인간 섬유근육 조직을 시각화하기 위해 인산화산 제제를 사용한 마이크로 X선 컴퓨터 단층 촬영 사용
2019년 9월 5일
마이크로 X 선 컴퓨터 단층 촬영은 손상되지 않은 인간 표본에서 3 차원 정보를 얻는 데 효과적이지만 연조직 관찰에 는 성공이 제한적입니다. 인산조영제를 사용하면 이 문제를 해결할 수 있다. 우리는 인간의 섬세한 섬유 근육 조직 (안구 유지 인대)을 검사하기 위해이 조영제를 구현했습니다.
우리는 인간 orbicularis 유지 인대의 비 침습적 조사에서 연조직 대비를 향상시키기 위해 인조동산과 마이크로CT를 구현, 궤도 영역 내에서 섬세한 구조. 이 프로토콜은 인간 연조직의 비침습적 조사에 있는 연구원을 돕기 위하여 최적화되고 비용의 적당한 양으로 능력을 발휘하기 쉽습니다. 샘플을 얻으려면 먼저 색연필을 사용하여 샘플 수확을 위해 피부의 절단 영역을 나타냅니다.
표시된 선이 내측 캠퍼스로, 측면 캠퍼스로, 아래 눈꺼풀의 우수한 테두리에 우월하게, 궤도 림에서 라인 아래 1센티미터로 열등하게 확장되어 있는지 확인합니다. 다음으로 블레이드를 사용하여 표시된 라인을 따라 얼굴 조직을 잘라 블레이드 팁이 뼈를 만질 만큼 충분히 깊다는 것을 확인합니다. 수확된 견본은 피부, 피하 조직, 근육, 지방 및 periosteum을 포함해야 합니다.
수집 시 실온에서 5~7일 동안 10%의 포르말린으로 샘플을 즉시 수정합니다. 고정 기간이 끝나면 샘플을 5~7mm 두께의 3개 조각으로 자른다. 바늘과 검은 색 실을 사용하여 샘플의 방향을 나중에 결정할 수 있도록 각 샘플의 초측 면을 바느질한다.
농도당 1일 동안 상승하는 에탄올 농도 계열에서 시료를 탈수하여 얼룩이 날 때까지 70%에탄올 용액에 샘플을 남깁니다. 마이크로컴퓨터 단층 촬영 이 예정되기 1주일 전에 PTA 2.1그램을 70%에탄올210밀리리터에 추가하고 분당 55~60회 회전시 셰이커에 솔루션을 배치합니다. 슬라이스된 조각마다 70밀리리터 플라스틱 용기 3개를 준비합니다.
염료가 알코올 용액에 용해되면 용기에 용액을 채웁니다. 1%PTA의 각 용기에 표본 1개를 넣고 5~7일 동안 분당 55~60회 회전시 시료를 흔들어 줍니다. 염색이 완료되면 샘플을 1주일 동안 신선한 70%에탄올에 보관하여 스캔을 준비합니다.
microCT 스캐닝의 경우 파라필름에 샘플을 싸서 건조를 방지하고 샘플을 스캐너 트레이에 놓습니다. 스캐너의 소스 전압을 70킬로볼트로 설정하고, 소스 전류는 114마이크로앰프, 알루미늄 필터를 0.5밀리미터로, 이미지 픽셀 크기는 20제곱마이크로미터로, 픽셀은 2, 240 x 2, 240, 500 밀리초에 대한 노출, 회전 단계는 0.3도로 설정합니다. 그런 다음 스캔을 시작합니다.
스캔이 완료되면 재구성 소프트웨어를 열고 작업 및 데이터 집합을 선택하여 스캔된 파일을 시작합니다. 설정 탭을 선택하고 링 아티팩트 감소를 7개로 설정하고 빔 경화 보정을 설정합니다. 재구성을 시작하려면 시작을 선택합니다.
최종 데이터는 지정된 폴더에 저장됩니다. 재구성이 끝나면 파일 크기 조정 소프트웨어를 열고 원본 데이터 집합을 선택하여 재구성된 파일을 시작합니다. 대상 데이터 집합 탭에서 JPG를 선택하고 보간 없음의 품질 옵션으로 1/2 크기 조정 옵션을 선택한 다음 이미지 압축 탭에서 슬라이드 막대를 100으로 조정하고 변환을 시작합니다.
3D 재구성의 경우 3D 볼륨 렌더링 소프트웨어를 열고 작업 및 로드 볼륨 데이터를 선택합니다. 밝기 및 대비 수준을 조정하려면 전송 함수 편집기 탭의 히스토그램에서 셰이프 전송 함수를 수정합니다. 다음으로 옵션 및 조명을 선택하고 그림자 및 표면 조명 아이콘을 선택하여 사실적인 모델링 톤을 구현합니다.
클릭하고 드래그하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 드래그하여 3D 이미지를 이동하고 회전하여 최적의 뷰를 찾고 스크롤하여 원하는 대로 확대또는 축소합니다. 시프트를 클릭하고 드래그하여 단면 이미지를 보려면 장소를 밉니다. 라이트 아이콘을 켜고 조명 표시 막대를 조정하여 볼 수 있는 최고의 조명을 찾은 다음 라이트 아이콘을 끄고 조명 탭을 닫습니다.
옵션 탭에서 상자 표시 및 클리핑을 선택하여 최종 이미지에 대한 상자를 숨깁니다. 그런 다음 작업을 선택하고 이미지를 저장하여 이미지를 저장합니다. ORL의 이 상세한 재건은 입증된 바와 같이 PTA 준비와 microCT에 의해 달성되었다, 진피와 음막 사이 비스듬히 확장 인대 섬유 근육 구조의 시각화를 허용.
관상 관상보기에서 섬유의 양과 복잡성은 측면으로 증가합니다. 수평 뷰에서는 중단된 형성을 가진 정교한 메쉬워크가 관찰됩니다. 적신시야에서 ORL 섬유의 두께는 열등하게 감소합니다.
전반적으로, 이 다방향 관측은 ORL이 자신의 위치에 따라 섬유의 수와 두께의 변화와 연속 플레이트의 다층 메쉬 워크로 구성되어 있음을 증명한다. 시편의 부피에 비해 염색 지속시간이 충분하지 않은 경우, 최종 이미지는 시편의 중앙 영역에 빈 구멍을 포함할 수 있다. PTA 옆에 다른 에이전트를 사용할 수 있으며 다른 에이전트는 다른 장점이 있거나 얼룩 기능 관심사를 가지고있다.
따라서 실험에 따라 염색 영역을 최적화하는 것이 유용합니다.
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개요
본 연구는 인체 표본 내 연조직의 시각화를 향상시키기 위해 조영제로 인몰리브덴산(phosphotungstic acid)을 사용한 마이크로 X선 컴퓨터 단층촬영(microCT)의 활용법을 보여줍니다. 특히, 안와 영역 내의 섬세한 섬유근성 구조인 안륜유지인대(orbicularis retaining ligament)에 초점을 맞춥니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 이미징 기술
배경
- MicroCT는 손상되지 않은 인체 표본의 3차원 영상화에 효과적입니다.
- 기존의 microCT 방법으로는 연조직 시각화에 어려움이 있었습니다.
- 인텅스텐산(Phosphotungstic acid)은 연조직 영상의 대조도를 향상시킬 수 있습니다.
- 안륜 유지 인대는 세심한 취급이 필요한 섬세한 구조물입니다.
연구 목적
- 비침습적 영상에서 연조직 대조도를 향상시키기 위함입니다.
- 인체 연조직을 연구하는 연구자들에게 프로토콜을 제공하기 위함입니다.
- 섬세한 섬유근육 조직의 연구를 용이하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 인텅스텐산(phosphotungstic acid)을 이용한 microCT 구현.
- 인간 안륜 유지인대(orbicularis retaining ligament)로부터의 시료 채취.
- 피부의 절개 부위 표시를 위한 색연필 사용.
- 피부, 피하 조직, 근육, 지방 및 골막을 포함하는 세심한 박리.
주요 결과
- 인몰브스텐산(phosphotungstic acid)을 이용한 연조직 대조도 향상의 성공적 구현.
- 섬세한 조직의 비침습적 조사를 위한 최적화된 프로토콜.
- 해당 방법의 타당성 및 비용 효율성 입증.
- 인체 연조직에 관한 향후 연구를 위한 신뢰할 수 있는 접근법 제공.
결론
- 인몰브덴산(phosphotungstic acid)을 이용한 MicroCT는 연조직 영상화를 현저히 개선합니다.
- 이 방법은 섬세한 인체 조직과 관련된 다양한 연구에 적용될 수 있습니다.
- 향후 연구는 향상된 영상 기술을 위해 이 프로토콜을 기반으로 발전할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 방법은 정교한 인간 연조직의 비파괴적 3D 시각화를 가능하게 하여, 조직학적 절편 제작으로 인해 공간적 관계가 가려지는 전임상 타겟 검증의 주요 한계를 해결합니다. 섬유근 구조의 대조도를 향상시킴으로써 질병 메커니즘과 관련된 조직 구조를 명확히 하여, 초기 발굴 단계에서의 기전적 리스크 감소를 지원합니다. 이 접근법은 인간 관련 시스템에서 조직 수준의 표현형을 평가하기 위한 확장 가능하고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 물리적 절편 제작으로 인한 인위적 변형 없이 인간의 섬유근성 조직 내 구조적 가설을 조사할 수 있게 합니다.
- 운용적 가치: 표적 결합 모델의 리스크를 줄이기 위한 정량적 3D 형태 측정 데이터를 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 일관된 화합물 스크리닝 판독값을 얻기 위해 표준화되고 재현 가능한 조직 표본을 제작합니다.
- 운영적 가치: 정의된 염색 기간(5–7 days) 및 시료 두께(5–7 mm) 파라미터를 통해 분석 표준화를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 종단적 분석을 위해 인간 조직의 무결성을 보존함으로써 발견 단계와 전임상 워크플로를 연결합니다.
- 운영적 가치: 해석의 가변성을 줄여주는 공유 가능한 3D 데이터셋을 통해 부서 간 협업을 촉진합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 기술은 타겟 검증부터 전임상 평가에 이르는 발견 연속체(discovery continuum)에 부합하며, 소모적인 처리 과정 없이 조직 반응의 반복적인 평가를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 인체 조직 내 인대 네트워크의 공간적 조직화를 밝혀 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 효과 비교를 위한 정량적 구조 출력값(예: 섬유 두께, 망상 밀도)을 제공합니다.
- 분석: 용량-반응 모델링의 기초가 되는 3D 재구성 및 부피 측정을 제공합니다.
- 중개 연구: 적출물부터 분석까지 해부학적 충실도를 유지하여 바이오마커 기반의 조직 표현형 분석을 지원합니다.
- 기업 내 재사용: 초기 최적화 후 다양한 조직 유형(예: 신경, 암, 심장)에 적용 가능한 재사용 가능 이미징 프로토콜을 수립합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 연조직 표적 검증 시 기전적 모호성을 줄여 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: 표준화된 고정, 탈수 및 염색 프로토콜을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 발굴 파이프라인의 초기 단계에서 인체 관련 구조 데이터를 제공함으로써 go/no-go 의사결정을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 검증된 조직 수준의 표현형을 기반으로 표적의 리스크 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
실행 고려 사항
- 조직학적 표본 제작 및 microCT 조작에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 전압/전류 설정 조절이 가능한 microCT 스캐너와 재구성 소프트웨어의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 일관성을 위해 염색 기간(5–7 days) 및 표본 두께(5–7 mm)에 대한 팀 간의 합의가 필요합니다.
- 밀도나 지질 함량이 다양한 조직에 적용할 때 적응 고려 사항이 수반됩니다.
- 표본 부피 대비 염색 부족으로 인한 중심부 아티팩트(artifact)와 같은 실질적인 제한 사항이 포함됩니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Sample Acquisition
1:34
Staining and Phosphotungstic Acid (PTA) Preparation and Micro-Computed Tomography (microCT) Scanning
3:26
Data Reconstruction and Optimization
4:21
3D Reconstruction
5:31
Results: Representative 3D Orbicularis Retaining Ligament (ORL) Images
6:23
Conclusion
