Name: 미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 학습하세요 코피라이트 및 부피 전자 현미경을 이용한 미토콘드리아와 소포체의 3차원 분포 분석 방법을. 유전자 변형 후 세포 소기관의 공간적 변화를 정밀하게 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 한국과학기술정보통신부(19-BR-01-08)의 지원을 받는 한국뇌연구원과 한국정부(MSIT)의 후원을 받은 한국뇌연구원(NRF)을 통해 지원되었다. 2019R1A2C10634). SCO1-APEX2와 HRP-KDEL 플라스미드는 이현우(서울대학교)가 친절하게 제공했다. TEM 데이터는 KBRI의 뇌 연구 핵심 시설에서 수집되었습니다.

1. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드 벡터를 가진 패턴격자 배양 접시 및 세포 형질혈을 가진 세포 배양
<ol><li>종자 1 x 105 HEK293T 세포는 Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)에서 37 °C에서 5 % CO2를 포함하는 가습 된 분위기에서 35mm 유리 그리드 바닥 배양 접시에 배치하여 10 % 태아 소 혈청, 100 U / mL로 보충했습니다. 페니실린, 및 100 U / mL 연쇄상 구균.</li>
	<li>세포를 파종 한 다음 날, 50 %-60 % 컨플루앙으로 성장했을 때 제조업체의 지침에 따라 형질 감염 시약을 사용하여 세포에 SCO1-APEX210 및 HRP-KDEL12 플라스미드를 도입하십시오 (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 μg + HRP-KDEL 플라스미드 DNA 0.5 μg 당 3 μL 트랜스펙션 시약).</li>
</ol>2. 패턴 배양 접시에 성장하는 세포의 가벼운 현미경 검사법 및 APEX2 및 HRP를 위한 DAB 염색
<ol><li>형질전환 후 16-24시간에서, 모든 배양 배지를 제거하고 즉시 250 μL의 따뜻한(30-37°C) 고정 액액을 첨가한다(표 1)에 부드러운 파이펫팅을 한다. 즉시 고정 용액을 제거하고 1.5 mL의 새로운 고정 솔루션으로 교체하십시오. 60분 동안 얼음 위에 배양한 다음, 얼음-차가운 0.1 M 나트륨 카코디산완충제1mL에각각 10분동안 3회 세척한다(표 1). 주의: 알데히드 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오.</li>
	<li>차가운 (0-4 °C) 20 mM 글리신 용액 1 mL을 추가하고 얼음에 10 분 동안 배양한 다음 차가운 0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액의 1 mL에서 각각 5 분의 3 번의 세차서를 넣습니다.</li>
	<li>신선한 1x DAB 용액(0.3M 카코디레이트 용액 3.33 mL + 30% H2O2 + 5.67 mL의 냉수 + 1 mL 10x DAB 용액)을 준비합니다.</li>
	<li>신선하게 제조된 1x DAB 용액(단계 2.3)의 500 μL을 추가하고 뒤집힌 빛 현미경 아래에서 밝은 갈색 얼룩이 보일 때까지약 5-45분 동안 얼음위에 배양합니다(그림 1A).</li>
	<li>DAB 용액을 부드럽게 제거하고 차가운 0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액 1mL로 각각 10 분 동안 3 회 헹구십시오.</li>
	<li>위상 대비 반전 현미경(또는 밝은 필드 광 현미경)을 사용하여 100배 이상의 배율로 DAB 염색을 시각화합니다. 관심 영역(ROI)이 있는 유리의 맨 아래에 마커 펜을 표시합니다(그림1B,C).</li>
</ol>3. EM 블록에 대한 샘플 준비
<ol><li>단계 2.1-2.6에 기재된 바와 같이 세포 배양 및 DAB 염색을 수행한다.</li>
	<li>1 mL의 2%로 시료를 4°C에서 1시간 동안 OsO4를 감소시다. 주의: OsO4 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오.</li>
	<li>3.2단계에서 새로운TCH 용액(표 1)을 준비하고 0.22-μm 필터를 통과한다. 주의: TCH 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오.</li>
	<li>1 mL의 증류수로 고정물을 제거하고 실온(RT)에서 각각 5분 동안 헹구어 보시고 헹구어 보시기합니다.</li>
	<li>RT에서 이전에 제조되고 여과된 TCH 용액의 1 mL에 세포를 20분 동안 놓습니다.</li>
	<li>RT에서 각각 5 분 동안 증류수 1 mL로 세포를 세 번 헹구고.</li>
	<li>RT에서 30분 동안 증류수에 2% 오스뮴 테트옥사이드의 1 mL에 세포를 두 번째로 노출시켰다.</li>
	<li>RT에서 증류수 1mL로 3회 고정식을 제거하고 3회 헹구십시오.</li>
	<li>RT에서 증류수 1 mL에서 세포를 3 회 5 분 동안 씻으소서.</li>
	<li>30 분 동안 60 °C에서오븐에 미리 따뜻한 월튼의 납 아스파타트 용액 (표 1).</li>
	<li>미리 데운 납 아스파르타액 1mL를 첨가하여 월튼의 납 아스파르타액으로 세포를 염색한 다음 60°C에서 30분 동안 오븐에 넣습니다.</li>
	<li>RT에서 각각 5 분 동안 증류수 1 mL로 세포를 세 번 헹구고.</li>
	<li>2mL 에탄올 aliquots의 등급시리즈로 배양(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) RT에서 각각 20 분 동안.</li>
	<li>에탄올을 3:1 에탄올의 1 mL에서 30분 동안 배양하였다:RT에서 저점도 임베딩 혼합물 배지.</li>
	<li>배지를 제거하고 1mL의 1mL를 추가하여 1:1 에탄올:저점도 임베딩 혼합물 배지를 넣습니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>배지를 제거하고 1mL의 1mL를 추가하여 1:3 에탄올:저점도 임베딩 혼합물 배지를 삽입합니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>배지를 제거하고 100% 저점도 임베딩 배지의 1 mL를 추가하고 밤새 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 100% 저점도 임베딩 혼합물에 넣고 60°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>울트라 마이크로토메를 사용하여 90-nm 두께의 섹션을 준비합니다.</li>
	<li>200 kV에서 TEM 아래의 그리드를 관찰하십시오.</li>
</ol>4. SEM 이미징을 위한 인듐 주석 산화물 코팅 커버슬립에 직렬 단면 및 장착
<ol><li>
기판 준비
	<ol>
<li>30-60s의 이소프로판올에서 부드럽게 교반하여 인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 커버슬립 (22mm x 22mm)을 청소하십시오.</li>
		<li>커버립을 제거하고, 여분의 이소프로판올을 빼내고, 건조해질 때까지 먼지가 없는 환경에 두십시오.</li>
		<li>1분 동안 플라즈마 코팅기를 사용하여 광섬유 배출에 의해 ITO 코팅 유리 커버슬립을 처리합니다. 참고 : 플라즈마 활성화는 기판 표면에 친수성 특성을 부여합니다. 단면이 기판에 부착될 때 섹션내의 주름 형성을 방지하기 위해 기판 상에 매우 얇은 물 막을 생성한다.</li>
		<li>ITO 코팅 유리 커버를 기판 홀더에 삽입하고 칼 보트에 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 블록 및 직렬 단면 트리밍
	<ol>
<li>샘플 블록을 울트라마이크로토메의 샘플 홀더에 넣고 트리밍 블록에 넣습니다.</li>
		<li>면도날을 사용하여 대상 위치 주위의 모든 여분의 수지(단계 2.6, 그림 1D-G에서식별)를 다듬습니다. 블록 면의 모양은 사다리꼴 또는 직사각형이어야 합니다. 선행 가장자리와 후행 가장자리는 절대적으로 평행해야 합니다(그림1H,I).</li>
		<li>샘플 홀더를 울트라마이크로톤의 팔에 삽입하고 다이아몬드 나이프를 칼 홀더에 넣습니다. ITO 유리 커버슬립을 리본 캐리어에 삽입하고 핸들로캐리어를 고정합니다(그림 1J). 리본 캐리어를 칼 보트에 넣고 여과 된 증류수로칼 보트를 채웁니다 (그림 1K).</li>
		<li>홀더의 손잡이를 조심스럽게 밀어 ITO 유리의 가장자리를 칼에 가깝게 설정하여 칼의 슬라이드로 캐리어위치를 조정합니다(그림 1L).</li>
		<li>절편을 절단 한 후, 절편 과정을 중지하고 천천히 튜브의 클램핑 나사를 열고 물 보트 (초당 물 한 방울의 유량)를 배수.</li>
		<li>리본 수집 과정을 완료한 후, 클램핑 장치의 손잡이로 기판을 제거하고리본을 건조시다(도 1M).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SEM의 이미징 및 SEM 이미지 스택정렬
<ol><li>끈적끈적한 카본 테이프로 알루미늄 스텁에 ITO 코팅 커버슬립을 장착합니다. 끈적끈적한 탄소 테이프로 스텁의 유리 표면과 표면을 밀봉한 다음 10-nm두께의 탄소 층으로 코팅합니다(그림 1N).</li>
	<li>5kV의 낮은 가속도 전압과 효율적인 BSE 수집을 위한 적절한 작업 거리에서 현장 방출 SEM에서 ITO 코팅 커버슬립을 관찰합니다.</li>
	<li>가상 스택 옵션을 사용하여 직렬 이미지를 이미지 J 소프트웨어(Fiji)13으로 가져옵니다. 새 TrakEM14를열고 이미지 스택을 TrakEM으로 가져옵니다. 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하고 정렬 메뉴를 선택합니다.</li>
	<li>그런 다음 첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지 이미지 범위를 선택합니다. 자동 정렬을 완료하고 정렬된 데이터 집합을 저장한 다음 내보내기를 선택하여 선택한 이미지 범위(첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지)에서 플랫 이미지를 컴파일합니다. 마지막으로, 이미지 J 메인 메뉴에 AVI 형식으로 평면 이미지 데이터를 저장합니다. 참고: 보조 동영상 1과 추가 동영상 2는 각각 SEM 이미지 스택과 잘림된 이미지 스택을 표시합니다.</li>
</ol>6. 직렬 이미지에서 미토콘드리아 및 ER의 세분화
<ol><li>IMOD15 소프트웨어에서 3dmod를 시작하고 이미지 파일을 엽니 다.</li>
	<li>ZaP 창에서 중간 마우스 단추를 사용하여 미토콘드리아와 ER의 윤곽을 그립니다.</li>
	<li>분할된 볼륨을 시각화하려면 모델 뷰 창(추가동영상3)을 엽니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

EM을 사용하여 나노미터 해상도에서 특정 단백질의 세포 국소화를 결정하는 것은 단백질의 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 EM을 통해 표적 단백질의 국소화를 연구하는 두 가지 기술이 있다. 하나는 1960년부터 EM에서 사용되어 온 면역골 기술이며, 다른 하나는 최근에 개발된 유전자 부호타호16을사용하는 기술이다. 전통적인 면역금 기술은 표지된 단백질의 위치를 보여주기 위하여 항체 공액 금 입자 또는 양자점을 채택했습니다. 그러나, 고품질 항체에 대한 요구 사항 및 수지 및 고정제에 의해 영향을받는 항체의 침투 효율로 인해,이 기술은17크게 제한된다. 구체적으로, 면역골 라벨링은 주로 엔블록 금속 염색 및 강한 오스뮴 고정없이 초박형 섹션의 표면에 제한되기 때문에, 이 기술은 현대 3DEM18에직접 적용되지 않는다. SBEM 및 어레이 단층 촬영을 포함한 최근의 3DEM 방법을 단백...

미토콘드리아및기관망망소(ER)는 막결합 세포소기관입니다. 그들의 연결은 그들의 기능에 필요하고, 그들의 네트워크와관련있는 단백질은 1을 기술되었습니다. 미토콘드리아와 ER 사이의 거리는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 약 100 nm로 보고되었습니다2; 그러나, 최근 초고해상도 현미경 검사법3 및 전자 현미경 검사법 (EM)4 연구 결과는 대략 10-25 nm에서 상당히 더 작은 것으로 나타났습니다. 초고해상도 현미경 검사법에서 달성된 분해능은 EM보다 낮으며 특정 라벨링이 필요합니다. EM은 미토콘드리아와 ER 사이의 연결에 대한 구조적 연구를 위해 충분히 고분해능 대비를 달성하기에 적합한 기술이다. 그러나, 종래의 투과 전자현미경(TEM)의 경우 얇은 단면이 약 60 nm 또는 더 얇아야 하기 때문에 제한된 z축 정보가 제한된 단점이다. 충분한 EM z 축 화상 진찰을 위해, 3차원 전자 현미경검사법 (3DEM)는 5를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 단지 몇몇 숙련된 기술자가 마스터한 아주 까다로운 일인 전체 세포의 얇은 직렬 단면도의 수백의 준비를 관련시킵니다. 이러한 얇은 섹션은 깨지기 쉬운 formvar 필름 코팅 한 홀 TEM 그리드에 수집됩니다. 필름이 하나의 거드에서 파손되면 직렬 이미징 및 볼륨 재구성이 불가능합니다. 직렬 블록-얼굴 주사 전자 현미경 검사법 (SBEM)은 다이아몬드 나이프 (Dik-SBEM) 또는 초점 이온 빔 (FIB-SEM) 중 하나와 주사 전자 현미경 (SEM) 진공 챔버 내부 파괴적인 enbloc 절편을 사용하는 3DEM에 대한 인기있는 기술입니다 6. 그러나 이러한 기술은 모든 시설에서 사용할 수 없기 때문에 직렬 단면 및 SEM을 사용하여 배열 단층 촬영 7을 권장합니다. 어레이 단층 촬영에서, 울트라 마이크로 톰을 사용하여 절단 된 직렬 섹션은 TEM 그리드 대신 유리커버 슬립으로 전송되고 빛 현미경 검사법 및 SEM 8을 통해 시각화됩니다. 백스캐터 전자(BSE) 이미징신호를 향상시키기 위해 오스뮴 테트옥사이드(OsO 4)-오스미오필릭티오카르보하이드라지드(TCH) 9를 사용하는 고정형 세포를활용한 엔블록 EM 염색 프로토콜을 활용하여, 없이 이미지를 얻을 수 있게 되었습니다. 포스트 임베딩 이중 염색.
부가적으로, 미토콘드리아 마커 SCO1(시토크롬 c 산화다아제 어셈블리 단백질 1)-아스코르브베이트 과산화아제 2(APEX2)10 분자 태그를 EM 수준에서 미토콘드리아를 가시화하는 데 사용되었다. APEX2는 약 28 kDa이며 대두 아스코르브베이트 과산화수지11에서 유래된다. 녹색 형광 단백질 태그 단백질이 가벼운 현미경 검사법에서 사용되는 것과 같은 방식으로 EM 수준에서 특정 단백질의 상세한 위치를 보여주기 위해 개발되었습니다. APEX2는 3,3' -다미노벤지딘(DAB)을 공동인자 과산화수소(H2O2)의 존재 시 태그 부위에 불용성OSMiophilic 폴리머로 변환합니다. APEX2는 EM에서 전통적인 항체 라벨링의 대안으로 사용될 수 있으며, 전체 세포의 깊이에 걸쳐 단백질 국소화를 할 수 있다. 즉, APEX2 태그가 부착된 단백질은 초저온 절제 후 면역골 표지 및 투과없이 특이적 삼투압(11)에 의해 가시화될 수 있다. 고추냉이 과산화 효소(HRP)는 또한 H2O2-의존적DAB를 국부화된 침전물 내로 촉매시키는 민감한 태그이며, OsO4로처리한 후 EM 대비를 제공한다. ER 표적 펩티드 서열 HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)(12)을 전체 세포 내에서 ER을 시각화하기 위해 적용하였다. 감소된 오스뮴 및 TCH(rOTO 방법)로 유전적 태그 및 enbloc 염색을 활용하는 우리의 프로토콜을 평가하기 위해, 동시에 삼투유 효과를 사용하여, 우리는 rOTO en bloc 염색에서 각 유전자 태그의 사용 없이 막 대비를 비교하였다. APEX 및 HRP를 가진 배열 단층 촬영 및 DAB 염색을 가진 3DEM이 각각, 그밖 목적을 위해 이용되었더라도, 우리가 미토콘드리아와 ER 라벨링을 위한 3DEM및 DAB 염색을 위한 배열 단층 촬영을 결합했기 때문에 우리의 프로토콜은 유일합니다. 특히, 우리는 세포에 대한 유전자 변형의 효과를 조사하는 데 도움이 같은 섹션에서 APEX 태그 유전자없이 다섯 세포를 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>글루타르알데히드</td><td>EMS</td><td>16200</td><td>흄 후드에서만 사용</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>EMS</td><td>19210</td><td>흄 후드에서만 사용</td></tr><tr><td>소듐 카코딜레이트</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 4% 수용액</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>흄 후드에서만 사용</td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td></tr><tr><td>초극소형 라이카 ARTOS 3D</td><td>라이카</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>유해 화학 물질</td></tr><tr><td>납 구연산</td>염 <td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>35mm 그리드 커버 슬립 접시</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>글로우 배출기</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 탄소 코팅 구리 그리드</td><td>Ted Pella</td><td>01805-F</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>SIGMA</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime; -diaminobenzamidine (DAB)</td><td>SIGMA</td><td>D8001</td><td>유해 화학물질</td></tr><tr><td>30% 과산화수소 용액</td><td>Merck</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um 주사기 필터</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbonyldihydrazide</td><td>SIGMA</td><td>223220</td><td>흄 후드에서만 사용</td></tr><tr>수<td>산화칼</td><td>륨 Fluka</td><td>10193426</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>SIGMA</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 커버 슬립</td><td>SPI</td><td>06489-AB</td><td>fragil 유리</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프</td><td>Leica</td><td>AT-4</td><td></td></tr><tr><td>Inveted 광 현미경</td><td>Nikon</td><td>ECLipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Auriga</td><td></td></tr></tbody></table>

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

미토콘드리아 및 기관망망(ER)과 같은 세포 소기관은 다양한 기능을 수행하는 네트워크를 만듭니다. 이러한 고곡선 구조는 셀룰러 조건에 따라 동적 네트워크를 형성하기 위해 다양한 모양으로 접혀 있습니다. 미토콘드리아와 ER 사이 이 네트워크의 가시화는 초고해상도 형광 화상 진찰 및 광 현미경 검사법을 사용하여 시도되었습니다; 그러나, 제한된 해결책은 미토콘드리아와 ER 사이 막을 상세히 관찰하기에 불충분하다. 전송 전자 현미경 검사법은 세포 소기관의 관찰을 위한 좋은 막 대조 및 나노미터 규모 해결책을 제공합니다; 그러나 고곡선 소기관의 3차원(3D) 구조를 평가할 때 는 매우 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 우리는 강화된 아스코르브베이트 과산화공2 및 고추냉이 과옥시다아제 염색을 사용하여 상관경연산빛전자현미경법(CLEM) 및 부피 전자현미경기술을 통해 미토콘드리아와 ER의 형태를 관찰하였다. 3D 구조를 관찰하기 위해 엔블록 염색 방법, 초박형 직렬 단면화(배열 단층 촬영) 및 부피 전자 현미경을 적용하였다. 이 프로토콜에서는, 우리는 미토콘드리아와 ER의 상세한 구조적인 연구를 능력을 발휘하기 위하여 CLEM와 3D 전자 현미경 검사법의 조합을 건의합니다.

그림 1은 이 프로토콜의 일정및 워크플로를 설명합니다. 프로토콜은 7 일이 필요합니다. 그러나 SEM 이미징에 소요된 시간에 따라 증가할 수 있습니다. 세포 형질감염의 경우, 세포의 결합은 전체 그리드 플레이트의 바닥을 덮지 않도록 제어되어야 한다(도1A). 높은 세포 밀도는 빛 현미경 및 EM 관찰 도중 관심 있는 세포의 확인을 방지할 수 있었습니다. 우리는 배양 접시에 있는 수많은 배양세포 중에서 효율적으로 형질감염된 세포를 선택하기 위하여 APEX2 및 HRP를 표현한 유전으로 표를 붙인 플라스미드를 이용했습니다. 우리는 HEK293T 세포를 배양하고 공동 형질감염 세포에서 SCO1-연결된 APEX2(미토콘드리아 막 간 공간 [IMS]) 및 HRP 접합 KDEL(ER)의 발현을 확인하였다. 가벼운 현미경 검사법하에서, APEX2 형질감염된 세포는 갈색으로 염색된 반면, 형질감염이 없는 세포는 얼룩이 없는 채로 남아 있었다(그림1A 및...

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

이 부피 전자 현미경 기술은 3-D 구조의 관찰을 요구하는 생물학 연구를 능력을 발휘하기 위하여 이용됩니다. 이미지를 다시 보기 전에 로드, 필더 뷰 및 샘플 저장소를 제공합니다. Fx2 Asan은 타깃 구조물의 전자 시험을 증가시키기 위하여 디아빌레이션을 촉매하고 관심있는 특정 표적을 찾아내는 데 사용될 수 있는 경로 단계를 설계했습니다.이 입자는 관상 동맥 및 호스트 세포 사이 상호 작용을 조사하기 위하여 상대성 빛 및 3-D 전자 현미경 기술의 사용을 결합합니다. 이식 후 16~24시간, 섭씨 30~37도의 250마이크로리터로 컬쳐를 부드럽게 세척합니다. 세척을 신선한 고정 용액 1.5 밀리리터로 신속하게 교체하고 문화를 얼음에 30 분 동안 배치합니다.인큐베이션이 끝나면 세척당 0.1 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼의 1 밀리리터로 31분 세척으로 세포를 헹구는 다. 마지막 세척 후, 얼음 차가운 0 ~4도 20 밀리머 글리신 용액1 밀리리터를 얼음에 10 분 동안 접시에 넣고 1 밀리리터를 얼음에 넣고 1 밀리리터를 씻어 내고, 세척당 1 밀리리터의 신선하고 차가운 0.1 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼로 3 밀리리터를 씻어 넣습니다. 다음으로, 갓 준비된 DAB 용액 500마이크로리터로 셀에 라벨을 붙입니다.그리고 약 5 ~45 분 동안 얼음에 세포를 배양. 밝은 갈색 얼룩이 반전 된 빛 현미경으로 볼 때, 세척 당 10 분 동안 신선한, 차가운 0.1 어금니 나트륨 cacodylate 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 세 번 헹구세요. 이어서, 위상 대비 반전 현미경을 사용하여 DAB 염색을 100배 이상으로 시각화하고 관심 영역이 있는 유리의 바닥을 표시한다.전자 현미경 블록 샘플 제제의 경우, 먼저 섭씨 4도에서 1 시간 동안 2 %의 1 밀리리터로 세포를 수정합니다. 고정이 끝나면 세워서 3개의 5분간 세척하고 세척당 신선한 증류수 1밀리리터로 세포를 헹구습니다. 20 분 동안 여과 된 TCH 용액의 1 밀리리터로 세포를 치료하기 전에.인큐베이션이 끝나면, 단지 입증된 대로 증류수에서 세포를 세 번 씻고 2% 감소된 오스뮴 테트산화물에서 30분 배양으로 세포를 고정시한다. 두 번째 고정의 끝에서, 증류수로 세포를 세 번 세척하고 빛으로부터 보호 섭씨 4섭씨에서 하룻밤 수성 1 %uranyl 아세테이트의 1 밀리리터로 문화를 커버. 다음 날 아침, 60도의 1밀리리터로 스테인싱하기 전에 증류수로 셀을 세 번 씻은 후 60도 오븐에서 30분 동안 월튼의 납 아스파트로 사용할 수 있습니다.인큐베이션이 끝나면 증류수로 셀을 세 번 씻으실 수 있습니다. 그리고 20 분 2 밀리리터 에탄올 알리 쿼트의 등급 시리즈에서 문화를 배양. 마지막 100% 에탄올 노출 후, 실온에서 혼합물 매체를 낮은 점도 에탄올에 3-1의 1 밀리리터에서 30분 동안 세포를 배양한다.인큐베이션의 끝에서, 저점도 에탄올의 1 밀리리터로 배지를 실온에서 30분 간 배양하는 혼합물 배지로 교체한다. 다음으로, 저점도 포함 혼합물 배지에 1-3 에탄올의 1밀리터로 배지를 실온에서 30분 간 추가로 교체한다. 이어서, 배지를 100% 낮은 점도 포함 매체의 1밀리리터로 교체하고, 그 다음에 는 60°C에서 24시간 동안 100% 낮은 점도 포함 혼합물에 샘플을 포함시키는 것이다.전송 전자 현미경 분석을 위해, 다음 날, 초미세 토메를 사용하여 90 나노미터 두께의 단면을 얻고 200 킬로볼트에서 투과 전자 현미경 검사법의 밑에 그리드를 관찰하십시오. 시료 준비를 시작하기 전에, 30~60초 동안 이소프로파놀에 부드러운 교반으로 인듐 틴 옥사이드 코팅 유리 커버립을 세척합니다. 동요의 끝에서, 여분의 알코올을 배출하고 먼지가없는 환경에 커버립을 배치합니다.커버립이 건조하면 플라즈마 코터를 사용하여 1분 동안 커버립을 배출합니다. 그런 다음 커버립을 기판 홀더에 삽입하고 기판 홀더를 칼 보트에 넣습니다. 전자 현미경 검사용 샘플을 얻으려면 내장된 샘플 블록을 초미세토메의 샘플 홀더에 삽입합니다.그리고 트리밍 블록에 홀더를 설정합니다. 면도날을 사용하여 블록의 면이 사다리꼴 또는 직사각형 모양을 획득하도록 대상 위치 주위의 과잉 수지를 다듬습니다. 선행 및 후행 가장자리는 서로 엄격하게 평행해야 합니다.많은 수의 일련 섹션을 획득하는 것은 쉽지 않습니다. 그러나 선행 가장자리와 후행 모서리가 완전히 평행해야 합니다. 다음으로, 초미세토메의 암에 샘플 홀더를 삽입한다.다이아몬드 나이프를 칼 홀더에 놓고 칼보트를 여과된 증류수로 채웁니다. 그런 다음 홀더의 손잡이를 조심스럽게 밀어 캐리어 위치를 조정하여 커버의 가장자리가 칼에 가깝도록 합니다. 샘플을 얻은 후 단면 공정을 멈추고 천천히 튜브의 클램핑 나사를 열고 물 보트를 배출하십시오.리본 수집 프로세스가 완료되면 클램핑 장치의 핸들로 기판을 제거하고 리본을 건조시다. 관심있는 단백질을 표현하는 유전 태그 플라스미드의 사용은 태그 된 단백질에 대한 염색 후 전염 된 표적 세포의 식별을 허용합니다. 코르상대광 전자 현미경 검사는 표지된 세포 배양을 더 시각화하기 위해 사용될 수 있다.예를 들어, SCO1-APEX2에 의해 생성된 어두운 얼룩은 미토콘드리아의 매트릭스 공간이 아닌 미토콘드리아 간 공간에서 독점적으로 관찰된다. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드를 모두 가진 코드 전염된 세포는 미토콘드리아 막 공간과 내시경 망상에서 고밀도 전자 신호를 나타낸다. 그러나, SCO1-APEX2로만 전염되는 세포에서는 뇌성 망상 염색이 관찰되지 않는다.전자 현미경 검사를 스캔하여 직렬 이미징의 경우 넓은 영역에 백스캐터 전자 검출기를 사용하여 전체 어레이 이미지에 대한 개요가 만들어집니다. 다음으로 관심 영역은 첫 번째 섹션에 배치되고 다른 모든 섹션에 전파됩니다. 마지막으로, 5개의 표적 세포를 포함하는 관심 영역은 5나노미터 이미지 픽셀로 심화된다.배율은 골기 장치, 미토콘드리아 및 종말 망상과 같은 상세한 세포 극체 구조를 보여줍니다. 연쇄 화상 진찰은 명확하게 풍요의 망상 -미토콘드리아 접촉이 다른 z-비행기에서 발생한다는 것을 보여줍니다. 특정 ID 수정의 효과를 조사하기 위해 상대성 광 및 전자 현미경 검사를 사용하여 특정 표적 구조를 찾는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.이 염색 기술은 부피 전자 현미경 검사법과 결합된 더 큰 규모의 EM을 위해 특히 eurovirus에서 세포 상호 작용을 조사하는 데 사용될 수 있었습니다. 글루타랄데히드, 또한 엔테에테르시드와 TCH는 매우 독성이 있으므로 보호복을 착용하고 이러한 재료를 사용할 때 연기 후드에서 작동해야합니다.

mitochondria-endoplasmic-reticulum-imaging-correlative-light-volume

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

양자점(QD) 나노입자를 에폭시 포매 인간 병리학 조직의 상관 면역세포화학적 연구에 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 당사는 광시야 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 시각화되는 상용 항체 단편 접합 QD를 사용합니다.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

간세포의 소기관 또는 다른 조직의 세포 사이의 막 접촉 부위의 입체 세부 사항을 획득하는 간단하고 포괄적 인 프로토콜.

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

이 프로토콜은 망막 광수용체 말단의 구조적 특징에 초점을 맞춰 부피 전자 현미경을 위해 망막 샘플을 준비하기 위한 자세한 단계를 설명합니다.

부피 전자 현미경을 위한 망막 시료 준비

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

학습하세요 코피라이트 및 부피 전자 현미경을 이용한 미토콘드리아와 소포체의 3차원 분포 분석 방법을. 유전자 변형 후 세포 소기관의 공간적 변화를 정밀하게 관찰할 수 있습니다.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

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