Name: 근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 학습하세요 근육 생검에서 IgG 흡수를 이용한 괴사성 근섬유 면역표지 기법을. mdx 마우스 모델을 활용한 이 방법은 신경근육 질환의 근육 퇴행성 변화를 정확히 평가하여 진단 및 치료 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 Translamuscle 프로그램과 협회 프랑수아즈 콘트레 레 Myopathies에 의해 지원되었다. 저자들은 펄라 레예스-페르난데스 박사와 매튜 보록 박사가 원고를 주의 깊게 읽은 것에 대해 감사를 표합니다.

실험은 프랑스 및 유럽 공동체 법규(라이센스 번호 11-00010)에 따라 수행되었습니다.
1. 트라가칸스 잇몸 준비
<ol><li>유리 비커에 100 mL의 탈이온수에 트라가칸스 분말 6 g을 녹입니다. 호일로 덮고 적어도 3 시간 동안 방치하십시오. 혼합물이 점성이 빠르게 됨에 따라 금속 주걱으로 수동으로 저어줍니다.</li>
	<li>트라가칸스 혼합물을 수조 나 오븐에서 하룻밤 동안 60 °C에서 둡니다. 건조를 피하기 위해 비커를 조심스럽게 밀봉하십시오. 알리쿼팅하기 전에 적어도 한 번 저어주세요.</li>
	<li>알리쿼트 및 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>2. 근육 수집
참고: 이 실험을 위해, 4주 된 남성 mdx 마우스는 자궁 경부 탈구에 의해 희생되었습니다. 이 절차는 마취를 필요로하지 않으며 현지 법률에 따라 인도적 살인 방법입니다.
<ol><li>경골 전방의 해부 (TA) 근육<ol>
<li>마우스 다리를 면도 한 후 마우스를 등에 놓고 바늘로 코르크 보드에 발을 고정하십시오. 정밀 가위 (또는 메스)와 집게를 사용하여 발에서 무릎까지 다리 피부를 제거하여 경골과 TA의 전체 길이를 노출시하십시오.</li>
		<li>가위로 경골과 TA 를 절개하십시오. 이것은 뼈에서 TA의 분리를 용이하게하고 에피미슘에 쉽게 그립을 제공 할 것입니다. 정밀 집게를 사용하여 TA 표면에서 상피 층을 조심스럽게 제거합니다. 참고: 이 단계에서 TA는 건조에 더 취약할 수 있으며, 이를 피해야 합니다.</li>
		<li>발목 부위에서 TA 힘줄을 집게로 다른 힘줄과 분리합니다. TA 힘줄을 부드럽게 당겨 경골과 주변 근육에서 분리하십시오.</li>
		<li>TA 배가 완전히 분리되면, TA 근육의 근위 부분만 무릎에 부착되도록 힘줄을 들어 오섭을 잡으하십시오. 무릎 뼈에 가능한 한 가까운 근위 힘줄을 부드럽게 끊습니다.</li>
		<li>근육을 동결하기 전에 건조를 피하기 위해 식염수로 가볍게 감쇠 된 거즈에 TA를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스틱 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 비에 있는 이소펜탄의 프리 쿨링 70-100 mL은 부분적으로 액체 질소에 담그고. 비커 의 바닥에있는 이스펜타인이 흰색 고체가 될 때까지 식힙니다.</li>
	<li>코르크 (20mm x 11mm x 8mm)의 원형 조각에 ~ 0.5 mL의 트라가칸스 껌을 놓습니다. 생검이 동결 단계 후에 제대로 확인될 수 있도록 조심스럽게 코르크의 다른 쪽에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>집게, 원위 힘줄로 잇몸에 TA를 포함. 근육의 적절한 단면을 허용하려면 코르크 표면에 수직으로 축을 가진 근육을 잡으하십시오. 생검이 잇몸에 완전히 내장되지 않으면 저온 절의 품질이 향상됩니다. TA (힘줄 측)의 적어도 절반이 잇몸에 의해 드러나도록 하십시오.</li>
	<li>빨리 고정되지 않은, 차가운 isopentane 층에 내장 된 근육코르크를 찍어. 코르크는 액체 isopentane에 떠있을 것입니다. 근육을 이소펜타인으로 담그어야 하므로 샘플을 거꾸로 잡으하십시오. 샘플을 이소펜타인에 약 2분 간 두어 완전한 동결을 허용합니다. 참고: 이 단계에서 TA는 냉동 된 때까지 동결 된 상태로 유지되어야합니다. -80°C 냉동고에 장기간 보관하기 전에 근육을 드라이 아이스에 보관하십시오.</li>
</ol>3. 냉동 부속
<ol><li>저온 온도를 -25°C로 설정합니다. 물체 온도를 -20 °C 정도유지하십시오. 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물을 사용하여 저온 중지에 물체를 고정합니다. 근육 배에 도달 할 때까지 근육을 손질 한 다음 7-10 μm 섹션을 잘라. 참고: 물체 온도의 안정화에는 최소 10분이 필요합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 저온 절을 수집하는 데 사용되는 유리 슬라이드를 보관하십시오. 각 슬라이드에 두 개 이상의 섹션을 수집합니다. 근육 섹션은 따뜻한 유리 슬라이드의 접촉시 자동으로 달라붙어 해동됩니다. 슬라이드를 제거하고 RT에 보관합니다.</li>
	<li>환기 가식 있는 환경에서 RT에서 섹션이 적어도 20분 동안 건조되도록 하십시오.</li>
	<li>사용 전까지 유리 슬라이드에 냉동 절을 -80°C로 보관하십시오.</li>
</ol>4. 면역 라벨링
<ol><li>환기 환경에서 RT에서 15분 이상 슬라이드를 해동합니다.</li>
	<li>소수성 펜으로 섹션 영역을 묘사합니다. 소수성 장벽이 건조되도록 하십시오.</li>
	<li>습한 챔버에서 10 분 동안 2 % 파라 포름 알데히드로 조직을 고정하십시오.</li>
	<li>인산염 완충 식염수(PBS) 2x로 각 부분을 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>습한 챔버에서 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 희석 된 10 % 염소 혈청으로 근육 섹션을 차단하십시오.</li>
	<li>5% 염소 혈청에서 희석된 1차 항체를 가진 습한 챔버에서 RT(또는 4°C에서 하룻밤)에서 2시간 동안 섹션을 배양한다. myofibers에 간단한 IgG 섭취 라벨링의 경우, 토끼 항체가 있는 부분만 을 마우스 팬-라미닌에 배양합니다. 참고: 세포외 기질의 다른 항원들은 근섬유의 주변 세포외 기질에 대한 명확한 라벨링을 제공하는 한 표적으로 삼을 수 있다. 근육 재생, 염증 또는 다른 파라미터에 대한 마커는 항체가 마우스 숙주에서 제기되지 않는 한 결합될 수 있다. 분석에 사용되는 현미경은 보충 형광 색상을 포함해야 한다.</li>
	<li>각각 5분 동안 PBS 3x로 섹션을 세척합니다.</li>
	<li>붉은 형광 염소 폴리 클론 이차 항체를 토끼 IgG H&L 및 녹색 형광 염소 폴리 클로날 이차 항체로 섹션에 배양하여 습한 챔버에서 45 분 동안 RT에서 IgG H & L. 인큐베이터를 마우스로 배양합니다.</li>
	<li>각각 10분 동안 PBS 3x로 씻으소서.</li>
	<li>100 ng/mL 4′, 6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)를 포함하는 형광 장착 매체에 섹션을 장착하고 각 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다.</li>
	<li>이미징 전에 4°C에서 밤새 건조시키십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%3A+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li>
<li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases%3A+cytochemical+and+immunocytochemical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differerentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655(2018).</li>
<li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li>
<li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li>
<li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li>
<li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li>
<li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li>
<li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+21+years+experience+in+Wales+%28UK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li>
<li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li>
<li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li>
<li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+blood-brain+barrier+integrity%3A+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives%3F+Frontiers+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%229%22%5BJournal%5D)">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li>
<li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+%28mdx%29+and+normal+muscle+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li>
<li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

Myofiber 괴사는 정상적인 근육에서 외상성 운동의 일반적인 결과입니다. 그것은 잘 로컬 근육 선조의 강력한 재생 능력에 의해 보상. 그러나, 여러 근육 조건에서 MDs에서, 위성 세포의 재생 용량 만성 근조와 과도 한 섬유 증에 의해 손상. 최근 연구 결과에 따르면 근육 섬유는 괴사의 규제 형태인 necroptosis에 의해 죽을 수 있습니다. 보다 구체적으로, necroptosis의 억제는 DMD 처리를 위한 새로운 치료 전략이 될 수 있습니다4. 근육 변성 장애에서 세포 사멸 경로를 조사하는 것은 근육 세포 사멸 정량화의 신뢰할 수있는 방법을 필요로한다. 이 프로토콜은 괴사를 겪은 myofibers를 표지하는 IgG 장악성 면역 형광 기술을 기술합니다.
괴사를 특징짓는 혈장 막 무결성의 손실은 손상 관련 분자 패턴의 방출과 알부민, IgG 및 IgM15와같은 혈장 단백질의 섭취로 이어집...

줄무늬 골격근은 주로 특징적인 자발적 수축 기능을 담당하는 근육 섬유 (myofibers)로 구성됩니다. 이 세포는 수축 도중 일어나는 기계적인 응고를 지원하는 다중 핵화, 포스트 유사분열 구조물입니다. 근섬유소막(사르콜엠마)과 세포외 매트릭스의 구조적 안정성은 조직 항상성에 매우 중요합니다. 위성 세포는 성숙한 골격 근에서 주요 근육 전구 집단을 구성하고 건강한 근육에서 정지 상태에 존재한다. myofiber 죽음 다음, 근육 재생은 궁극적으로 새로운 다핵근 화파이버를 형성하기 위해 위성 세포 활성화, 증식, 분화 및 융합을 포함하는 myogenic 프로그램을 따르는 위성 세포에 의해 지원됩니다.
Myofiber demise는 기계적 외상, 허혈 재관류 상해, 또는 근육 이영양증을 포함하는 다중 근육 조건에서 생길 수 있고, 죽은 세포의 괴사 형태와 연관된다1,2. 괴사염은 혈장막의 급속한 투과성 및 세포외 구획내의 세포 함량의 방출을 특징으로한다 3. 그것은 적절한 세포 신호 (즉, 우발적 인 괴사) 또는 오케스트레이션 된 세포 내 통로 (즉, 조절 된 괴사)를 포함하는 관계가없는 과정중 하나에서 발생할 수 있습니다. myofibers에서, 규제4 및 관계가 없는5 프로세스 는 괴사로 이어질 수 있습니다. 근위병의 전형적인 결과는 손상 관련 분자 패턴의 방출이며, 강력한 염증반응을활성화6. 대식세포의 존재는 부상7다음 약 48 시간 및 72 시간에서 관찰된다. 괴사 파편의 정리에 있는 그들의 역할 이외에, 그(것)들은 또한 근육 재생에 중요합니다8,9.
근 위축증 (MDs)은 종종 사르콜렘 구조의 결함으로 인한 이질적인 병리학 그룹입니다. Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 전 세계 3,500명의 남성 출생 중 대략1에영향을 미치는 청소년 X 연결된 질병이고, sarcolemma에 dystrophin 표현의 부재에 기인합니다. DMD 소년에서 근육 조직의 만성 변성 극단적인 근육 약점 및 초기 사망에 이르게. 괴사에 의한 염증은 세포 독성을 향상시키고 근육 섬유증및 근육 기능의 상실을 촉진한다11,12. 유전자 치료와 같은 근육 퇴행성 질환의 뿌리를 대상으로 하는 임상 시험에서 현재 치료는 근위대증을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 변성을 정확하게 정량화하는 간단한 기술이 필요합니다.
생체 내에서 근섬유 손실을 모니터링하기 위해 여러 가지 방법이 일상적으로 사용됩니다. 혈액내 크레아틴 키나아제(CK)의 효소 활성을 측정하면 근육과 심장 조직에서 지속적인 괴사의 신뢰할 수 있는 정량화를 가능하게 합니다. 이 시장에서 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색은 변성 재생 재생을 평가하기 위해 현재 진단에 사용되는 가장 인기 있는 방법입니다. 그러나, 죽은 세포의 H&E 라벨링의 분자 기초는 불분명남아 있습니다. 또한 H&E 염색에서 myofiber 죽음을 암시하는 색상 수정은 상대적으로 미묘하며 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량화를 용이하게하지 않습니다. DNA 단편화를 밝히는 방법, 예: 말단 디옥시클레오디딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL), 불완전 라벨 괴사3. 그(것)들은 또한 myofibers와 같은 동기화한 세포의 죽음을 감시하기 위하여 제대로 적응됩니다. Evan의 청색 염료 (EBD)와 같은 중요한 염료의 주입은 사르콜렘의 무결성을 잃은 근섬유를 평가하기위한 유용한 대안을 나타내지만 일부 실험 프로토콜에서 반드시 편리하지는 않습니다. 예를 들면, 혈액 샘플에 있는 EBD의 존재는 CK 측정, colorimetric 분석결과의 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, EBD의 세포 내 섭취는 공동 면역 라벨링을 어렵게 만듭니다. 따라서 괴사를 겪고있는 myofibers의 직접 라벨링을 허용하는 대체 방법이 흥미 로고입니다.
중요한 염료의 작용 메커니즘은 괴사 성 myofibers의 플라즈마 막 무결성의 손실과 주입 된 염료의 수동 적인 섭취에 의존합니다. 유사하게, 괴사성 근섬유는 알부민과 같은 혈액 단백질을 섭취하며, 이는 EBD가 강한 친화성을 가지는13,14,면역글로불린 G(IgG) 및 IgM15이다. 따라서 myofibers 내의 혈액 단백질의 이상한 존재는 구내에서 근위대근에 대한 편리한 마커를 나타냅니다. 이 단백질을 염색하는 것은 중요한 염료의 사용을 위한 대안이 될 수 있습니다.
IgG 섭취량을 중계근의 마커로 사용하여, 이 프로토콜은 mdx 디스트로핀 결핍 마우스의 경골 전방(TA)에서 근육 변성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 대체 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다: 1) 실행시 재현가능하고 간단합니다. 2) 순환하는 필수 염료의 주입과 같은 근육 수집 전에 어떠한 동물 치료도 필요하지 않으며, 3) 임의의 통상적인 면역라벨링으로서, 공동 라벨링과 호환된다.

<table><tbody><tr><td>원형 코르크 디스크</td><td>Pyramid Innovation</td><td>R30001-E</td><td>냉동 후 샘플의 ID를 결정할 수 있도록 코르크에 명확하게 라벨을 붙이는 것을 잊지 마십시오</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 sn34</td><td>근육 동결 절제는 -20에서 -25°C 사이에서 수행해야 합니다. 두께: 7-10 마이크로미터.</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>근육 부분 주위의 소수성 장벽. 배양 중 배지의 변형을 방지합니다</td></tr><tr><td>겸자</td><td>FST</td><td>91117-10</td><td>/</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG (H+L) 항체, Alexa Fluor Plus 488</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11029</td><td>희석: 1/500</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG (H+L) 항체 Alexa Fluor Plus 594</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A32740</td><td>희석: 1/500</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td>차단 단계에서 PBS에 10% 희석액을 사용합니다. 항체 배양의 경우 PBS</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78-78-4</td> 동결 매체에 5% 희석액을 사용합니다<td>. 액체 질소에 넣은 비커에서 냉각해야 합니다.</td></tr><tr><td>mdx 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td><td>Mdx 마우스는 dystrophin 유전자에 대해 돌연변이가 있습니다. 생후 3주령부터 근육은 만성 퇴행이 특징입니다</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D1</td><td>/</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Cellpath</td><td>KMA-0100-00A</td><td>Embedding matrix</td></tr><tr><td>PFA (Paraformaldehyde)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>28908</td><td>cryosection 고정에 사용(2% 또는 4% PFA 사용 가능)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Eurobio</td><td>CS3PBS00-01</td><td>희석 배지 면역 라벨링</td></tr><tr><td>정밀 가위</td><td>FST</td><td>fst 14001-12 및 fst 14001-14</td><td>근육 수집에 사용</td></tr><tr><td>토끼 항체 마우스 pan-Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td>희석 : 1/1000</td></tr><tr><td>Tragacanth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1128</td><td>Aliquots to keep at +4&deg; 씨</td></tr></tbody></table>

근육 생검에 있는 면역 표지하는 myofiber 변성

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

근육 섬유의 괴사 (myonecrosis)는 근육 이영양증을 포함한 여러 근육 조건의 발병 기전에서 중심적인 역할을합니다. 근 위축병발생의 원인을 해결하는 치료 옵션은 근육 변성을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 생검에서 세포 사멸 정도를 분석하고 정량화하는 방법이 필요하다. 종래의 방법은 장소에서 근섬유 변성을 관찰하는 것이 양적 또는 필수 염료의 주입에 의존한다. 본 문서에서, 면역형광 프로토콜은 myofibers에 의한 면역글로불린 G(IgG) 섭취량을 표적으로 하여 괴사 된 myofibers를 염색하는 것을 기술한다. IgG 섭취 방법은 1) 손상 관련 분자 패턴의 방출과 함께 혈장 막 무결성의 손실 및 2) 혈장 단백질의 섭취를 포함하여 괴사 멸망을 특징짓는 세포 특징을 기반으로 한다. 뮤린 단면에서, myofibers, 세포외 매트릭스 단백질 및 마우스 IgG의 공동 면역 표지는 괴사 운명과 myofibers의 깨끗하고 간단한 식별을 허용합니다. 이 간단한 방법은 정량 분석에 적합하고 인간 샘플을 포함한 모든 종에 적용 가능하며, 필수 염료의 주입을 필요로하지 않는다. IgG 섭취량에 의한 괴사 성 myofibers의 염색은 또한 다른 공동 면역 라벨링과 결합 될 수 있습니다.

묘섬유는 라미닌 함유 세포외 기질로 둘러싸여 있습니다. 붉은 얼룩은 근섬유 주변을 제한하고 식별을 허용합니다. IgG는 녹색으로 표시됩니다. 핵은 DAPI로 염색되고 현미경의 밑에 파란 찾아낸다. 그러나 핵은 여기에 흰색으로표시됩니다(그림 1). 약한 IgG 면역 반응성은 염증의 경우에 증가될 수 있는 세포외 구획에서 예상됩니다. 근섬유 내의 녹색 염색은 IgG의 존재를 반영합니다.
Mdx 마우스 TA는 3 주에 급성 근각증의 일시적인 단계를 특징으로하며, 그 다음에 비동기 변성 재생 이벤트가 뒤따릅니다. 그 결과, 4주된 mdx 마우스의 타스는 종종 동일한 단면에서 함께 저하 및 재생 영역을 포함하여 이질적인 프로파일을 표시한다(도1a).</...

여기서 설명된 것은 근육 저온절에서 괴사 성 근섬유의 직접 면역 라벨링을 위한 프로토콜이다. 괴사 세포는 면역 글로불린 G (IgG)를 포함하는 혈청 단백질에 투과성이다. myofibers에 의해 IgG의 섭취를 공개하면 근육 상태에 관계없이 괴사를 겪는 myofibers의 식별 및 정량화를 할 수 있습니다.

근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

근섬유 괴사는 다중 신경 근육 장애의 특징이며 병인발생에 중심적인 역할을 합니다. 근육 변성을 평가하기위한 구체적이고 신뢰할 수있는 방법은 진단 및 번역 연구에 중요합니다. 이 매우 적응 가능한 기술은 근섬유 내의 동일한 섹션에서 동시에 다중 항원의 라벨링을 허용합니다.그것은 중요한 염료로 가능합니다. H&E 염색은 안정적이고 재현 가능한 인주에 적응할 수 없는 경험적 방법입니다. IgG 섭취 염색, 그러나, 괴사 근육 세포에 대 한 특정 하 고 인간의 생검에 적용.이 기술은 myonecrosis특징모든 신경 근육 장애에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 관심의 다리에서 머리를 제거 한 후 4 주 된 수컷 mdx 동물을 supine 위치에 배치하고 코르크 보드에 발을 고정시하십시오. 정밀 가위 또는 집게를 사용하여 다리 피부를 무릎으로 제거하여 경골과 티비알리스 전방의 전체 길이를 노출시합니다.가위를 사용하여 경골과 티비알리스 전방 을 절개하십시오. 집게를 사용하여 근육 표면에서 에피미슘 층을 조심스럽게 제거하십시오. 발목에서, 다른 힘줄에서 티비알리스 전방 힘줄을 분리하고 경골과 주변 근육에서 분리하는 힘줄을 부드럽게 당기려면 집게를 사용합니다.티비알리스 전방 배가 완전히 분리되면 힘줄을 들고 티비알리스 전방 근육의 근위 부분만 무릎에 부착되도록 합니다. 그리고 슬개골에 가능한 한 가깝게 근위 힘줄을 부드럽게 끊습니다. 건조를 피하기 위해 식염수로 가볍게 약해진 거즈 조각에 티비알리스 전방을 놓습니다.비커의 바닥에 있는 이스펜탄이 백색 고체가 될 때까지 이스펜타네70 밀리리터의 70~100밀리리터를 액체 질소 용기에 부분적으로 담급니다. 코르크의 반대편을 주의 깊게 미리 라벨을 부착하여 생검을 동결 한 후 제대로 식별할 수 있도록 하고, 약 0.5 밀리리터의 트라가칸스 껌을 20~11mm의 코르크 원형 조각에 추가합니다. 집게를 사용하여 티비알리스 전방을 잇몸 말힘 쪽으로 삽입하십시오.축이 코르크 표면에 수직으로 근육을 유지합니다. 티볼리스 전방의 힘줄 측면의 적어도 절반은 잇몸에 의해 밝혀져야 합니다. 그런 다음 코르크를 차가운 냉동되지 않은 디언타네에 넣고 약 2분 동안 완벽하게 동결할 수 있도록 빠르게 찍어줍니다.냉동 조직의 단면을 얻고, 극저온 온도를 영하 25도로 설정하고 최적의 절삭 온도 화합물을 사용하여 조직을 극저온 절단 블록에 고정시하십시오. 근육 배에 도달 할 때까지 샘플을 손질. 섹션이

immunolabelling-myofiber-degeneration-in-muscle-biopsies

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

여기에서는 개선 된 염색 품질함으로써 자동 취득하고 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용 ImageJ에 섬유 집단의 정량화를 허용 빠른 근섬유 분석을위한 프로토콜을 제시한다.

마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

우리는 우리가 전화 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME), 골격 근육 조직 기증자 세포 중재 하는 myogenesis로 이식 때 용이 하 게 수 있는 가능한 조직적 셀을 포함 하는 증거에 근거 하는 소설 실험 기법을 설명 호스트 근육입니다.

최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

활성 autophagy는 근육 줄기 세포 (MuSC) 활성화에 필수적인 생산적인 근육 재생과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 LC3의 현장 검출을위한 프로토콜을 제공합니다. LC3는 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편의 MyoD- 양성 MuSC에서의자가 작용 마커입니다.

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

이 프로토콜에서 근육 줄기 세포에 대한 체외 배양 및 기능 분석 방법이 설명되어 있어 내인성 틈새 시장을 통해 대부분의 상호 작용을 보존합니다.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

이 프로토콜은 산화성 가자형상근에서 온전한 단일 근섬유를 분리하고, 이 섬유에서 유래한 고정제된 근모아 배양을 구축하는 과정을 설명합니다. 최적화된 절차는 마우스당 약 300–500개의 온전한 근섬유를 신뢰성 있게 얻어 하위 분자 및 세포 분석을 가능하게 합니다.

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

연수생의 미세 바늘 흡인의 biopsies (FNAB)의 연습하면 쉽게 사용할 수, 해당 병변의 부족으로 인해 상대적으로 도전합니다. FNAB 절차 및 마스터링 능력을 연습을위한 AV 환상의 병변의 준비는 비교적 간단합니다.

준비 및 파인 니들의 열망의 Biopsies 연습을 팬텀 조직 손상을 사용하여

학습하세요 근육 생검에서 IgG 흡수를 이용한 괴사성 근섬유 면역표지 기법을. mdx 마우스 모델을 활용한 이 방법은 신경근육 질환의 근육 퇴행성 변화를 정확히 평가하여 진단 및 치료 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성

더 많은 동영상 탐색