מפלסטיק Pen Strep</td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>שחור סטטי מפזר, מסנני מזרק 118 מ"מ</td></tr><tr><td>, קוטר 25 מ"מ, 0.45 ומיקרו; m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td><td>השתמש עם מזרק 1 מ"ל</td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל, עם קצה החלקה של טוברקולין</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>השתמש עם מסנן מזרק לסינון מאגר הזרקה, מזרקי קצה Luer-Lok יעבדו גם</td></tr><tr><td>מיכל אוויר (אופציונלי)</td> <td>מוצרי המערב התיכון</td><td>Air Works&reg;</td><td>מיכל אוויר נייד</td></tr><tr><td>צבע רודמין</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>דקסטרן, טטרמתילרודמין 10,000MW,</td></tr> <tr><td>20 מ"ל טיפים לטעינה</td><td>Eppendorf</td><td>מס' הזמנה 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &mu; L מיקרו-מטען</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרכובת</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 פלוס</td><td></td></tr><tr><td>20x אובייקטיבי</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite&nbsp; תוכנה</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>גרסה 4.6.2 בשימוש כאן</td></tr></tbody></table>

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

שינוי תפקוד הגנים באורגניזם מתפתח הוא מרכזי סוגים שונים של ניסויים. בעוד כלים גנטיים מאוד חזק פותחו במערכות מודל מסורתיות, קשה לתמרן גנים או שליח RNA (mRNA) ברוב האורגניזמים האחרים. במקביל, גישות אבולוציונית והשוואתית להסתמך על חקר של תפקוד גנטי במינים שונים רבים, המחייב פיתוח והסתגלות של טכניקות לתמרן הבעה מחוץ כרגע מעוקב גנטי ינים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להזרקת ריאגנטים לתוך ביצי קריקט כדי לעבד את ההשפעות של מניפולציה נתונה על התפתחות עובריים או זחל. הוראות כיצד לאסוף ולהזריק ביצים עם מחטים משופע מתוארים. הטכניקה הפשוטה יחסית היא גמישה ועשויה להיות מתכווננת לחרקים אחרים. אפשר לאסוף ולהזריק עשרות ביצים בניסוי אחד, ושיעורי ההישרדות לזריקות מאגר בלבד לשפר עם התרגול יכול להיות גבוה כמו 80%. טכניקה זו תתמוך מספר סוגים של גישות ניסיוני כולל הזרקה של סוכני תרופתי, ב-mRNA מתורבת לבטא גנים של עניין, כפול תקוע RNA (dsRNA) כדי להשיג הפרעות RNA, השימוש באשכולות באופן סדיר במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR) בקונצרט עם CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) ריאגנטים עבור שינוי גנומית, ורכיבים טרנספראבל כדי ליצור קווי טרנסגניים ארעי או יציב.

הצרצרים מניחים בקלות ביצים בחומר הלח, ומספקים חומר מתאים, כגון חול לח או עפר, הגורם להם להטיל מספר גדול של ביצים. זה יעיל במיוחד אם הצרצרים מונעים הראשון של חומר הנחת ביצה עבור 8-10 h. ביצים הונחו בחול נקי ניתן להפריד בקלות, נאסף (איור 1B) והניח לתוך מותאם אישית מעוצב ביצים בארות עבור הזרקה (איור 1b). ניתן להשתמש במיקרוסקופ מבתר, במיקרומזרק, ובמיקרומניפולציה (איור 1A) להזרקת ביצים בודדות עם מגוון חומ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

טכניקה זו משמשת כשיטה בסיסית לניסויים שנועדו להתוות את ההתפתחות העוברית או הזחלית של הקריקט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא גמישה ותתמוך במספר סוגים של גישות ניסיוניות, כגון אלה המנצלות הפרעות RNA או מניפולציה גנומית. הדגימה להליך תהיה האדלי וילסון הורץ', החוקרת הראשית במעבדה.כדי להתחיל בהליך זה הרטיב את מישור המטחנה המסתובב של השבל עם מים נוטפים. מניחים את המחט שנמשכה לתוך המשפר ומסובבים אותה לזווית של 20 מעלות. מנמיך את המחט עד שהיא נוגעת בצלחת השחזה ומקסים אותה לשתיים עד שלוש דקות.להעריך את שיפוע על ידי הנחת המחט משופע על קלטת מקל כפול כי כבר דבק שקופית מיקרוסקופ זכוכית. מקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ מורכב המצויד במצלמה ובתוכנות לרכישת תמונות. לרכוש תמונה של המחט באמצעות מטרה 20x.השתמש בתוכנת ההדמיה כדי למדוד את קוטר לומן הפנים של המחט רק קרוב לפתיחה משופעת. השלך מחטים עם פתח קטן משמונה מיקרומטר או גדול מ-12 מיקרומטר. ראשית, להכין 40 מיליליטר של 1% agarose במים ויוצקים אותו לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ.מניחים חותמת ביצה היטב על פני השטח של agarose לפני שהוא מתגבש. לאחר התעוררות הוא התגבש, להסיר את החותמת כדי לחשוף את בארות. לאחר מכן, מלאו את צלחת הבאר עם HBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין.מניחים את המכסה על המנה, עוטפים אותה בפרפילם ומאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למלא צלחת פטרי 35 מילימטר עם חול מגרש משחקים לבן כדי להפוך את צלחת איסוף ביצים עבור הצרצרים להטיל ביצים. מכסים את צלחת הביצה עם ריבוע מגבת נייר חתוך כ 18 על 18 ס"מ.מלאו במי ברז דרך מגבת הנייר. לאחר מכן, להטות את צלחת פטרי בעדינות לסחוט את החלק העליון כדי להסיר מים עודפים. מניחים את הפינות של ריבוע מגבת הנייר מתחת לצלחת ומניחים את צלחת הביצה במכסה הפוך אשר יסייע לשמור על מגבת הנייר במקום.מניחים את צלחת הביצים לתוך פח הקריקט ומאפשרים לנקבות הבוגרות לביצת את הביציות במשך שעה עד שעתיים. בינתיים, לאפשר את צלחת אגרוז להתחמם לטמפרטורת החדר לקראת החזקת הביצים להזרקה. כאשר מוכן, להסיר את צלחת איסוף הביצים, עכשיו המכיל ביצים טריות, מפח הקריקט.מוציאים את מגבת הנייר ומניחים מסננת בגודל נקבובית בין 0.5 למילימטר אחד מעל מקור. שוטפים את תכולת צלחת הטלת הביצים לתוך מסננת תחת מי ברז זורמים בעדינות. גרגרי החול ייפלו דרך רשת מסננת לתוך המק מתחת בעוד ביצי קריקט להישאר בסל מסננת.ממלאים מיכל במים הפוכים של אוסמוזה וממקמים אותו במגש. הפוך את מסננת מעל המיכל והקש אותו על המנה כדי לנתק את הביצים למים. הביצים ישקעו לתחתית המיכל.לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את הקצה את קצה פיפטה P1000 כדי להפוך את הפתיחה כשלושה מילימטרים קוטר. מניחים את הטיפ הזה על צינור P1000, ולהשתמש בו כדי להעביר את הביצים מן המיכל לצלחת תבניות ביצה אגרוז. בעזרת פינצטה מפלסטיק, מרווים את הביצים בארות אגרוז.כל ביצה תשקע לתחתית באר בודדת. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה עד מוכן להזריק. כדי להתחיל, מניחים את צלחת הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתח ולבחור הגדלה נמוכה של סביב 10x.צייר 1.5 microliters של פתרון הזרקה באמצעות 20 טיפים טעינה microliter ו פיפטה P10 ולהכניס את קצה הטעינה לתוך הקצה הרחב של מחט ההזרקה. לגרש את פתרון ההזרקה לתוך מחט ההזרקה. הכנס את המחט לתוך דיור ההזרקה ולהדק, לוודא כי המחט מוכנס כראוי בחוזקה לתוך הדיור.ואז בזהירות להכניס את דיור ההזרקה לתוך micromanipulator, נזהר לא לשבור או להיפגע על ידי המחט. תוך כדי התבוננות הן בביצים והן במחט דרך המיקרוסקופ, הזז את המחט ליד ה- X בפינה השמאלית העליונה של רשת הכלים. מנמיכים את המחט עד שהטיפ נכנס ל- HBS בתוספת פתרון אגירת פניצילין סטרפטומיצין בצלחת.מרכזים את המחט בשדה הראייה ומזיזים את צלחת הביצה כך המחט היא כמה מילימטרים קרוב יותר לקצה המנה מאשר הביצים. לאחר מכן, הגדר את המיקרוסקופ למסנן המתאים לרודאמין כדי לבחון את הפלואורסצנטיות במחט ולהתמקד בקצה שלה. על microinjector לאט להפוך את ידית האיזון בכיוון השעון עד פתרון ההזרקה מתחיל לדלוף מתוך המחט לתוך פתרון ההשעיה.ואז להפוך את הידית לאחור נגד כיוון השעון מעט עד הצבע פשוט מפסיק לדלוף מתוך המחט. עם המחט עדיין מרוכז בשדה הנוף, להזיז את צלחת הביצה, כך המחט מכוונת הביצה להיות מוזרק הראשון. התאימו את ההגדלה ל-50x כדי שבצה אחת תמלא את רוב שדה המבט.השתמש הן micromanipulator ואת היד של אחד על צלחת הביצה כדי להזיז את המחט למקומו להזרקה. השתמש micromanipulator כדי לקדם את המחט ולהכניס את הקצה לתוך הביצה הראשונה להיות מוזרק, הקפד להכניס את המחט ב 20 עד 30% של אורך הביצה מהקצה האחורית של הביצה בניצב לציר הארוך של הביצה. להזריק את הפתרון עם דוושת רגל ההזרקה או כפתור ההזרקה על microinjector.בולוס קטן של חומר פלואורסצנטי בתוך הביצה יצביע על זריקה מוצלחת. לאחר מכן, לסגת המחט מהביצה. אם הביצה מורמת שלא במתכוון מה בארה שלה עם נסיגת המחט, השתמש במטליות קטנות כדי לדחוף את הביצה בחזרה לתוך באר תוך נסיגת המחט.במחקר זה, ביצי קריקט מוזרקות באמצעות טכניקה המשמשת כשיטה בסיסית בניסויים רבים, כולל אך לא מוגבל, הפרעות RNA ומניפולציה גנומית. שיעור ההישרדות הוא פרמטר חשוב אחד להערכת ההצלחה של ניסוי זה. רוב הביצים המתות ניתן לזהות בקלות על ידי ראייה כמו חלמון רקמה עוברית בתוך הביצה מתחילים להצמיע בצורה לא אחידה, ובסופו של דבר רוב החלמון ינדדו לצד אחד של הביצה.כאשר העריכו לאחר ארבעה עד שישה ימים, יותר מ 85% של ביצים uninjected שרדו, בעוד ביצים מוזרק עם רייגנטים ניסיוניים בדרך כלל היה שיעור הישרדות נמוך יותר. שליטה על כל ההיבטים של הזריקה עצמה, כולל ניקור מחט, כניסתה של צבע חיץ, או נוכחות של רכב או RNA תקוע כפול, נדרש כדי להבין את ההשפעות האמיתיות של ניסיון המניפולציה הניסיונית. האופן שבו אדם מעריך את התוצאות הפנוטיפיות של ההזרקה תלוי במה שהוזרק.לדוגמה, שינויים פנוטיפיים כתוצאה מנפילות mRNA ספציפיות עשויים להיות ברורים ברמת האנטומיה הגולמית. אם מצד שני cDNA קידוד EGFP מתויג histone 2B גן תחת שליטתו של מקדם ACTIN G.bimaculatus מוכנס לתוך הגנום קריקט באמצעות טרנספוזאז חזירון, ניתן לדמיין כל גרעין בביצה באמצעות פלואורסצנטיות כדי לרגש את EGFP מתויג היס 2B חלבון. התאמת האיזון כך המחטים לא לסתום הוא צעד קריטי בהליך זה.ייתכן שיהיה עליך לבצע מספר התאמות לאחר זריקות עוקבות מאז חלמון לפעמים סותם את קצה המחט. הצרצר הוא חרק hemimetabolous כי ענפים בזלת חרקים holometabolous למד היטב כגון Drosophila. לימוד התפתחות קריקט יעזור לנו להבין יותר על האבולוציה וההתפתחות ברחבי ממלכת החי.טכניקה זו דורשת תרגול מסוים. אנו ממליצים לתרגל זריקות בקרה עד שיעור ההישרדות ארבעה או חמישה ימים לאחר ההזרקה הוא לפחות 80%

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Schistosoma ביצים mansoni הם לגירוי חזק מסוג T helper 2 (Th2) בתגובה החיסונית, מאפיין של דלקת טפיל, אסטמה ודלקת אלרגית. פרוטוקול זה מנצל ס mansoni ביצה הזרקת ליצור CD4 תגובה ציטוקינים Th2-Induced דלקת בריאה, המאופיינת היווצרות גרנולומה ריאות סביב הביצה, eosinophilia והפעלה מקרופאג חלופי.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel...

גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

מאמר זה מתאר שיטות בסיסיות לתקנון גורמים חשובים כגון צפיפות, זמינות הזנה, מקור הידרציה ובקרות סביבתיות לגידול ארוך טווח של תרביות מעבדה של הקריקט האכיל, Gryllus bimaculatus.

שמירה על תרביות מעבדה של Gryllus bimaculatus, מודל אורתופטרני רב-תכליתי לחקלאות חרקים ופיזיולוגיה של חסרי חוליות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להזרקת עוברי קרציות. הזרקת עובר היא הטכניקה המועדפת למניפולציה גנטית ליצירת קווים מהונדסים.

טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

למדו את פרוטוקול הזרקת ביצי גרללוס לחקר ביולוגיה התפתחותית ומניפולציה גנומית. שיטה זו מספקת בסיס לניסויים ב-RNAi ומחקרי עוברים בחסרי חוליות.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

גלה סרטונים נוספים