Name: 종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 배우세요 생쥐 종양 모델에서 이중 생물 발광 이미징을 활용하여 실시간으로 종양 진행과 혈관 신생을 동시 추적하는 방법입니다. 이 기술은 항종양 약물 선별 및 종양학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFA0103200), 중국 국립자연과학재단(81671734), 천진과학기술지원사업(18YFZCS000010), 기초연구기금의 지원을 받았습니다. 중앙 대학 (63191155). 우리는 원고의 품질을 향상시키는 데 중요한 글로리아 낸스의 개정을 인정합니다.

실험은 연구 목적으로 동물의 사용에 관한 국가 및 기관 규정을 준수해야합니다. 실험을 수행할 수 있는 권한을 얻어야 합니다. 동물의 치료와 연구의 실험 절차는 국립 보건원 (NIH)이 승인 한 동물 관리 지침에 부합하는 난카이 대학 동물 관리 및 사용위원회 지침을 준수합니다.
1. LV-Rluc-RFP (RR) 및 LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) 렌티 바이러스 포장 및 생산
참고: pLV-RR은 프로모터 EF1α 하에서 레닐라 루시퍼라제(Rluc)와 적색 형광 단백질(RFP)의 유전자 서열을 전달하는 반면, pLV-RRT는 Rluc, RFP 및 헤르페스 심플렉스 바이러스를 코딩하는 유전자 서열을 운반하는 반면 티미딘 키나아제(HSV-ttk)(HSV-ttk) 그림2).
<ol><li>종자 1 x 10의 293T 세포 중 6 개의 웰 플레이트를 6 개의 웰 플레이트와 배양하여 37°C에서 5% CO2를 가진 가습 된 인큐베이터에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM을 함유한다.</li>
	<li>리포솜 현탁액을 준비하십시오: 리포솜7.5 μL과 0.25 mL의 최소 필수 배지(MEM)를 실온(RT)에서 5분 동안 인큐베이션한 후 1.5 mL 튜브에 섞어서 리포좀을 동등하게 분산시냅니다.</li>
	<li>DNAs 용액(DNAs-RR)을 준비: 별도로, 표1에 기재된 바와 같이 1.5 mL 튜브에서 MEM의 0.25 mL에 pLV-RR 벡터 및 도우미 플라스미드를 추가한다.</li>
	<li>리포솜/DNAs-RR 화합물을 얻으세요: DNAs-RR 용액을 준비된 리포좀 서스펜션 드롭에 부드럽게 넣고 RT에서 20분 동안 배양하여 DNA가 지질막에 결합되도록 합니다.</li>
	<li>293T 세포의 배지를 10% FBS를 함유하는 1 mL의 DMEM으로 대체하고 리포솜/DNAs-RR 화합물을 293T 세포의 배지에 부드럽게 첨가한다.</li>
	<li>가습 된 인큐베이터에서 12-16 시간 동안 37 °C에서 5 % CO2로 인큐베이터에서 인큐베이션 한 후, 10 % FBS 및 100 U / mL 페니실린 - 스트렙 토마이신을 함유한 DMEM의 1 mL로 293T 세포의 배지를 함유하는 리포솜 / DNAs-RR 화합물을 교체하십시오.</li>
	<li>293T 세포를 형질전환 후 48시간 동안 가습된 인큐베이터에서 계속 배양하였다. 이어서, 293T 세포의 상상액을 수집하고 293T 세포를 펠렛하기 위해 5분 동안 300 x g에서 배지를 원심분리한다. 렌티바이러스-RR(LV-RR)-함유 상급물질을 1.5 mL 멸균 폴리프로필렌 저장 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관한다. 참고: 재조합 렌티바이러스와 함께 작동하려면 생물안전수준 2(BSL-2) 시설이 필요합니다.</li>
	<li>1.1-1.7 단계를 반복하고 1.3 단계에서 pLV-RR 벡터 대신 pLV-RRT 벡터를 사용하여 렌티바이러스-RRT(LV-RRT)를 얻었다. LV-RRT를 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 비정제 렌티바이러스 스톡은 경우에 따라 세포 성장을 억제할 수 있습니다. 렌티바이러스 스톡은 정제해야 할 수도 있습니다. LV-RR 또는 LV-RRT 입자를 포함하는 렌티바이러스 스톡은 여러 번의 자유 해동 주기를 피하기 위해 저장을 위해 1.5 mL 튜브(튜브당 1mL)로 나누어야 합니다.</li>
</ol>2. 4T1 세포에서 유전자 발현을 위한 LV-RR 및 LV-RRT 렌티바이러스 성 전환
<ol><li>종자 4T1 세포를 6웰 플레이트(5 x 105 세포/웰)로 배양하고 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI)와 배양하여 10% FBS를 함유하는 배지를 37°C에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 하룻밤 동안 함유하였다.</li>
	<li>배양 플레이트에서 배지를 제거하고 1 mL 의 신선한 RPMI 1640 배지뿐만 아니라 렌티바이러스 스톡(LV-RR 또는 LV-RRT)의 1 mL로 각각 잘 교체한다. 8 μg/mL 폴리브레인을 추가하고 렌티바이러스 입자를 함유한 배지를 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 블렌딩합니다. 참고 : 매체는 인간 세포를 변환 할 수있는 렌티 바이러스 입자를 포함하고 있음을 유의하시기 바랍니다.</li>
	<li>RT에서 60분 동안 1,000 × g의 원심분리기에서 트랜스덕션 용액을 회전시켜 트랜스덕션 효율을 높입니다. 원심분리 후, 배양 4T1 세포를 4-12시간 동안 배양하고 37°C에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 유지한다. 참고: 일부 세포주의 경우, 폴리브레인은 장기 배양에 독성이 있을 수 있습니다. 따라서, 상이한 세포를 변환하기 위한 인큐베이션 시간은 변경될 수 있다. 적절한 배양 시간을 찾기 위해 세포 상태를 여러 번 확인하십시오.</li>
	<li>렌티 바이러스 입자와 폴리브레인을 제거하기 위해 10 % FBS 및 100 U / mL 페니실린 - 스트렙 토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지의 2 mL로 변환 된 4T1 세포의 매체를 새로 고칩니다.</li>
</ol>3. LV-RR 및 LV-RRT 의 약물 스크리닝 및 식별 4T1 세포
<ol><li>다음 단계에 기재된 바와 같이 LV-RR 또는 LV-RRT에 의해 운반된 BSD 저항 유전자에 따라 블라시딘(BSD)을 함유하는 배지를 가진 트랜스듀싱 세포를 선택한다. 참고: 대안적으로, RFP 양성인 형질전환 세포는 LV-RR 또는 LV-RRT에 의해 운반된 RFP 유전자에 따라 유세포측정에 의해 선택될 수 있었다.</li>
	<li>48시간 후, 선택 배지를 사용하여 1:3 대 1:4의 비율로 4T1 세포를 계관합니다(RPMI 1640 배지는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 5 μg/mL BSD). 2일 또는 3일마다 매번 매체를 변경합니다. 참고: 최적 BSD 농도는 세포주에 따라 다를 수 있습니다. 따라서, 초기 실험 전에 BSD의 최적 농도를 결정하기 위해 킬 커브의 파일럿 실험을 수행해야 한다.</li>
	<li>7일 후 약물 스크리닝, LV-RR 형질전환 된 4T1 세포 (4T1-RR) 및 LV-RRT는 형광 반전 상 대비 현미경 하에서 4T1 세포 (4T1-RRT)를 시동관찰한다. RFP+4T1 셀의 수를 세고 3개의 시야분야에서 모든 4T1 셀을 각각 RFP 양성비를 추정한다(도 2). 참고: 대안적으로, 형질전환된 4T1 세포의 RFP 양성비는 유세포측정에 의해 확인될 수 있었다.</li>
	<li>살아있는 이미징 시스템을 사용하여 4T1-RR 세포 및 4T1-RRT 세포의 레닐라 신호를 측정하여 세포 수와레닐라 신호 사이의 선형 관계를 검출합니다(그림 3).</li>
	<li>BSD 스크린 4T1-RR 및 4T1-RRT 셀을 1:3과 1:4 사이의 분할 비율로 선택 배지로 확장하고 세포주 스톡을 액체 질소에 저장합니다.</li>
</ol>4. Vegfr2-Fluc-KI 마우스 및 종양 베어링 마우스 모델
참고: 6-8주 령 및 암컷인 형질전환 Vegfr2-Fluc-KI 마우스는 BLI에 의해 생체 내 혈관신생을 비침습적으로 모니터링하기 위해 이 실험에 사용된다.
<ol><li>배양 4T1-RR 세포 및 4T1-RRT 세포를 각각 37°C에서 5% CO2를 가진 가습된 인큐베이터에서 60 mm 페트리 접시에. 세포가 80 % 합류에있을 때, 배지를 제거하고 인산완충 식염수 (PBS)로 헹구는다.</li>
	<li>PBS를 제거하고 각각 0.25% 트립신-0.53 mM EDTA 용액의 2 mL를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 접시를 RT(또는 37°C)에서 유지합니다.</li>
	<li>10% FBS를 함유한 신선한 배지 5-10 mL을 추가한 다음 세포를 흡인하고 분배하여 4T1-RR 및 4T1-RRT 세포를 각각 15 mL 원심분리튜브에 다시 삽입합니다. 카운트 챔버를 사용하여 2가지 유형의 4T1 세포를 카운트하고 RPMI 1640 배지에서 100 μL당 1 x 106의 농도로 세포 현탁액을 준비한다.</li>
	<li>Vegfr2-Fluc-KI 마우스를 마취 유도 챔버에서 100% 산소로 1%-3%의 이소플루란으로 마취하여 1L/min의 유량으로 마우스의 발가락 핀치 반응을 모니터링하여 마취 상태를 확인합니다. 그런 다음, 탈수를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 적용하십시오.</li>
	<li>코콘의 챔버와 위치에서 마우스를 제거합니다. 전기 면도기와 제모 크림을 사용하여 마우스 어깨의 머리카락을 완전히 제거하여 수술 현장을 잘 볼 수 있으며 후속 실험에서 BLI 신호를 차단하지 않도록하십시오.</li>
	<li>피하적으로 각 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 어깨에 4T1-RR 세포(100 μL 총 부피에서 1 x 10 6셀)와 4T1-RRT 세포(총 부피가 100μL에서 1x106셀)를 각각 주입합니다(0일으로 기록). 완전히 회복될 때까지 열 지지대를 가진 회복 부위에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>4T1-RR 및 4T1-RRT 세포를 이식한 후, 종양 덩어리를 터치하여 마우스가 매일종양을 지니고 있는지 확인한다(도 S1). 7일째이식 이식 후, 복강 내 주사 50 mg/kg 간시클로비르(GCV)를 종양 을 지탱하는 마우스에 하루에 두 번 씩 실험이 끝날 때까지 주입합니다. 참고 : 이 실험 전에 4T1-RRT 세포에서 GCV의 세포 독성을 검출해야합니다. GCV의 살해 효율은 GCV의 상이한 농도를 가진세포 계수 분석에 의해 평가될 수 있었다(도 S2).</li>
	<li>4T1 이식 후 0일, 3일, 7, 14, 및 21일째에, 종양-베어링 마우스의 종양 성장 및 혈관신생을모니터링하고 Rluc 및 Fluc 이미징 모두에 의해 평가한다(도 4).</li>
</ol>5. 종양 (Rluc) 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징 (Fluc)
<ol><li>살아있는 이미징 시스템을 열고 살아있는 이미징 소프트웨어를 초기화한 다음 시스템을 초기화합니다. 참고: 시스템 초기화는 이미징을 시작하기 전에 충전 결합 장치(CCD) 카메라를 -90°C로 냉각하는 데 몇 분 정도 걸릴 것입니다. CCD 카메라가 냉각되면 온도가 녹색으로 바뀝니다.</li>
	<li>다음 카메라 설정을 사용합니다. 발광 및 사진을 확인합니다. 오버레이를 확인합니다. 발광 설정: 노출 시간은 정상 조건에서 AUTO를 설정합니다. 비닝 세트는 8로 설정됩니다. F/스톱이 1로 설정됩니다. 방출 필터가 열립니다. 사진 설정: 비닝은 중간으로 설정합니다. F/스톱은 8로 설정됩니다. IVIS 시스템 설정: 시야: C=1 마우스 보기, D=5 마우스 보기. 피사체 높이가 1.5cm를 설정합니다.</li>
	<li>마우스의 무게와 기록을 기록하고 필요한 coelenterazine (CTZ; 2.5 mg/kg) 및 D-루시페린 (150 mg/kg)의 부피를 계산합니다.</li>
	<li>1 L/min의 유속으로 마취 유도 챔버에서 100% 산소에서 종양 베어링 마우스를 1%-3% 이소플루란으로 마취합니다. 그런 다음 각막 손상을 피하기 위해 두 눈에 윤활 유황 눈 연고 한 방울을 분배하십시오.</li>
	<li>킬로그램 당 2.5 mg 의 CTZ (3.33 mg/mL)를 마우스의 레트로불바에 주입하십시오 (예를 들어, 20 g 마우스의 경우, 15 μL을 주입하여 50 μg의 CTZ를 전달함) 인슐린 주사기 바늘을 사용하여.</li>
	<li>종양 베어링 마우스를 마취 콘의 코를 가진 카메라 챔버로 부드럽게 이동하고 즉시 마우스 등쪽의 여러 사진을 획득하여 BLI 신호가 사라질 때까지 4T1 세포에서 Rluc 신호를 얻습니다. 참고 : CTZ의 반감기는 매우 짧고 Rluc의 신호는 급격히 ~ 30 s를 떨어 뜨립니다. 잔류 Rluc 신호가 소멸되었는지 확인하고 Rluc와 Fluc 이미징 사이의 간격은 10분 이상이어야 합니다.</li>
	<li>인슐린 주사기 바늘을 사용하여 150 mg/kg 의 D-luciferin (30 mg/mL)을 주입합니다 (예 : 20g 마우스의 경우 100 μL을 주입하여 D-루시페린 3 mg을 제공합니다). Fluc 이미징 전에 10분 동안 RT에 마우스를 보관하십시오.</li>
	<li>이 마우스를 마취 원뿔의 코가있는 카메라 챔버로 다시 이동하고 혈관 신생에서 Fluc 신호를 얻기 위해 마우스 등쪽의 여러 사진을 얻습니다. 참고: 신호가 최대값에 도달한 다음 페이드 할 때까지 각 마우스에 대해 Fluc 운동 모니터를 수행해야 합니다.</li>
	<li>각 마우스에 대해 5.4-5.8 단계를 반복합니다.</li>
	<li>이미징 후 동물이 깨어날 때까지 따뜻한 환경에서 마우스를 유지하십시오.</li>
	<li>원하는 시점(3일째, 7일, 14일 및 21일)에서, 시간이 지남에 따라 종양 진행 및 종양 혈관신생을 검출하기 위해 위의 절차(단계 5.3-5.10)를 반복한다.</li>
	<li>Rluc 및 Fluc 신호를 분석하여 종양 진행에서 종양 성장과 혈관신생 사이의 관계를 조사합니다. 참고: BLI 신호 사이트를 포괄하는 관심 지역(ROI)은 데이터를 분석하는 데 사용됩니다. 모든 시간대에 대해 광자/초/cm 2/스테라디안(p/s/cm 2/s/sr)단위에서 ROI의 총 광도(Photons)를 측정합니다.</li>
	<li>그래픽 소프트웨어를 사용하여 ROI의 Rluc 및 Fluc신호를 분석합니다(그림 4).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜에서, 비침습적 이중 BLI 접근법은 종양 발달 및 혈관신생을 모니터링하기 위해 기술된다. BLI 리포터 시스템은 Rluc 이미징에 의해 생체 내 종양 진행 및 회귀를 추적하기 위한 HSV-ttk/GCV 자살 유전자를 포함하는 처음 개발되었습니다. 한편, 종양 혈관신생은 Fluc 이미징을 통해 Vegfr2-Fluc-KI 마우스를 사용하여 평가된다. 이 종양 베어링 마우스 모델은 높은 관련성, 재현성 및 번역성을 가진 단일 마우스에서 이중 BLI에 의한 연속 및 비침습적 추적 종양 개발 및 종양 혈관신생을 위한 실용적인 플랫폼을 제공할 수 있다.
혈관신생은 장기적인 종양 진행을 염려하며 이에따라 중요성이 1. 종양 진행과 혈관 신생 사이의 관계를 연구 할 필요가 있습니다. 항 혈관 신생 전략의 증가 수는 정확하게 처리 결과를 평가하기 위한 가시화한 모니터 접근에 의존하는 암 처리를 위해 조사되었습니다. 또한, 전통적인 방사선 요...

혈관 신생은 작고 국소 된 신 생물에서 더 크고 잠재적으로 전이성 종양으로암의진행에 필수적인 과정입니다 1,2. 종양 성장과 혈관 신생 사이의 상관 관계는 종양학 연구 분야에서 강조되는 점 중 하나가됩니다. 그러나, 형태학적 변화를 측정하는 전통적인 방법은 가시화 된 접근을 사용하여 살아있는 동물에서 동시에 종양 진행 및 혈관 신생을 모니터링하지 못합니다.
종양 세포의 생물 발광 이미징 (BLI)은 비 침습성, 민감성 및 특이성 3,4,5, 6 때문에 종양 성장을 모니터링하는 특히 적절한 실험 방법입니다. . BLI 기술은 루시퍼라제가 생물 발광을 방출하면서 특정 기판의 산화를 촉매할 수 있다는 원리를 기반으로 합니다. 이식된 종양 세포에서 발현되는 루시퍼라제는 생체 영상 시스템에 의해 검출될 수 있는 주입된 기질과 반응하고, 신호는 생체내 세포 수 또는 세포 국소화의 변화를 간접적으로 반영한다 6,7.
종양 성장을 제외하고, 종양 혈관신생(암 진행에 중요한 단계)은 또한 Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스8,9,10을사용하여 BLI 기술을 통해 가시화될 수 있다. 혈관 내피 성장 인자(Vegf) 수용체 2(Vegfr2), Vegf 수용체의 한 유형은, 주로 성인 마우스(11)의혈관 내피 세포에서 발현된다. Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스에서, 반딧불 루시퍼라제(Fluc)의 DNA 서열은 내인성 Vegfr2 서열의 첫 번째 엑소로 노크된다. 그 결과, Fluc은 마우스에서 혈관신생 의 수준과 동일한 방식으로 (BLI 신호로 나타나는) 발현된다. 크기가 몇 밀리미터 를 넘어 성장하기 위해 종양은 종양 세포에서 성장 인자에 의해 유발 된 Vegfr2를매우 발현하는 기존 혈관에서 새로운 혈관을 모집합니다 1. 이것은 BLI에 의한 비침습적으로 종양 혈관신생을 모니터링하기 위해 Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스를 사용할 가능성을 열어준다.
본 프로토콜에서, 종양 베어링 마우스 모델은 반딧불 루시퍼라제(Fluc) 및 레닐라루시퍼라제(Rluc) 이미징을 통해 단일 마우스에서종양 진행 및 혈관신생을 모니터링하기 위해 각각 확립된다(도 1). 4T1 세포주(4T1-RR)는 Rluc 이미징에 의해 세포 성장을 추적하기 위해 Rluc 및 적색 형광 단백질(RFP)을 안정적으로 발현하는 것으로 생성됩니다. 종양의 진행 및 회귀에서 혈관신생의 동적 변화를 추가로 조사하기 위해, 또 다른 4T1 세포주(4T1-RRT)는 자살 유전자 포진 심플렉스 바이러스를 발현하여 티미딘 키나아제(HSV-ttk), Rluc 및 RFP를 발현하는 것으로 생성된다. 간시클로비르(GCV)의 투여에 의해, HSV-ttk 발현 세포는 선택적으로 절제된다. 이러한 세포주를 기반으로, Vegfr2-Fluc-KI 마우스의 종양 베어링 모델은 생체 내에서 종양 진행 및 종양 혈관신생을 연결하는 실험 모델역할을 한다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-0.53mM EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 튜브</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-105-C-S</td><td></td></tr><tr><td>15mL 튜브</td><td>Corning Glass Works</td><td>601052-50</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>60mm 접시</td><td>코닝 유리 작품</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning Glass Works</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Shanghai Lishen Scientific</td><td>Hfsafe-900LC</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>MedChem Express</td><td>HY-K0301</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Tegulated Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4111</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine (CTZ)</td><td>NanoLight Technology</td><td>479474</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin Potassium Salt</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>119222</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>BIOIND</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/U/S</td><td></td></tr><tr><td>Ganciclovir (GCV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001129</td><td></td></tr><tr><td>그래픽 소프트웨어</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>Graphpad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>691477H</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 포장 시스템</td><td>Biosettia</td><td>cDNA-pLV03</td><td></td></tr><tr><td>리포좀</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11668019</tr><tr><td>Living Imaging Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Living Imaging Software 4.2</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>IVIS Lumina II</td><td></td></tr><tr><td>MEM Medium</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning Glass Works</td><td>R21031399</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-1G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL ST 16R 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td><td></td></tr><tr><td>초저온 냉장고</td><td>Haier</td><td>DW-86L338</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 가스 마취 시스템</td><td>XENOGEN 공사</td><td>7293</td><td></td></tr></tbody></table>

종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

혈관 신생은 종양 진행의 중요한 과정으로서 항 종양 치료의 연구 핫스팟및 표적이되었습니다. 그러나, 종양 진행 및 혈관 신생을 동시에 시각적이고 민감한 방식으로 추적하기위한 신뢰할 수있는 모델은 없다. 생물 발광 이미징은 높은 감도, 강한 특이성 및 정확한 측정의 장점으로 인해 살아있는 이미징에서 고유 한 우수성을 보여줍니다. 여기서 제시된 프로토콜은 혈관신생 유도반딧불 루시퍼라아제 발현을 가진 형질전환 마우스내로 르니야 루시퍼라아제 표지 된 뮤린 유방암 세포주 4T1을 주입함으로써 종양-베어링 마우스 모델을 확립하는 프로토콜이다. 이 마우스 모델은 단일 마우스에서 이중 생물 발광 이미징을 통해 종양 진행 및 혈관 신생을 실시간으로 동시에 모니터링하는 귀중한 도구를 제공합니다. 이 모델은 항종양 약물 스크리닝 및 종양학 연구에 널리 적용될 수 있다.

본 실험에서, 유방암 마우스 모델은 종양 성장과 종양 혈관신생 사이의 관계를 조사하기 위해 4T1 세포를 사용하여 확립되었다(도 1). 첫째로, 2개의 렌티바이러스는 이전에 보고된대로각각 Rluc/RFP (LV-RR) 및 Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT)를 발현하는 유전자 서열을 운반하는, 패키징되었다. 이어서, 4T1-RR 및 4T1-RRT라는 두 개의 서로 다른 4T1 세포주가 각각 LV-RR 및 LV-RRT를 변환하여 생성되었다. 약물 스크리닝 후 3일 동안, 4T1-RR 및 4T1-RRT를 형광 현미경으로 관찰하여 형질전환 효율을 검출하였다. 형광 이미징에서 나타난 바와 같이, 4T1-RR 또는 4T1-RRT 세포의 99% 이상이 RFP 양성이었으며, 이는 4T1-RR 및 4T1-RRT 세포주가 LV-RR 및 LV-RRT 트랜스덕션에 의해 확립되었다는 것을...

이 프로토콜은 이중 생물 발광 이미징에 의해 종양 진행 및 혈관신생을 실시간으로 모니터링하는 종양 베어링 마우스 모델의 확립을 설명합니다.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

혈관 신생종양 전이 및 진행에 중요한 역할을합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 유방암의 마우스 모형에 있는 동적 종양 진행 및 혈관신생을 감시하기 위하여 이중 생물 발광 화상 진찰 방법을 사용할 것입니다. 이 모델에서는, 우리는 반딧불 루시파라제와 Renilla luciferase 화상 진찰을 통해 단 하나 마우스에서 종양 성장 및 혈관 신생을 동시에 추적할 수 있습니다, 각각.이 모형은 항종양 약 검열 및 종양학 연구에서 넓게 적용될 수 있습니다. 이 이중 생물 발광 모델은 종양 진행 및 회귀를 추적하고 치료 전략에 대한 응답으로 종양 관련 분자 과정을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 혈관 신생은 종양 진행의 중요한 과정입니다.따라서 효과적인 종양 치료 개발을 위해서는 시각 및 민감한 방식으로 종양 진행 및 혈관 신생을 모니터링하는 것이 필요하다. 절차는 우리 연구소의 학생인 장카이유, 첸왕, 상첸이 시연할 예정이다. 렌티바이러스 포장 및 생산 종자의 경우 DMEM의 2밀리리터에서 293T 세포의 6분의 1을 10% 태아 소 세럼으로 보충하여 1박 배양용 6웰 플레이트에 37°C와 이산화탄소 5%의 가습된 배양소로 보충하였다.다음날 아침 리포솜 7.5 마이크로리터와 250마이크로리터의 최소 필수 매체를 실온에서 5분간 배양하는 두 개의 별도의 1.5밀리리터 튜브에 섞어드십시오. DNA 솔루션을 준비하려면 표에 설명된 개별 1.5 밀리리터 튜브에 최소 필수 배지의 250 마이크로리터에 플라스미드 렌티바이러스 RR 벡터 및 도우미 플라스미드를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서 부드럽게 드롭 현명한 방식으로 리포솜 현탁액에 DNA RR 솔루션을 추가하고 실온에서 20 분 동안 지질 막에 결합 DNA를 허용합니다.혼합물이 배양하는 동안, 293T 세포 배양의 상체를 신선한 배양 배지의 1 밀리리터로 대체하고, 각각의 웰에 적절한 리포솜 DNA 혼합물의 0.5 밀리리터를 부드럽게 첨가한다. 세포 배양 인큐베이터에 세포를 12-16 시간 동안 반환한 후 항생제로 보충된 신선한 배양 배지의 1밀리리터로 각 우물의 상체를 교체한다. 추가 36 시간의 인큐베이션 후, 상류체를 렌티바이러스 균주당 하나의 원뿔 튜브로 풀을 293T 세포를 원심분리에 의해 퇴적시한다.그런 다음 렌티바이러스 RR 함유 슈퍼나티를 영하 80도에서 보관할 수 있도록 개별 1.5밀리리터 멸균 폴리프로필렌 저장 튜브로 전송합니다. 4T1 유방 종양 세포에서

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

루시페라제 표현 내유 종양 세포는 생쥐의 subcutaneously 이식 및 비 invasively 종단 연구에 종양이 성장과 발전을 모니터 광학 이미징을 사용하여 시각입니다.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

루시페라제 - 수정된 인간의 뇌 종양의 xenografts은 종양 성장과 bioluminescence 이미징을 사용하여 치료에 대한 응답의 후속 모니터링과 athymic 생쥐에 intracranially 설정할 수 있습니다. 생존 분석과 함께, bioluminescence 모니터링 뇌 종양 치료를위한 고려되는 요법의 사전 임상 시험을위한 필수적인 연구 도구입니다.

Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축

뼈 전이의 실험 마우스 모델은 루시페라제 내유 종양 세포를 표현 intracardiac 배달 아래 설립되었습니다. 종양 개발 및 osteolytic 병변을 발생은 bioluminescence과 마이크로 중부 표준시 이미징과 길이 방향 감시했다.

Bioluminescence 및 마이크로 중부 표준시 이미징과 함께 종양의 Metastases 및 Osteolytic 조직 손상을 모니터링

hypoxia inducible 인자 - 1α 활동 Bioluminescence 이미징은 유방암 뇌 전이의 마우스 모델에서 종양 intracranial hypoxia 개발을 모니터에 적용됩니다.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을...

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

C57BL에 GL261 셀 / 6 마​​우스의 Intracranial 이식은 인간 glioblastoma multiforme의의 특징 중 많은 것들을 요점을 되풀이하다 악성 gliomas을 생산하고 있습니다. 우리는 우리가 사용할 수 있도록 안정 루시페라제 표현 GL261 세포를...

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서</emMurine Gliomas의> 발광 생물 이미징

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

근원:마리나 아란테스 라디키1, 빅터 카를로스 멜로1,빅토리아 파스 마차도1, 마르시아 크리스티나 올리베이라 다 로샤1, 자클린 바즈 데 올리베이라1, 루아나 크리스티나 카마르고1,2, 루이스 알렉상드르 뮐만1, 리카르도 벤테스 아제베도1, 소니아 나이르 바오1, 주앙 파울로 피게이로 롱고11브라질리아 대학교 생물과학연구소, 2브라질리아대학교 심리학연구소 기초심리과정학과이 비디오는 루시페라아제 발현 유방 선암종 세포를 암컷 마우스에 주입하고 생물발광 신호를 모니터링하여 시간 경과에 따른 원발성 및 전이성 종양 성장을 평가함으로써 생체 내에서 종양 진행을 추적하는 절차를...

암컷 마우스 모델에서 유방 종양 진행의 생물발광 이미징

출처: Ciraku, L., et. al입니다. 유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼기 위한 생체 외 뇌 절편 모델. J. Vis. 특급. (2021). 이 비디오는 유기형 마우스 뇌 절편에서 루시페라아제 발현 종양 세포의 이미징을 보여줍니다. Luciferin을 배지에 첨가하고 플레이트를 in vivo 이미징 시스템의 챔버 내부에 배치합니다. 이미지 캡처를 위한 매개변수가 조정되고 종양의 모양과 크기가 정의됩니다. 그런 다음 종양 세포에서 방출되는 생물 발광 신호가 기록됩니다.

유기형 마우스 뇌 절편에서 종양 성장을 평가하기 위한 생물 발광 이미징

췌장암 생물학의 개선 이해는 매우 췌장암을 치료하는 더 나은 치료 옵션의 개발을 가능하게하기 위해 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 사용하여 암 진행의 비 침습 모니터링을 허용 췌장암의 동소 모델을...

췌장암의 진행 발광 동소 모델

생물 발광 영상은 종양과 전이를 지역화 잘 알려진 도구이지만, 이러한 이미지의 정량화는 종종 복잡한 계산 및 특정 장비를 필요로한다. 우리는 더 계산을 요구하지 않으며, 종양 부담과 치료 반응이 마우스 모델에서 관찰 할 수 있도록 정확한 획득 상태에 기초하여, 사용하기 쉬운 luminoscore 방법을 설명한다.

마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

배우세요 생쥐 종양 모델에서 이중 생물 발광 이미징을 활용하여 실시간으로 종양 진행과 혈관 신생을 동시 추적하는 방법입니다. 이 기술은 항종양 약물 선별 및 종양학 연구에 활용됩니다.

종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

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