고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

이 프로토콜은 primase를 위한 단백질 DNA 결합 마이크로어레이에서 대규모 데이터의 집합을 기술합니다, 특정 DNA 서열에 일시적으로 결합하고 차례차례로 RNA 프라이머의 형성을 촉매하는 효소. 이 비디오는 마이크로어레이 기술이 원시 서열 인식 사이트를 재정의하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지, 높은 처리량 접근 방식이 고전적인 생화학을 칭찬할 수 있는 방법을 다룹니다. 이 기술은 두 가지 접근법을 결합합니다: primase DNA 결합 마이크로어레이 및 primase 활동 분석.

마이크로어레이는 생화학적 분석이 DNA 프리마아제에 의한 RNA 프라이머 형성에 대한 정보를 제공하는 DNA 서열에 결합하는 원시적 물질의 방대한 데이터를 제공한다. 테스트된 효소 활동은 마이크로어레이 실험의 통찰력과 그 특성의 낮은 처리량에 따라 달라집니다. 결합의 효율, DNA 서열 선택 및 효소의 활성 사이의 링크가 조사됩니다.

마이크로어레이를 사용하여 서열 결정의 식별을 통해 마이크로어레이의 방대한 데이터를 기반으로 정확한 결론을 도출할 수 있습니다. 이 접근법은 전사 요인의 DNA 결합 서열을 설명하기 위하여 지금까지 이용되었습니다. 전사 요인은 DNA에 단단히 묶는 정적 단백질입니다.

절차를 시연하는 것은 스테판 일릭이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 0.01%트리톤-X 100이 포함된 코플린 항아리에 배치하여 마이크로어레이 슬라이드를 미리 적시십시오. 그리고 실험실 회전기에서 회전하면 5 분 동안 125 rpm을 추가하십시오.

블로킹 용액을 플라스틱 상자에 파이펫합니다. 그런 다음 코플린 항아리에서 마이크로 어레이 슬라이드를 제거합니다. 미세한 닦기를 사용하여 슬라이드의 비 DNA 측면과 가장자리를 구동합니다.

마이크로어레이를 플라스틱 상자에 천천히 넣습니다. 실온에서 1시간 동안 느리게 흔들리며 배양합니다. 그 후 PBS에서 0.01%Tween-20으로 슬라이드를 한 번 씻으십시오.

125 rpm의 실험실 회전기에서 5 분 동안. Tween-20을 제거하고 125 rpm의 실험실 회전기에서 PBS에서 0.01%트리톤-X 100으로 슬라이드를 한 번 헹구십시오. 그런 다음 슬라이드를 PBS가 들어있는 코플린 항아리로 신속하게 전송합니다.

먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PMB 챔버를 조립합니다. 슬라이드를 지정된 공간에 배치합니다. 핀셋을 사용하여 아래로 밀어 내고 왼쪽으로 이동합니다.

실리콘 개스킷을 위에 놓고 PBM 챔버의 하부와 잘 정렬되었는지 확인합니다. 그런 다음 챔버를 닫고 나사를 대각선으로 조입니다. 개스킷의 각 우물에 단백질 결합 혼합물을 피펫.

그런 다음 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 시작하려면 PBS에서 파이펫 0.05%Tween-20을 PBM 챔버로 들어가 슬라이드를 잠깐 세척합니다. 진공 흡인기를 사용하여, DNA 반점을 만지지 않도록 주의되는 챔버의 우물에서 용액을 제거합니다.

이 것을 반복하고 PBS로 슬라이드를 잠깐 씻으십시오. 그리고 진공을 사용하여 DNA 반점을 만지지 않도록 주의하면서 챔버의 우물에서 용액을 제거하십시오. 다음으로, PBM 챔버의 각 우물에 알렉사 488 공액 된 항 -그의 항체를 추가합니다.

실온에서 30분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 그 후 PBS에서 0.05%Tween-20의 몇 방울을 각 우물에 추가하여 PBM 챔버 내부의 슬라이드를 짧게 세척합니다. 그리고 진공 흡구기를 사용하여 챔버의 우물에서 용액을 제거하고 DNA 반점을 만지지 않도록주의하십시오.

PBM 챔버를 분해하고 슬라이드를 제거합니다. PBS에서 0.05%Tween-20으로 슬라이드를 두 번 헹구고 각 헹구는 것은 3분 동안 지속됩니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 두 번 헹구고 각 헹구는 것이 각각 3 분 동안 지속됩니다.

그리고 3 분 동안 이중 증류수에서 한 번. 압축 공기로 슬라이드를 건조시다. 그리고 스캔 할 준비가 될 때까지 어두운 슬라이드 상자에 저장합니다.

준비되면 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 495 나노미터의 발산과 19 나노미터의 방출로 칩을 스캔합니다. 및 중간 형광 강도를 수집합니다. 이 연구에서 pi 처리량 프리마제 프로파일링은 고전적인 도구를 사용하여 관찰하는 것이 불가능하지 않을 경우 어려운 사이트를 포함하여 프리마제 바인딩 사이트를 매핑하는 데 사용됩니다.

중요한 것은 파이 처리량 프리마제 프로파일링을 통해 프리마제 바인딩 사이트에 대한 전통적인 이해를 다시 볼 수 있습니다. 특히 pi 처리량 프리마제 프로파일링은 알려진 5'GTC3'인식 서열 외에도 결합 특이성을 드러내며, 이는 T7 DNA primase의 기능 적 활동의 변화로 이어진다. 즉, 시퀀스의 두 그룹이 식별됩니다.

측면에 TG를 포함 하는 강한 바인딩 DNA 서열 및 측면에 AG를 포함 하는 약한 바인딩 DNA 서열. 그들의 순서 내에서 5'GTC3'가 누락된 DNA 템플릿에 대한 프리마아제 결합이 발견되지 않았습니다. TG 풍부한 측면과 같은 특정 특징을 포함하는 프리마제 DNA 인식 사이트는 최대 10배까지 스니마제 DNA결합을 증가시다.

놀랍게도, 그들은 또한 새로 형성 된 RNA의 길이를 증가시다. 중요한 것은, 높은 처리량 프리마제 프로파일링을 통해 DNA 템플릿의 서열과 관련하여 프라이머 길이의 가변성을 관찰하고 정량화할 수 있습니다. 이 절차를 수행 할 때 세척 단계는 미묘해야합니다.

그리고 버퍼에는 DNA에 프리마아를 기록한 구성 요소가 포함되어야 합니다. 또한 쓸데없는 결합 이벤트의 임계 값은 생화학적으로 결정된다. 따라서 마이크로어레이의 분석이 충분하지 않습니다.

표면 플라즈마 공명 및 겔 시프트 와 같은 방법은 DNA 서열을 선택하는 프리마제의 결합 친화성을 결정할 수 있다. 내 실험실은 DNA 폴리머라아제에 의해 확장 될 수있는 생산프라이머를 산출 primase 시퀀스 결정요인을 감지하기 위해 기계 학습 예측 모델을 구현합니다. 빅 데이터의 시대에 빅 데이터를 분석하는 통계 적 방법의 구현은 특정 DNA 서열을 더 잘 특성화하고 서열 인식을 primase의 활성에 연결하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.

방사선으로 일하는 사람은 이온화 방사선의 사용과 관련된 규정과 위험에 대한 철저한 이해를 가져야합니다. 교육을 받아야 하며 안전 장비와 함께 작동해야 합니다.