Name: 비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 학습하세요 Vibrio fischeri 균주 간 경쟁 메커니즘을 동전 분석으로 정량화하는 방법을. 형광 단백질과 항생제 내성 유전자를 활용한 이 프로토콜은 미생물 생태학 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 그들의 유용한 피드백에 대한 검토자에게 감사드립니다. A.N.S.는 그랜트 GBMF 255.03을 통해 고든과 베티 무어 재단의 지원을 받아 생명과학 연구 재단에 지원되었습니다.

<ol><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li>
<li>Dörr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li>
<li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li>
<li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria%2C+and+is+differentially+regulated+from+system+2%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086(2013).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068(2010).</li>
<li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li>
<li>García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated%2C+glycine+zipper+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869(2017).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li>
<li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li>
<li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+microbial+interspecies+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li>
<li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li>
<li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li>
<li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+CDI+systems+multicolored%2C+facultative%2C+helping+greenbeards%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+growth+inhibition+%28CDI%29+and+CdiB%2FCdiA+two-partner+secretion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li>
<li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim%2C+load%2C+fire%3A+the+type+VI+secretion+system%2C+a+bacterial+nanoweapon%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li>
<li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li>
<li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li>
<li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li>
<li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li>
<li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031(2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734(2009).</li>
<li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li>
<li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li>
<li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift%3A+CpsV+regulates+type+VI+secretion%2C+biofilm+formation%2C+and+association+with+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

전술한 코인큐브레이션 분석법은 박테리아 간 경쟁을 발견할 수 있는 강력한 방법을 제공한다. 이러한 접근법은 V. fischeri 격리 및 경쟁 메커니즘의 특성화 사이의 특정 경쟁의 식별을허용19. 기재된 방법은 해양 균 V. fischeri에최적화되었지만 임상 및 환경 분리를 포함한 다른 세균 종을 수용하기 위해 용이하게 변형될 수 있다. 경쟁 메커니즘은 종종 조건부 5, 6,23,24,25,26,27 규제된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다....

이 원고는 두 개의 세균 성 분리가 경쟁적인 상호 작용을 할 수 있는지 여부를 결정하는 문화 기반 방법을 간략하게 설명합니다. 혼합 인구를 연구할 때, 박테리아 격리가 상호 작용하는 정도, 특히 격리가 간섭 메커니즘을 통해 직접 경쟁하고 있는지 여부를 평가하는 것이 중요합니다. 간섭 경쟁은 한 집단이 직접 성장을 억제하거나 경쟁집단을 죽이는 상호 작용을 말합니다 1. 이러한 상호 작용은 미생물 커뮤니티의 구조 및 기능2,3에심오한 영향을 미칠 수 있기 때문에 식별하는 것이 중요합니다.
미생물 경쟁을 위한 기계장치는 호스트 관련및 자유로운 생활 박테리아를포함하여 다양한 환경에서 박테리아의 게놈에서 광범위하게 발견되었습니다 4,5,6,7, 8,9. 다양한 경쟁 전략이 기재된10,11은 살균 화학물질 1,12 및분비된 항균 펩티드(13)와 같은 확산성 기전을 포함한다. 뿐만 아니라 표적 세포로 억제 효과를 전달하기 위해 세포 접촉을 필요로 하는 접촉의존적 메커니즘 9,14,15,16,17 ,18.
배양 기반 동전은 일반적으로 미생물학5,8,19에서사용되지만, 이 원고는 분석법을 사용하여 경쟁 메커니즘을 특성화하는 방법과 적응을 위한 제안을 간략하게 설명합니다. 다른 세균 종과 함께 사용하기위한 프로토콜. 또한 이 방법은 경쟁 상호 작용의 특성에 대한 다양한 질문에 답하기 위해 데이터를 분석하고 제시하기 위한 여러 접근 방식을 설명합니다. 여기에 기술된 기술은 이전에 비브리오 피셔리 박테리아(19)의 공생 균주 사이의 비특이적 경쟁기의 근본적인 교단 내 생존 메커니즘을 확인하기 위해 사용되었지만, 이들은 환경 분리및 인간 병원균을 포함한 많은 세균종은 접촉 의존성 및 확산성 경쟁 메커니즘을 평가하는 데 활용될 수 있다. 프로토콜의 단계는 다른 세균 종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 더 많은 모델 시스템이 다른 유전자형을 포함하는 등소원 성 유기체의 사용을 넘어 연구를 확장하고 있음을 감안할 때10,16,20,21,이 방법은 귀중한 자원이 될 것입니다. 경쟁이 다중 균주 또는 다종 시스템에 미치는 영향을 이해하고자하는 연구자.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L 멀티채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L 멀티채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L 멀티채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L 싱글 채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L 싱글채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & L 싱글채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; L 단일 채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>멸균(뚜껑 포함</td></tr>) <tr><td>96웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>멸균(뚜껑 포함</td></tr>) <tr><td>계산기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>스톡(에탄올 중 20mg/mL);매체의 최종 농도(2 &mu; g/mL LBS)카메라</td></tr> <tr><td>및 이미징 소프트웨어를</td><td></td><td></td><td></td>사용한 형광 해부 현미경</tr><tr><td>집게</td><td>Fisher</td><td>08-880</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize);매체 내 최종 농도 (1 &mu; g/mL LBS)</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인(FS MCE, 25MM, NS)</td><td>피셔</td><td>SA1J788H5</td><td>0.22 &mu; m 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (pk of 100)</td></tr> <tr><td>페트리 플레이트</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>뚜껑이있는 멸균</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세미 마이크로 큐벳</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 0.1-10 &mu; L 스타터 시스템</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3500</td><td>10 랙</td></tr><tr><td>TipOne 200 &mu; L 스타터 시스템</td><td>USA Scientific</td><td>1111-500</td><td>10 랙</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; L 스타터 시스템</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2520</td><td>10 랙</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>LBS media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M 트리스 버퍼 (pH ~7.5)</td><td></td><td></td><td>50 mL 1 M 스톡 버퍼(62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Fisher</td><td>DF0812-17-9</td><td>15 g (플레이트에만 추가)</td></tr><tr><td>DI water</td><td></td><td></td><td>950 mL</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>20 g</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Fisher</td><td>BP97265</td><td>10 g</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td>5 g</td></tr></tbody></table>

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

이 원고는 두 박테리아 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 감지하고 특성화하기 위한 배양 기반의 동전 분석기를 설명합니다. 이 방법은 각 인구의 선택과 시각적 인 차별을 위해 각 인구가 뚜렷한 항생제 내성 기능 및 형광 단백질로 차별적으로 태그 될 수 있도록 안정적인 플라스미드를 사용합니다. 여기에서는, 우리는 경쟁하는 Vibrio fischeri 긴장, 형광 현미경 화상 진찰 및 정량적인 데이터 분석의 준비 그리고 동전을 기술합니다. 이 접근법은 간단하고, 빠른 결과를 산출하고, 한 집단이 다른 집단의 성장을 죽이거나 억제하는지, 그리고 경쟁이 확산 가능한 분자를 통해 매개되는지 또는 직접적인 세포 세포 접촉을 필요로 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 각 세균성 인구는 다른 형광 성 단백질을 표현하기 때문에, 분석은 혼합 된 식민지 내에서 경쟁 인구의 공간 차별을 허용합니다. 기재된 방법은 이 종에 최적화된 조건을 사용하여 공생 균 V. fischeri로 수행되지만, 프로토콜은 대부분의 균류균 분리에 적응될 수 있다.

세균 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 평가하기 위해, 동전 분석 프로토콜이 개발되고 V. fischeri에최적화되었다. 이 방법은 항생 저항 유전자 및 형광 성 단백질을 인코딩하는 안정한 플라스미드를 활용하여 각 균주의 차등 선택 및 시각적 차별을 허용합니다. 동전 분석에서 수집된 데이터를 분석함으로써, 상호작용의 경쟁적 결과 및 상호작용의 메커니즘을 식별할 수 있다. 일례로, 다음의 실험은 V. fischeri 분리체를 사용하여 수행하였다. 동전 균주는 두 개의 안정적인 플라스미드 중 하나를 품고 있었다: pVSV102 카나마이신 저항 및 GFP +를 표현, 또는 pVSV208 클로람페니콜 저항 및 DsRed +를 표현. 샘플 데이터에서, 균주는 1:1 비율로 혼합하고 LBS 한천 플레이트에서 5시간 동안 배양하였다. 대조군 처리로서, 기준 균주의 차별화태그된 버전을 서로 코인큐베이팅하였다. 실험적 처리는 기준 균주(항만 pVSV102)...

박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

우리의 프로토콜은 비브리오 피셔리 박테리아의 다른 균주 사이의 경쟁 메커니즘을 식별하고 특성화하기 위한 간단하면서도 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 혼합 배양에서 각 세균긴장의 차등 선택 및 시각 차별을 허용하는 다른 항생 저항 유전자 및 형광 단백질을 인코딩하는 안정적인 플라스미드를 사용합니다. 먼저 멸균 이쑤시개를 사용하여 쌀 알갱이 크기의 한천 접시에서 세포를 긁어냅니다.LBS 국물의 1 밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 덩어리를 분해하려면 튜브 의 측면으로 누른 다음 적극적으로 위아래로 피펫을 넣습니다. 튜브와 소용돌이를 1~2초 동안 닫고 샘플이 시각적으로 균일할 때까지 세포 덩어리가 계속 보이면 반복합니다.셀 스크레이핑에서 모든 샘플에 대한 소용돌이에 이르는 이러한 준비 단계를 반복합니다. 모든 시료에 대해 600나노미터의 광학 밀도를 측정하고 기록합니다. 정확한 OD 측정을 얻으려면 LBS 국물을 사용하여 샘플을 최대 10배까지 희석합니다.그런 다음 각 샘플을 원하는 OD 600으로 정규화합니다. 기준 균주와 경쟁사 균주를 1 대 1 비율로 혼합하려면 1~2초 동안 표시된 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브및 소용돌이에 OD 1.0으로 정규화된 각 변형의 100마이크로리터를 추가합니다. 컨트롤로, 또한 그 자체와 소용돌이의 차별화 태그 버전과 참조 변형을 혼합.실험결과를 상당히 바꿀 수 있으므로 올바른 시작 비율을 달성하는 것이 중요합니다. 성공을 보장하기 위해,이 단계는 주어진 세균 성 종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 각 생물학적 복제에 대해 이 단계를 반복한 후, 대조군으로 분화된 기준균과 4개의 생물학적 복제가 분화된 참조 및 경쟁균주로 4개의 생물학적 복제가 있어야 합니다.배양 후 형광 현미경 검사법에 사용되는 배양 반점을 만들기 위해 각 컨트롤의 10 마이크로리터와 실험 혼합물을 LBS 천을 함유한 페트리 플레이트에 추가합니다. 반점이 완전히 벤치에 건조 한 후, 24 시간 동안 섭씨 24도에서 접시를 배양. 실험이 끝날 때 각 균주에 대한 콜로니 형성 유닛을 정량화하는 데 사용되는 배양 반점을 만들기 위해 각 제어 및 실험 혼합물의 10 마이크로리터를 24개의 웰 플레이트에 추가하여 LBS 한천 1밀리리터를 잘 함유하고 있습니다.반점이 완전히 말린 후 5 시간 동안 섭씨 24도에서 접시를 배양하십시오. 시작 코인큐베이션 혼합물의 직렬 희석을 수행하려면 96 웰 플레이트 90도 회전하여 8개의 열과 12개의 행이 있습니다. 스트레인 ID, 복제 번호 및 t 0으로 시작하는 시간으로 각 행에 레이블을 지정합니다.LBS 한천 플레이트에 라벨을 부착하여 희석 계열을 발견하는 동시에 각 항생제 플레이트가 선택하는 균주를 식별합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 180 마이크로리터의 LBS 국물을 각 웰에 추가하여 희석되지 않은 동전 을 혼합하기 위해 첫 번째 열을 비워 둡니다. 200 마이크로리터 단일 채널 파이펫을 사용하여, 첫 번째 컬럼의 첫 번째 우물에 튜브에서 동전 배큐레이션 혼합물의 100 마이크로 리터를 전송한 다음 팁을 버리고 모든 coincubation 혼합물을 반복합니다.멀티 채널 파이펫을 사용하면 컬럼 1개에서 2열로 20마이크로리터를 전송하고 파이펫을 위아래로 섞어 주세요. 각 희석에 대해 위아래로 파이펫팅 하는 수와 일치 하면서 팁을 삭제 하 고 각 열에 대 한 반복. 끝으로, 각 행은 초기 혼합물의 10 배 직렬 희석을 포함합니다.8개의 팁이 장착된 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 웰의 마이크로리터5개를 희석 계열로 흡착하고 기준 균주를 선택하는 카나마이신 보충제 LBS agar 플레이트에 스포지트합니다. 이 단계를 반복하여 클로람페니콜 보충 플레이트에 대한 경쟁업체의 스트레인 스포팅을 선택합니다. 반점이 완전히 말린 후, 24섭씨에 인큐베이터에 접시를 놓습니다.동전 배큐어 반점과 24 개의 우물 접시가 섭씨 24도에서 5 시간 동안 배양 된 후 LBS 국물 1 밀리리터를 각 우물에 추가하십시오. 모든 셀이 모든 복제에 걸쳐 다시 일시 중단되는 활력과 일치하여 다시 일시 중단 될 때까지 위아래로 파이펫팅하여 다시 중단합니다. 각 코인큐베이션 스팟이 다시 중단되면, 96웰 플레이트를 준비하여 시리얼 희석을 위해 96개의 웰 플레이트를 준비하고 LBS 천판은 이전에 수행한 것과 동일한 방식으로 희석을 발견하는 적절한 항생제를 가지고 있습니다.24웰 플레이트에서 t 최종 측정을 위한 직렬 희석을 완료하려면 시작 무큐럼의 직렬 희석에 사용되는 단계를 수행하고 이전과 마찬가지로 LBS 천지 플레이트에서 각 희석을 발견합니다. 원고에 설명된 바와 같이 페트리 플레이트및 데이터 분석에서 코인큐베이션 스팟을 이미징하여 진행합니다. 실험적 치료에서, 기준 균주와 경쟁균원은 대조군 처리와 일치하는 실험의 시작과 끝에 0.5의 비율로 존재한다.로그 RCI 값은 대조군 처리를 위해 또는 기준 균주가 경쟁사 변형 1로 배양되었을 때 0과 통계적으로 다르지 않았습니다. 이러한 데이터는 참조 변형과 경쟁 균주 1 사이의 경쟁이 없었다는 것을 시사한다. 대조적으로, 기준균이 경쟁사 균주 2로 배양되었을 때, 기준 균주는 실험이 끝날 때 0.01 미만의 비율로 초기에 0.5의 비율에서 감소하였다.또한, 레퍼런스 스트레인이 경쟁사 변형 2로 인큐베이션되었을 때 로그 RCI 값은 0보다 훨씬 컸다. 함께, 이러한 데이터는 경쟁자 변형 의 존재에 기준 균주의 비율이 감소 있음을 나타냅니다 두 균주 사이의 경쟁을 제안. 기준 균주가 경쟁 변형 1로 인큐베이션되었을 때, 두 균주의 CfU는 5 시간 동안 증가했으며 경쟁이 발생하지 않았다는 것을 시사하는 크게 다르지 않았습니다.또한, 약 3200%의 회복이 관찰되었으며, 이는 대조군과 통계적으로 다르지 않았다. 그러나, 기준 균주가 경쟁사 균주 2로 인큐베이션되었을 때, 기준 균주 CfU는 5시간 만에 대조군에서 균주 2개의 CfU보다 현저히 낮았다. 또한, 약 4%의 회수는 대조군보다 현저히 낮은 것으로 관찰되었다.전부, 이 데이터는 균주 2 밖으로 그것의 세포를 죽이고서 기준 긴장경쟁했다는 것을 표시합니다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 올바른 시작 비율을 달성하는 것입니다.

coincubation-assay-for-quantifying-competitive-interactions-between

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Speare, L., et al. Vibrio fischeri 분리주 간의 경쟁적 상호 작용을 정량화하기 위한 공동 큐베이션 분석. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 박테리아 균주가 공유 환경에서 어떻게 경쟁하는지 연구하는 데 사용되는 공동 배양 분석을 보여줍니다. 이러한 상호 작용을 유도하는 접촉 의존적 또는 접촉 독립적 사멸과 같은 메커니즘을 식별하기 위해 미생물학에 널리 적용됩니다.

박테리아 균주 간의 경쟁적 상호 작용을 연구하기 위한 공동 배양 분석

출처: 브럼필드, K. D. 외 비브리오 콜레라의 생물형 유지 및 구별을 위한 임상 및 환경 분리주. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 트리페닐테트라졸륨 클로라이드를 이용한 부드러운 한천 분석법을 시연하며, 활발히 이동하는 세포 주변의 적색 구역 형성을 통한 대사 활동을 시각화하여 비브리오 콜레라 균주의 운동성을 평가하고 비교합니다.

트리페닐테트라졸륨 염화를 이용한 콜레라 균주 비교를 위한 운동성 분석

출처: Brumfield, K. D. 외, Vibrio 콜레라의 생물형 유지 및 구분을 위한 임상 및 환경 분리 실험실 기법. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 콜 레라 균의 세 가지 생물형인 고전형, 야생형 엘 토르, 그리고 엘 토르 변종을 구별하기 위한 보게스-프로스카우어(VP) 검사를 시연합니다. 각 배양액은 포도당 함유 배지에 접종되어 배양 후 α-나프톨과 수산화칼륨으로 처리하여 아세톤 존재를 검출합니다. 분홍빛이 도는 붉은색은 양성 VP 반응을 나타내며, 야생형 엘 토르 생물형에서만 관찰되어 고전형과 변종형과 구별됩니다.

비브리오 콜레라 생물형 구별을 위한 보게스-프로스카우어 검사법

출처: Nag, D. 외 성체 제브라피시 모델에서 비브리오 콜레라의 정화 및 설사. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 항생제 내성 콜레라균에 감염된 성체 제브라피시의 장내 세균 부하를 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 안락사 및 해부 후에는 장을 분리하고 유리 구슬로 균질화한 후 박테리아를 방출하기 위해 처리됩니다. 결과된 균질체는 선택적 배지에 플레이트되고, β-갈락토시다아제를 발현하는 파란색 콜로니를 세어 박테리아 부하를 추정합니다.

비브리오 콜레라에 감염된 제브라피시의 장내 세균 부하 정량화

이 동영상은 단세포 수준에서 박테리아 경쟁을 연구하는 형광 현미경 기반 방법을 보여줍니다. 이 방법은 박테리아 군집의 구조와 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.

Bacterial Co-Incubation Assay: 단일 세포 수준에서 특이성 내 박테리아 경쟁을 시각화하기 위한 형광 현미경 기반 기술

우리는에 의해 중재 세균 경쟁 업체를 모니터 할 수있는 질적 분석을...

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

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생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술<em&gt; 콜레라 비브리오</em&gt; 임상 적 및 환경 적 분리 물

이 원고는 단일 세포 형광 현미경 검사를 사용하여 공동 문화에서 세균 경쟁을 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

단세포 형광 화상 진찰을 사용하여 세균 간 경쟁의 정량화

학습하세요 Vibrio fischeri 균주 간 경쟁 메커니즘을 동전 분석으로 정량화하는 방법을. 형광 단백질과 항생제 내성 유전자를 활용한 이 프로토콜은 미생물 생태학 연구에 필수적인 도구입니다.

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

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