Name: 온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 배우세요 온-막 소화 기술을 사용하여 질량 분석법으로 단백질-상호 작용을 효율적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 없이도 원시 면역침전물의 처리량을 높여줍니다.

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본 연구는 일본과학교부교부제 17K09869(오전), 일본과학교부교15K09418(TM)의 연구보조금인 가네하라 이치로의학재단의 연구보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 스즈켄 기념재단(TM)의 연구보조금.

1. 면역 침전
참고: 우리는 다음 섹션에 설명된 바와 같이 비 나트륨 도데실 황산염 (SDS) 용해 완충및 구연산염 용출을 사용했습니다. 그러나, 대안적인 사내 면역침전 기술의 사용은 LC-MS/MS 샘플을 준비하기 위해 또한 적용될 수 있다.
<ol><li>에피토프 태그 단독 또는 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 가진 트랜스펙트 배양 세포. 대표적인 데이터를 획득하기 위해, G774 세포(1 x 10 6)를 양이온 리포좀을 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP) 단독으로 또는 GFP 융합 Capn6(calpain-6 gene)을 코딩하는 벡터로 전송합니다.</li>
	<li>자기 구슬에 대한 항체를 융합합니다.<ol>
<li>이를 위해, 1.5 mL 시험관에서 500 μL의 구연산 인산완충액(24.5mMMM, 51.7 mm 디베이베이스트 나트륨 인산나트륨, pH 5.0)에서 항GFP 항체(2 μL/반응)를 자기 비드(25 μL/reaction)와 혼합합니다.</li>
		<li>혼합물을 실온에서 1시간 동안 50rpm으로 돌이십시오. 이어서, IgG-컨쥬게이드 비드를 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 함유 구연산산 인산완충액으로 3회 세척한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절한 용해 버퍼를 사용하여 형질감염된 세포를 용해시합니다. 대표적인 데이터를 획득하기 위해, 용해 완충제 400 μL(50 mM Tris-HCl)에서 얼음상에서 30분 동안 형질감염된 세포를 용해; pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.5% 폴리 (옥스예헬렌) 옥틸페닐 에테르) 40 μmol/L 페닐메틸설포닐 불소, 50 μg/mL leupeptin, 50 μg/ mL 아프로티닌, 200 μmol/L 나트륨 오르토바나데이트, 및 1 mMM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)을 1.5 mL 시험관에서 24시간 후 트랜스펙션 후.</li>
	<li>15,000 x g에서 원심분리하여 5 분 동안 용해기를 지우고 상급체를 수집합니다.</li>
	<li>포세이트 사전 클리어. 라벨이 부착되지 않은 자기 비드(25 μL/반응)를 1.5mL 시험 튜브에 추가합니다. 구연산염 인산완충제 500 μL로 구슬을 세 번 씻으자. 구연산염 인산염 완충제를 최종 세척시 제거한 후, 세포가 자기 구슬 위에 매해 를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 50rpm에서 회전자를 사용하여 혼합물을 회전시다.</li>
	<li>자기 분리를 위해 5 분 동안 자기 스탠드에 시험관을 놓고 세포 용해를 수집합니다. 제조업체에서 지정한 마그네틱 스탠드를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>표적 단백질을 컨쥬게이팅된 비드에 결합합니다. 면역 글로불린 (Ig)G-이형 비드를 자기 분리를 위해 5 분 동안 자기 스탠드에 놓고 구연산염 완충액을 버린 다음 분리 된 비드에 세포 용해액을 추가하십시오.</li>
	<li>혼합물을 실온에서 1시간 동안 50rpm으로 돌이십시오.</li>
	<li>표적 단백질을 자유 비표적 단백질로부터 분리한다. 구연산염 인산염 완충액 500 μL을 사용하여 구슬을 3회 세척하여 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 함유. 최종 세척 후, 구연산염 완충제(pH 2-3)의 30 μL을 추가하고, 대상 단백질을 용해시키기 위해 실온에서 5분 동안 배양한다. 참고: 면역 침전으로부터의 회복이 충분하지 않은 경우, FLAG 또는 HIS와 같은 대체 에피토프 태그를 사용하면 효율이 향상될 수 있습니다. 용출의 효율이 불충분하면, SDS 기반 용액과 같은 다른 용출액의 사용은 효율을 향상시킬 수 있다.</li>
</ol>2. 단백질의 온 막 소화
참고: 외인성 단백질로 오염되는 것을 방지하려면 단백질이 없는 재료와 장비를 사용하는 것이 필요합니다. 또한 작업자는 인체 단백질에 의한 오염을 피하기 위해 수술용 마스크와 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.
<ol><li>PVDF 멤브레인을 메탄올로 닦아 서 사용하기 직전에 건조시킨 수술용 가위를 사용하여 PVDF 멤브레인을 3mm x 3mm 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>깨끗한 알루미늄 호일에 PVDF 멤브레인 조각에 에탄올 2-5 μL을 추가합니다.</li>
	<li>완전히 건조되기 전에 용출액 (각각 2-5 μL, 샘플 당 4-6 개)을 친수성 PVDF 멤브레인에 추가한 다음 멤브레인 표면이 매트해질 때까지 멤브레인을 공기 건조시킵니다. 건조 막은 4°C에서 보관할 수 있다.</li>
	<li>모든 멤브레인을 1.5 mL 플라스틱 튜브로 옮기고 20-30 μL의 에탄올을 첨가하여 막을 친수성으로 만들고 파이펫을 사용하여 에탄올을 제거하십시오.</li>
	<li>멤브레인이 완전히 마르기 전에 디티오트레이톨(DTT) 기반 반응 용액(80 mM NH4HCO3,10 mM DTT 및 20% 아세토니트릴)을 넣고 56°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>반응 용액을 300 μL의 요오도아세타미드 용액 (80 mM NH4HCO3,55 mM iodoacetamide 및 20 % 아세토니트릴)으로 교체하고 어둠 속에서 실온에서 45 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>증류수 1 mL로 멤브레인을 두 번 씻고 >10s용 소용돌이 혼합으로 2% 아세토니트릴 1mL로 한 번 씻습니다.</li>
	<li>반응 용액(30 mM NH4HCO3 70% 아세토니트릴을 함유)에 직접 용해된 MS급 트립신(재료표)을 용해한다. 트립신 1 μg(재료 표)(30 mM NH4HCO3 함유 70% 아세토니트릴 포함)를 함유한 반응 용액의 100 μL을 넣고 밤새 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 트립틱 다이제스트를 함유한 반응 용액을 깨끗한 1.5 mL 시험관으로 옮김을 전달한다.</li>
	<li>100 μL의 세척 액 (70 % 아세토니트릴 / 1 % 트리플루오 아세트산)을 멤브레인에 넣고 60 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오. 멤브레인에 100 μL의 세척 액을 추가하고 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 그런 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합하십시오.</li>
	<li>실험실 필름의 조각으로 시험관을 덮고 바늘로 작은 구멍의 몇 가지를 합니다. 진공 농축기로 용액을 건조시고 건조시면 됩니다.</li>
	<li>잔류물을 0.2% 포르믹산의 10 μL로 용해시. 원심 분리 후 (12,000 × g, 실온에서 3 분), 상급을 샘플 튜브로 옮긴다. 참고: 이 섹션의 중요한 단계는 세서입니다. 온막 단백질 소화 동안, 증류수로 환원 및 알킬화 후 고정화 단백질을 함유하는 멤브레인을 세척하고, 2% 아세토니트릴을 각각 10초 이상 제거하는 것이 시약의 제거에 매우 중요하다.</li>
</ol>3. LC-전기 분무 이온화 (ESI)-MS/MS 분석
<ol><li>나노 LC HPLC 시스템(재료표)과 결합된 ESI-MS/MS 계측기(재료표)를활성화합니다. 사전 열(재질표)과 해석 열(재질표)을연결합니다.</li>
	<li>분석에 앞서 표준 펩타이드를 제공하는 0.2% 포머산에 용해된 소 혈청 알부민의 트립틱 다이제스트를 사용하여 질량 분석기를 교정합니다.</li>
	<li>포지티브 이온 모드와 질량 범위가 400-1,250 m/z를 사용하여 시료를 분석합니다. 그런 다음 질량 범위가 100-1,600 m/z이고 선형 구배가 2%-80% 아세토니트릴및 0.2% 포름산을 300 nL/min의 유량으로 80분 동안 최대 10MS/MS 스펙트럼(각 100ms)까지 획득합니다.</li>
	<li>단백질 식별을 위한 소프트웨어를 사용하여출력 데이터를 분석(재료 표)을 사용하여 후보 관련 단백질을 식별합니다. 후보 단백질의 양성 동정을 위해, 적어도 하나의 고충실도 펩티드 단편(> 95% 충실도)의 검출이 요구된다.</li>
	<li>GFP 발현 용해물(GFP 태그를 단독으로 발현하는 벡터의 형질전환)에서 유사하게 침전되는 단백질을 후보 단백질 목록에서 생략한다. 참고: 데이터베이스 분석에서 몇몇 단백질이 확인되는 경우에, MS/MS 취득 조건의 수정 (예를 들면, 각각 100 ms에서 50 ms각각으로 시간을 변경)는 확인된 단백질의 수를 증가시킬 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 이전에 온 막 소화 기술에 선행된 LC-MS/MS를 사용하여 산화된 저밀도 지단백에 있는 아폴리포단백질 B-100의 산화수정의 분석을 기술했습니다 6. 본 연구에서, 우리는 면역 침전과 이 기술을 결합하고 몇몇 calpain-6 관련 단백질을 확인했습니다. 이러한 신규 한 기술은 후보 관련 단백질에 대한 편리한 스크리닝 방법을 나타낸다. Calpain-6는 단백질-단백질 상호작용12,13을통해 세포 기능을 변형시킨 칼파인 단백질용해패밀리(11)의 비단백질용해부재이다. 온막 소화 기술을 사용하여, 우리는 이전에 다른 MS 셋업12를채택하는 그밖 calpain-6 관련 단백질을 확인했습니다. 따라서 식별된 후보 수를 최대화하기 위해 여러 MS 조건을 테스트하는 것이 좋습니다. 같은 이유로, 사용...

단백질은 살아있는 유기체에서 구성적인 역할을 하지만, 세포 내 환경에서 지속적으로 합성, 처리 및 저하됩니다. 더욱이, 세포내 단백질은 자주 물리적으로 그리고 생화학적으로 상호 작용하며, 이는 하나 또는 둘 다의 기능에 영향을 미치는 1,2,3. 예를 들어, 진핵 번역 개시 인자 4A3(eIF4A3)과 스플리케오솜 관련 단백질 상동체 CWC22의 직접 결합은 엑소온 접합 복합체4의조립에 필요하다. 이와 일치하여, CWC22에 대한 친화력이 결여된 eIF4A3 돌연변이체는 엑온 접합복합체 구동 mRNA 접합을 용이하게 하지 못한다 4. 따라서, 단백질 상호 작용의 연구는 세포 기능뿐만 아니라 생리학적 조절의 정확한 이해를 위해 중요합니다.
질량 분석법 (MS)에 있는 최근 어드밴스는 단백질 단백질 상호 작용의 포괄적인 분석에 적용되었습니다. 예를 들어, 내인성 단백질의 공동 침전 또는 외인성 으로 그들의 관련 단백질과 함께 태그가 부착된 단백질을 도입하고, MS 분석에 이어, 새로운 단백질 상호작용의 식별을 가능하게한다5. 그러나, MS/MS 분석의 한 주요 병목 현상은 단백질 샘플의 tryptic 소화에서 가난한 복구. 세포 용해제에 대한 단백질 분석을 수행하기 위해, 인젤 및 온 막 소화 기술은 일반적으로 MS / MS 샘플을 준비하기 위해 사용됩니다. 우리는 이전에 온 막 소화 기술 6와 인 젤 소화절차를 비교하고, 후자는 더 나은 서열 범위와 연관되었다는 것을 보여주었습니다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인은 유기 용제7,8의고농도에 기계적으로 견고하고 내성이 있기 때문에 이러한 목적에 적합할 수 있으며, 고정화의 효소 소화를 허용한다. 80 % 아세토니트릴 9의존재에 단백질 . 더욱이, 막에 고정화는 표적 단백질에 있는 형태 변경을 유도할 수 있고, 시도소화 효율에 있는 개선으로 이끌어 내는10. 따라서, 이 문서에서는, 우리는 온 막 소화 기술을 사용하여 단백질 상호 작용의 면역 침전-LC/MS/MS 분석의 사용을 기술했습니다. 이 간단한 방법은 비 전문 실험실에서도 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>와코</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>와코</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA 테크</td><td></td><td>나노 플로우 고성능 액체 크로마토 그래</td></tr>피 <tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>오토샘플러를 탑재한 나노플로우 고성능 액체 크로마토그래피</td></tr>, <tr><td>DTT,</td><td>Nacalai, tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr>, <tr><td>Dynabeads protein G</td><td>, Thermo Fisher, Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr>, <tr><td>포름산</td><td>, Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr>, <tr><td>HiQ, Sil, C18W-3</td>, <td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0.10mmID * 100mmL</td></tr><tr><td>요오드아세트아미드</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.V. 단클론 항체 (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>폴리(옥시에텔렌)옥틸페닐에테르(n=9)</td></tr><tr><td>펩타이드 규격</td><td>KYA Tech</td><td>tBSA-04</td><td>소 혈청 알부민 PP 바이알의 트립틱 다이제</td></tr>스트 <tr><td></td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>플라스틱 샘플 튜브</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 cooctail</td><td>Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot 소프트웨어</td><td>단백질 식별을 위한</td><td>Sciex</td><td>5034057</td> 소프트웨어</tr><tr><td>시퀀싱 등급 수정 트립신</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>트립신</td></tr><tr><td>오르토바나데이트 나트륨</td><td>시그마</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 이수화물</td><td>시그마</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>트랩 컬럼</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0.5mmID * 1mmL</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600 시스템</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>하이브리드 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분석기</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

수많은 세포내 단백질은 세포내 및 세포외 상황에 따라 물리적으로 상호 작용합니다. 실제로, 세포 기능은 주로 세포 내 단백질-단백질 상호 작용에 따라 달라 집니다. 따라서, 이러한 상호 작용에 관한 연구는 생리 적 프로세스의 이해를 촉진 하는 데 필수적이다. 질량 분석법 (MS) 분석에 선행된 관련 단백질의 공동 침전은, 새로운 단백질 상호 작용의 확인을 가능하게 합니다. 이 연구에서는, 우리는 단백질-단백질 상호 작용의 분석을 위한 온 막 소화와 결합된 면역 침전 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 분석의 새로운 기술의 세부사항을 제공했습니다. 이 기술은 원유 면역 침전제에 적합하며 단백질 분석의 처리량을 향상시킬 수 있습니다. 태그가 지정된 재조합 단백질은 특이적 항체를 사용하여 침전되었고; 다음으로, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 조각에 블린된 면역침전제는 환원 알킬화를 행하였다. 트립시니화 후, 소화된 단백질 잔기를 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였고, 이 기술을 사용하여, 우리는 여러 후보 관련 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 이 방법은 새로운 단백질-단백질 상호작용의 특성화에 편리하고 유용하다.

전술한 절차에 의해, 면역침전제는 LC-MS/MS를 사용하여분석하였다(도 1). 외인성 유래 단백질(다른 종 및 IgGs의 단백질)을 배제한 후, 17개의 단백질이 칼파인-6-관련면역침전제(표 1)에서 확인되었고, 15개의 단백질은 GFP 관련 면역침전제에서 확인되었다. 표2). 칼파인-6 및 GFP 관련 단백질 중, 11개는 면역침전제모두에서 확인되었다(도 2). 일단 이들 및 칼파인-6 자체가 제외되면, 5개의 후보 칼파인-6-관련 단백질이 남아 있었다: 보완 C1q 소성분 소단위 C, 각질 형 II 시토스켈레탈 8, IgE 결합 단백질, ADP/ATP 트랜스로케이스 1, 및 유비퀴틴.
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여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

단백질 단백질 상호 작용을 연구하는 것은 몇몇 필드에 있는 생리적인 과정을 이해하기 위한 필수불가결합니다. 이 비디오에서는 연구원이 MS에 의한 결합 단백질에 대한 포괄적인 분석을 편리한 방식으로 수행할 수 있는 온멤브레인 소화 기법을 소개합니다. 이 기술의 주요 장점은 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의한 단백질의 분리가 필요하지 않기 때문에 조잡한 면역 침전제에 대한 프로테오믹 분석의 처리량을 향상시킬 수 있다는 것이다.항체를 자기 구슬에 결합하기 시작하여, 구연산 인산염 완충제의 500 마이크로리터에 구슬과 항GFP 항체를 혼합하여. 실온에서 1시간 동안 50 RPM에서 혼합물을 회전시합니다. 그리고 1%폴리소르바트(20)를 함유한 구연산염 완충액으로 공주구비드를 세 번 세척한다.Lyse 원고 지침에 따라 감염된 세포를 분리합니다. 접시를 긁어 1.5 밀리리터 테스트 튜브로 lysate을 옮킨다. 그런 다음 15, 000 x g에서 원심분리로 lysate를 5 분 동안 지우고 상체를 수집합니다.구연산인산염 완충제 500마이크로리터로 세 번 세척하여 라벨이 없는 자기 구슬을 준비합니다. 마지막 세척 후 버퍼를 제거하고 구슬에 셀 리세이트를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 50 RPM에서 혼합물을 회전시.자기 스탠드에서 자기 분리를 수행하고 세포 리세이트를 수집합니다. 대상 단백질을 면역글로불린컨쥬게이트 구슬에 결합하려면 구슬을 자기 스탠드에 5분간 놓습니다. 구연산 버퍼를 버리고 셀 리세이트를 구슬에 추가합니다.50 RPM에서 1 시간 동안 혼합물을 회전합니다. 대상 단백질을 무미 표적 단백질과 분리하려면 1%의 폴리소르바테 20을 함유한 구연산염 완충제 500마이크로리터로 구슬을 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, 30 마이크로리터의 구연산 버퍼를 추가하고, 구슬이 실온에서 5분 동안 앉아 대상 단백질을 엘로우하게 한다.멤브레인을 준비하기 위해 PVDF 멤브레인을 사용하기 직전에 세척한 수술 가위를 사용하여 3mm 단위로 절단하십시오. 멤브레인 조각을 알루미늄 호일에 놓고 각 조각에 2~5마이크로리터를 추가합니다. 멤브레인이 완전히 건조하기 전에 각 조각에 단백질 용출제의 2 ~5 마이크로 리터를 추가하고 멤브레인 표면이 매트 될 때까지 공기 건조.그런 다음 멤브레인을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에 보관하십시오. 즉시 사용하는 경우 2~30마이크로리터에 탄올을 첨가하여 친수성있게 만듭니다. 파이펫으로 에탄올을 제거하지만 멤브레인이 건조하기 전에 각 튜브에 DTT 기반 반응 용액 200 마이크로리터를 완전히 추가하고 1 시간 동안 섭씨 56도에서 배양하십시오.인큐베이션 후, 반응 용액을 300마이크로리터의 요오도아세아미드 용액으로 대체하고, 45분 동안 어둠 속에서 배양한다. 그런 다음 증류수로 멤브레인을 두 번 씻고 적어도 10 초 동안 소용돌이하여 2 %의 아세토나이트로 한 번 씻으십하십시오. 다이팔성 관련 아세토닐트리어로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있습니다.마스크, 안경 및 장갑은 온멤브레인 소화 절차를 수행할 때 항상 착용해야 합니다. 원고 방향에 따라 트립신을 준비하고 각 멤브레인에 트립신 반응 용액 100 마이크로 리터를 추가하십시오. 소화를 위해 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 반응 용액을 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 100 마이크로리터의 세척 용액을 멤브레인에 추가합니다. 멤브레인을 섭씨 60도에서 2시간 동안 배양한 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합합니다. 100 마이크로리터의 세척 용액을 멤브레인에 추가하고 10 분 동안 초음파 처리하십시오.그런 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합합니다. 실험실 필름조각으로 테스트 튜브를 덮고 바늘로 필름에 작은 구멍을 만듭니다. 진공 농축기를 사용하여 용액을 건조시키고 잔류물을 2%의 마이크로리터 10마이크로리터로 용해하십시오.3 분 동안 12, 000 x g에서 튜브를 원심 분리하고 상체관을 샘플 튜브로 옮긴다. 나노 LC/HPLC 시스템에 연결된 질량 분광계를 사용하여 샘플을 분석합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 17개의 단백질은 Calpain-6 관련 면역 절전제에서, 15GFP 관련 면역 절전제에서, 및 11둘 다에서 확인되었다.후보 단백질의 양성 식별을 위해 적어도 하나의 높은 충실도 펩티드 단편의 검출이 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. GFP 발현 용해뿐만 아니라 히스톤, 외인성 및 리보솜 단백질에 침전된 단백질은 목록에서 생략되었다. 증류수와 2%아세토닐릴로 시도 소화 전에 멤브레인을 세척하는 것은 단백질에 대한 막 소화 절차에서 가장 중요한 단계입니다.이 방법에 따라, 면역 침전 및 서양 얼룩 분석과 같은 다른 실험을 수행함으로써 표적 단백질의 공동 침전을 확인할 수 있다. 이 간단한 방법은 연구원이 편리하고 고과민한 분석과 새로운 단백질 단백질 상호 작용을 탐구할 수 있게 합니다.

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이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

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시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는...

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

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질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 PVDF 멤브레인의 공동 면역침전된 단백질 복합체를 보여줍니다. 복합체에서 감소된 단백질을 트립신으로 처리하여 더 작은 펩티드에서 개별 단백질을 절단한 다음 나머지 펩티드를 PVDF 막에서 추출했습니다. 그런 다음 복합체의 두 단백질에서 유래된 끌어낸 펩타이드를 건조시키고 추가 분석을 위해 저농도의 포름산에 재현탁시켰습니다.

상호 작용 연구를 위한 공동 면역침전된 단백질을 준비하기 위한 막상 단백질 분해

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

배우세요 온-막 소화 기술을 사용하여 질량 분석법으로 단백질-상호 작용을 효율적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 없이도 원시 면역침전물의 처리량을 높여줍니다.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

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