Name: 텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 배우세요 뇌와 뇌하수체 혈관 라벨링 기법을 심장 관류와 DiI 형광 염료를 사용하여 메다카(Oryzias latipes)에서 수행하는 방법을. 이 효율적인 프로토콜은 신경과 혈관 구조 간 관계 연구에 활용됩니다.

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메 다 카의 고정 용액을 사용 하 여 심장 관류를 시연 하 고, 미 루 데스 카레 온 G 탄 메 나카 축산에 도움이 되 고, 그림은 앤서니 펠 티어 씨에 게 감사 드립니다. 이 작품은 NMBU와 노르웨이의 연구 위원회에 의해 투자 되었다, 보조금 번호 248828 (디지털 라이프 노르웨이 프로그램).

모든 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학교에서 연구 동물의 보살 핌과 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었으며, 권한 있는 구도 자의 감독 하에 실시 되었습니다.
1. 장비 및 솔루션의 준비
<ol><li>1.5 mL 플라스틱 튜브에 96%에 토를 사용 하 여 dii 5 mg을 용 해 하는 DiI 스톡 용액 준비 30 초에 대 한 소용돌이 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 덮여 유지 합니다. 참고: 상기 DiI 원 액은 수 개월간-20°c에서 어두운 곳에서 보존 가능 하 게 된다.</li>
	<li>피시 홀더 (그림 1a)를 5 센티미터 길이로 절단 하 고 3cm 너비와 2cm 두께로 잘라서 9cm 직경의 플라스틱 접시에 접착 시킵니다. 폴리스 티 렌에 메스 블레이드가 있는 3cm 보트 모양의 구멍을 만드십시오.</li>
	<li>바늘의 말단에 30-50 cm 길이의 플라스틱 캐 뉼 러를 추가 하 여 관류 시스템 (그림 2)을 준비 합니다.</li>
	<li>50 mL 플라스틱 튜브에 30ml 인산 완충 식 염 액 (PBS)을 10ml 16% PFA로 희석 하 여 40의 신선한 4% 파라 포름알데히드 용액 (PFA)을 준비 합니다.</li>
	<li>10 mL 플라스틱 튜브에 신선 하 게 준비 된 4% PFA를 9 mL의 DiI 스톡 용액 1ml를 희석 하 여 10 mL의 고정/DiI 용액을 준비 합니다. 사용 전까지 어두운 곳에 보관 하십시오. 참고: 용 해 되지 않은 DiI 결정은 원 액 튜브에 보관할 수 있고, 새로운 에탄올을 첨가 하 여 새로운 DiI 스톡 용액을 제조할 수 있다 (1.1 단계 참조).</li>
	<li>
트라이 네 (MS-222) 스톡 50 mL를 준비 합니다.
	<ol>
<li>48 mL의 트리 네이 더 파우더 200 mg을 녹이 고 1M(pH 9)의 2 Ml를 추가 합니다. 1m HCl로 pH 7에 적응 하 고-20°c에서 보관 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>작은 유리에 있는 깨끗 한 물 50 mL에 트리 네 인 스톡 5 mL를 희석.</li>
	<li>피 펫 풀러와 함께 유리 모 세관을 제조 업체의 지침에 따라 스트레칭 하 여 몇 개의 5cm 유리 피 펫 (그림 2)을 준비 하십시오.</li>
</ol>2. 해 부와 관류
참고: PFA는 독성 휘발성 화합물 이므로 해 부 및 관류는 후드 또는 통풍 실에서 수행 되어야 하며 사용자는 가스 마스크를 착용 해야 합니다.
<ol><li>작은가 위를 포함 하 여 해 부 도구를 준비 하 고, 하 부를 하기 전에 날카로운 하나 개의 강한 집게.</li>
	<li>50 mL 튜브에 넣고 위로 그려서 PFA/DiI의 준비 된 용액으로 주사기를 채 웁 니다. 그런 다음 주사기의 말단에 캐 뉼 러와 바늘을 놓습니다 (그림 2).</li>
	<li>다른 방향으로 배치 테이프의 여러 조각을 사용 하 여 벤치에 주사기를 고정, 현미경의 위치를 조정 하 고 주사기 피스톤을 눌러 좋은 위치를 얻을 수 (그림 1B). 참고: 이 프로토콜에서 팔꿈치는 주사기 피스톤을 누르는 데 사용 되지만 다른 가능성 옵션은 다른 사람의 도움과 같이 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>1.7 단계에서 제조 된 용액에 어류를 배치 하 여 트리 아의 과다 복용으로 어류를 안락사 시켰다. 30 초를 기다린 후 집게로 꼬리 핀을 잡아 물고기의 반사 신경을 테스트 합니다. 물고기는 자극에 응답을 중지 했을 때 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>물고기 홀더에 물고기의 복 부를 위로 향하게 하 고 한 바늘을 머리의 말단에 고정 하 고 꼬리 위에 또 다른 하나는 물고기를 제자리에 유지 하도록 놓습니다.</li>
	<li>피부 표면 층을 수평으로 절단 하 여가 위로 앞쪽 복 부를 엽니다.</li>
	<li>포 셉을 사용 하 여 심 실 및 구 근 동맥 염에 대 한 명확한 접근이 제공 될 때까지 심장 위의 피부를 제거 하십시오 (그림 3).</li>
	<li>모 세관의 말단에 유리 피 펫을 추가 하 고 유리 피 펫의 끝 부분을 분리 합니다. 참고: 깨진 팁의 구멍은 액체가 밖으로 수 있도록 충분히 커야 하지만, 여전히 쉽게 조직에 들어갈 정도로 작다. 유리 피 펫은 파손 되거나 막혀 있지 않을 경우 재사용할 수 있습니다.</li>
	<li>유리 피 펫을 심 실에 가깝게 가져오고 팔꿈치로 주사기 피스톤에 압력을가 하 여 액체를 강제로 출력 합니다.</li>
	<li>주사기에 압력을가 하는 동안 유리 피 펫과 함께 심장 심 실 고정.</li>
	<li>바로 후에, 포 셉과 함께 부 비 동 venosus를 천공 하 여 혈액 순환을 떠날 수 있도록 합니다. 참고: 심 실에는 고착 때문에 더 연약한 됩니다. 또한 혈액이 고정/DiI 용액으로 희석되 면 서 적색이 떨어집니다.</li>
	<li>심 실에서 유리 피 펫의 각도를 조정 하 여 구 근 동맥 염의 입구를 찾으십시오. 도 2에 도시 된 바와 같이 구 근 동정 기 내부에 피 펫 개방을 가져와 주사기에 더 많은 압력을가 한다. 참고: 구 근 동정은 투명 하 고 조직은 탄성 이다. 혈액을 DiI/고정 제와 교체할 때 심장 내부의 유리 피 펫은 더 눈에 띄게 되 고 압력을가 하면 동맥 염이 팽창 해야 합니다. 이 단계는 충분 한 압력이 모든 혈액을 고정/DiI 용액으로 대체 하는 데 사용 되 고 모든 혈관에 도달 했는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 흔히 성공할 때, PFA는 근육의 수 축을 유발 하 고 물고기가 움직일 것입니다.</li>
	<li>계속 해 서 30-60 주사기에 압력을가 하 고, 유리 피 펫을 여전히 구 근 동맥 내에 유지 합니다.</li>
	<li>유리 피 펫과 물고기에서 바늘을 제거 합니다.</li>
	<li>뇌와 뇌 하 수 체를 분해 하 고 실 온에서 어두운 곳에서 2 시간 동안 PBS에서 신선한 4% PFA로 조직을 배양 한다. 참고: 뇌와 뇌 하 수 체의 해 부 이전에는 퐁텐 외26 에 의해 두 가지 방법으로 자세히 설명 되어 있습니다. 고정 때문에, 조직은 아주 단단 해지고 두뇌와 뇌 하 수 체 사이 연약한 연결 부는 손상 될 수도 있습니다. 해 부 후에, 사후 고정 처리는 또한 4°c에서 밤새 수행 될 수 있다.</li>
	<li>이미징 준비를 하기 전에 10 분 동안 PBS에 두 번 조직을 헹 구 십시오. 참고: 그 후 조직은 슬라이드와 커버 슬립 사이에 스페이서를 장착 하 고 공초점 이미징 용 마운팅 매체 ( 그림 4참조)를 장착 하 고, 그 사이에 설치 하기 전에 그에 따라 진동으로 단면화 할 수 있습니다. 이미지를 위한 슬라이드 및 커버 슬립 ( 그림 4참조)</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개할 것이 없다.

이전에 DiI를 가진 심장 관류는 teleost 물고기13을 포함 하 여 몇몇 모형 종24에 있는 혈관에 상표를 지정 하기 위하여 이용 되었습니다.
DiI는 혈관 구조에서 관류에 의해 내 피 세포 막으로 직접 전달 되기 때문에, 고정 용액에서 DiI 농도를 증가 시 킴으로써 신호 대 잡음비를 증가 시킬 수 있다. 또한, 형광 단을 최소한의 표백으로 흥분 시 강렬한 얼룩을 제공 하 여 상대적으로 오래 지속 되는 방출18,30을 허용 한다. 또한, 라벨링은 며칠 동안 유지 될 수 있으며, 불변 형광 (IF)31과 같이 온화한 치료가 필요한 다른 라벨링 기법과 함께 사용 됩니다.
그러나...

그들은 모든 기관에 필요한 영양소, 산소와 호르몬 신호를 제공으로 혈관은 척추 동물 body의 필수적인 부분을 재생 합니다. 또한, 암 개발1에 그들의 관여의 발견 이후, 그들은 임상 연구에 많은 관심을 받았다. 다 수의 간행물은 혈관 성장 및 형태 형성을 허용 하는 기전을 조사 하였으나, 그들의 생성을 위해 중요 한 다 수의 유전자가확인 되었지만, 많은 것은 상호 작용에 관하여 이해 될 수 있다 세포 또는 조직과 순환 혈액 사이.
뇌와 뇌 하 수 체에서 혈액 혈관의 시각화는 중요 하다. 두뇌에 있는 신경은 산소와 포도 당3의 높은 공급을 요구 하 고, 뇌에서 신호를 수신 하 고 다른 그들의 각각 호르몬을 보낼 혈 류를 사용 하 여 8 개의 중요 한 호르몬 생산 세포 유형을 포함 하는 뇌 하 수 체 주변 기관4,5. 포유동물에 있는 동안, 시상 하 부의 기지에 있는 포털 시스템은 중앙값 미 넨 스 이라고 명명 하 고, 두뇌와 뇌 하 수 체6을 연결 합니다, 그런 명확한 혈액 교량은 teleost 물고기에서 기술 되지 않았습니다. 실제로, 텔 레 티코-시상 하 부 뉴런은 뇌 하 수 체7 의 par nervosa에 직접 축 삭을 투사 하 고 주로 다른 내 분 비 세포 유형을 직접8,9로 자극 합니다. 그러나, 이러한 뉴런의 일부는 extravascular 공간에 있는 그들의 신경 종말, 혈액 모세 혈관에 가까운 근처에10. 따라서, teleost 물고기와 포유류의 차이 그렇게 명확 하지 않습니다., 그리고 혈액 맥 관 구조와 두뇌와 뇌 하 수 체 세포 사이의 관계는 teleost 물고기에서 더 큰 조사를 필요로.
제 브라 피시는 다양 한 측면에서, 해부학 적이 고 기능적으로 필적 하는 혈관 시스템을 다른 척추 동물 종11에 보유 하 고 있습니다. 그것은 심혈 관 시스템의 구성 요소 형광 리포터 단백질12로 표시 되는 여러 형질 전환 라인의 개발 덕분에 심장 혈관 연구에 대 한 강력한 척추 동물 모델이 되고있다. 그러나, 정확한 순환 시스템 해부학은 종 사이에서 다를 수 있습니다, 또는 심지어 같은 종에 속하는 두 개인 사이. 따라서, 혈관의 시각화는 변환 도구가 존재 하지 않는 다른 teleost 종에도 높은 관심을 가질 수 있다.
포유류와 전보 모두에서 혈관에 라벨을 지정 하는 몇 가지 기술이 설명 되어 있습니다. 이들은 맥 관 구조 특정 유전자를 위한 현장 잡종 화, 알칼리 성 인산 가수분해 물 염색, 미세 혈관 조 영 법 및 염료 주사를 포함 합니다 (검토를 위해13참조). 형광 성 친 유성 양이온 indocarbocyanine 염료 (DiI)는 지질 이중 층에서 유지 되 고 그것을14,15,16을 통해 마이그레이션할 수 있으므로 막 지질 측면 이동성을 연구 하기 위해 처음 사용 되었다. 실제로 DiI의 분자는 두 개의 탄화수소 체인과 발 색 단이 구성 되어 있습니다. 탄화수소 사슬이 그것에 접촉 하는 세포의 지질 이중 층 세포 막에 통합 되는 동안, 발 색 단은 그 표면17에 남아 있습니다. 일단 막에, DiI 분자는 DiI 용액과 직접적으로 접촉 하지 않는 막 구조물을 오염 시키는 것을 돕는 지질 이중 층 내에서 횡 방향으로 확산 됩니다. 심장 관류를 통해 DiI 용액을 주입 하는 것은, 따라서 혈관의 직접적인 라벨링을 허용 하는 화합물과 접촉 하는 모든 내 피 세포를 라벨링 할 것 이다. 오늘날 DiI는 또한 단일 분자 이미징, 운명 매핑, 뉴런 추적과 같은 다른 염색 목적으로 사용 됩니다. 흥미롭게도, 다른 형광 레이블과의 조합을 허용 하는 몇몇 형광 물질 (방출의 다른 파장)이 존재 하 고, DiI의 측면 확산 뿐만 아니라 결합이 살아있는 및 고정 조직 모두에서 발생할 수 있다18, 19.
포름알데히드는 1893에서 페르디난드 블 룸에 의해 발견 되었으며, 조직 고정20,21에 대 한 바람직한 화학 물질로 서 현재까지 널리 사용 되 고 있다. 이는 대부분의 세포 표적에 대 한 광범위 한 특이성을 나타내고 세포 구조22,23을 보존 한다. 그것은 또한 대부분의 형광 발 색의 형광체를 보존 하며, 따라서 표적 세포가 형광 리포터 단백질을 발현 하는 형질 전환 동물을 고정 시키기 위해 사용 될 수 있다.
이 원고에서, 작은 실험 포유류 모델 (24 )에서 혈관에 라벨을 지정 하기 위해 개발 된 이전 프로토콜은 어류에서의 사용에 적응 되었다. 전체 절차는 수행 하는 데 몇 시간 밖에 걸리지 않습니다. 그것은 직접 뇌의 모든 혈관과 모델 물고기 medaka의 뇌 하 수 체에 레이블을 하기 위해 물고기 심장에 DiI를 포함 하는 포름알데히드의 고정 솔루션을 사용 하는 방법을 보여줍니다. Medaka는 주로 일본에서 발견 되는 아시아에서 자생 하는 작은 민물 어류입니다. 그것은 분자 및 유전 도구의 제품군을 사용할 수 있는 연구 모델 유기 체입니다25. 따라서,이 종에서 뿐만 아니라 다른 사람에서 혈관의 식별 뇌와 뇌 하 수 체 세포가 전체 조직 또는 두꺼운 조직 조각에 혈액 맥 관 구조와 상호 작용 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 개선 하는 것을 허용 합니다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>5mL 주사기 PP/PE(바늘 제외</td>) <td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td><td>주사기</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 주사기 바늘</td><td>Sigma</td><td>Z118044-100EA</td><td>바늘 18G(1.20*40)</td></tr><tr><td>붕규산 유리 10cm OD 1.2mm</td><td>셔터 기기</td><td>BF120-94-10</td><td>유리 피펫</td></tr><tr><td>DiI (1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>LDPE 튜브 O.D 1.7 mm 및 I.D 1.1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>캐뉼라</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS) 용액</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 글루 젤</td><td>록타이트</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 (ms-222)</td><td>시그마</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

텔 레 ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 dii와 함께 심장 관류를 사용 하 여

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

혈관은 척추 동물의 모든 조직을 자극 하 여 필요한 영양분, 산소 및 호르몬 신호를 제공 함으로써 생존을 가능 하 게 합니다. 그것은 개발 하는 동안 작동을 시작 하는 첫 번째 장기 중 하나입니다. 혈관 형성의 메커니즘은 높은 과학적 및 임상 관심의 대상이 되고있다. 그러나 성인의 경우 다른 조직 내에서 자신의 국 소화로 인해 대부분의 살아있는 동물에서 혈관 구조를 시각화 하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구 하 고, 혈관의 시각화는 내 인 성 및 신경 생물학과 같은 여러 연구에 중요 한 남아 있다. 몇몇 형질 전환 선은 제 브라 피쉬에서 개발 되었지만, 혈관이 형광 단백질의 발현을 통해 직접적으로 가시화 되는 반면, 다른 텔 레 ost 종에는 그러한 도구가 존재 하지 않습니다. 모델으로 서 송사리를 사용 하 여, 현재 프로토콜은 신속 하 고 직접적인 기술을 제공 하 여 뇌와 뇌 하 수 체에 혈관을 레이블 고정을 포함 하 여 심장 통해 사용 하 여. 이 프로토콜은 뇌와 뇌 하 수 체 세포가 전체 조직 또는 두꺼운 조직 조각에서 혈액 맥 관 구조와 상호 작용 하는 방법에 대 한 우리의 이해의 향상을 허용.

이 프로토콜은 송사리 뇌와 뇌 하 수 체에서 혈관에 레이블을 지정 하는 단계 절차를 보여 주며 동시에 조직을 수정 합니다. DiI를 포함 하는 고착 성 용액을 심장에 심장 주입 하 여 라벨링 한 후, 형광 실체 현미경을 사용 하는 슬라이스 (그림 4) 또는 전체 조직에 대 한 혈관을 관찰할 수 있습니다 (그림 5). 두꺼운 조직 슬라이스 또는 전체 조직에, 혈액 맥 관 구조의 아키텍처는 3 차원에서 관찰 될 수 있다. 조직 슬라이스는 고정이 끝난 후 표준 면역 형광 프로토콜을 사용 하 여 특정 표적 단백질에 대해 라벨링 할 수 있으며, 형질 전환 라인에서는 관심 있는 세포가 형광 리포터 단백질을 발현 합니다 (그림 6). 이 혈관과 다른 특정 세포 유형 사이의 상호 작용에 대 한 조사를 할 수 있습니다. 여기에 예를 들어, 메 다 카의 형질 전환 라인을 사용 하 여 녹색...

이 기사에서는 픽스 쳐에 희석 한 DiI의 심장 관류에 의해 텔 레 ost 물고기의 혈관을 라벨링 하기 위한 빠른 프로토콜을 설명 하고, 송사리를 모델로 하 고 뇌 및 뇌 하 수 체 조직에 초점을 맞추고 있습니다.

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

이 절차의 전반적인 목표는 텔레오스트 물고기의 뇌와 뇌하수체에 있는 혈관을 표지하는 것입니다, 우리는 모형 종 medaka에 있는 DiI를 포함하는 고정으로 심장 관혈을 이용합니다. 그래서 간단하고 효율적인이 기술은 텔레오스트 물고기의 뇌와 뇌 하 수 체뿐만 아니라 뉴런 또는 내분비 세포와 혈관 사이의 관계에 관한 중요한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 몇 가지 장점은 빠르고 쉬운 간단한 준비, 텔레오스트 물고기 종에 대한 적응성을 포함한다.생선 홀더를 준비하려면 폴리스티렌 조각을 5센티미터 길이, 3센티미터 너비, 2센티미터 두께로 자르고 폴리스티렌을 직경 9센티미터의 플라스틱 접시에 붙입니다. 그런 다음 메스를 사용하여 폴리스티렌에 3 센티미터 보트 모양의 구멍을 만듭니다. 관류 시스템을 준비하려면 관류 시스템 바늘의 극단에 30~50cm 길이의 플라스틱 캐뉼라를 추가합니다.5센티미터 유리 파이펫을 준비하려면 파이펫 풀러를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 개별 유리 모세 혈관을 늘이십시오. 해부를 시작하기 전에 준비된 DiI 고정 용액으로 10 밀리리터 주사기를 적재하고 주사기의 극단에 캐뉼라로 바늘을 놓습니다. 그런 다음 다른 방향으로 배치 된 테이프의 여러 조각을 사용하여 주사기를 벤치에 고정시키고 현미경과 시트의 위치를 조정하여 해부에 적합한 위치를 얻고 팔꿈치로 주사기 피스톤을 누르는 것입니다.다음으로, 생선 홀더 복부쪽에 안락사된 물고기를 놓고 핀으로 머리와 꼬리를 고정시세요. 가위를 사용하여 피부표면층을 수평으로 잘라 전방 복부를 열고, 집게를 사용하여 심실과 구균 동맥에 대한 명확한 접근이 이루어질 때까지 심장 위의 피부를 제거합니다. 모세관의 사지에 유리 파이프를 추가하고 파이펫의 끝을 깰.유리 파이프를 심실 가까이 에 가져와 주사기 피스톤에 팔꿈치 압력을 추가하여 파이펫으로 심실을 고정하면서 액체를 강제로 꺼낼 수 있습니다. 그런 다음 즉시 부비동 독을 집게로 천명하여 혈액을 순환에서 방출합니다. 심실에서 유리 파이펫의 각도를 조정하여 구푸스 동맥의 입구를 찾고, 피펫개 개구부 내부의 피펫 개구부를 구불 구균 동맥 내로 이동합니다.그런 다음 피펫을 구불 구균 동맥 내부에 유지하면서 30~60초 동안 주사기에 압력을 추가합니다. 모든 혈관의 최적의 라벨링을 위해 모든 혈액을 DiI 고정 솔루션으로 대체할 만큼 오랫동안 구불 구균 동맥으로 침투하는 것이 중요합니다. 관류의 약 60 초 후, 더 이상 혈액 누출이 관찰되지 않는 경우, 물고기에서 유리 파이펫과 바늘을 제거하고, 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 신선한 4 %의 파라 포름 알데히드로 뇌와 뇌하수체를 수확.그런 다음 화상 진찰을 위한 견본을 준비하기 전에 세척 당 10 분 동안 신선한 PBS에서 조직을 두 번 헹구습니다. 입증된 바와 같이 DiI를 포함하는 고정용액의 심장 주입 후, 표지된 혈관은 형광 스테레오 현미경 검사법에 의해 조직 조각또는 공초점 현미경검사법에 의해 조직 조각에서 관찰될 수 있다. 용액이 구균 동맥 대신 심실에 주입되거나 용액이 너무 낮은 압력 및 /또는 너무 짧은 기간 동안 주입되는 경우 혈관의 부적절한 라벨링이 관찰됩니다.또한, 동일한 이미징 파라미터를 가진 동일한 조직을 이미징할 때, 라벨링 강도의 감소는 며칠 후에 관찰될 수 있으며, 신호가 조직 샘플 내에서 더 확산되는 것으로 나타난다. 관심 있는 세포의 발현형 기자 단백질이 혈관과 그밖 세포 모형 사이 상호 작용의 조사를 허용하는 표준 면역 형광 프로토콜을 사용하여 관심의 특정 단백질을 위해 추가로 표지될 수 있는 내의 형질 선에서 조직 조각. 구불 구균 동맥에 도달하는 것이 중요합니다.이 달성 될 때, 주사기 피스톤에 압력을 추가 하는 성공적인 절차를 확인 하는 전구의 확장을 유도 한다. 이 기술은 텔레오스트 뇌하수체에 있는 내분비 세포와 혈관 사이 상호 작용을 일반적으로 조사하는 데 사용될 수 있습니다, 그러나 어쩌면 더 구체적으로 텔레오스트와 포유동물의 포털 시스템 사이 가능한 다름 또는 유사성을 조사하기 위하여. 이 정치적 사용은 방독면과 환기 실을 사용하는 것과 같은 독성 및 휘발성 화합물 예방 조치를 항상 이러한 절차를 수행 할 때 취해야하기 때문입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 설치류와 다양한 연령대의 비 인간 영장류의 뇌 조각의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를, 소개하는 유전자 총을의 사용을 보여줍니다. 이 특정한 경우에, 우리는 성인 생쥐 (3-6개월 세) 및 성인 cynomologus 원숭이 (9-15년 이전)를 사용합니다. 원래 박사 Lichtman의 실험실에 의해 설명이 기술은...

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

쥐의 심장을 통해 두뇌의 최상의 보존을 구하려면 여기 혈관 시스템을 통해 perfused 4 % paraformaldehyde를 사용하여 낮은 비용, 빠른, 제어 및 균일한 고정 절차를 설명합니다.

설치류에 대한 전체 동물 관류 고정

신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

쥐 뇌 혈관 해부학 분석 실험 뇌졸중 연구에 중요한 역할을한다. 이러한 맥락에서, 색 라텍스와 혈관 재관류는 몇 년을위한 표준 도구로 간주되었습니다. 그러나,이 기술은 재현성을 저해 별개의 기술적 한계를 의미합니다. 여기, 우리는 재현 방식으로 뇌성 혈관을 시각화 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 고 대비 시각화와 뇌성 혈관의 충분한 충전의 왼쪽 심실 심근 결과를 통해이 상업적으로 이용 가능한 카본 블랙 잉크 혼합물의 주입. 우리는 성공적으로 다른 유전 적 배경을 가진 쥐 대뇌 혈관 지역 사이 anastomotic 포인트를 확인하기 위해이 기술을 적용했습니다. 쥐 경색 볼륨을 관찰하고 분석 할 수있는 널리 사용되는 도구 - 우리는 마침내 우리 선박 착색이 소설과 간단한 방법은 triphenyltetrazolium 염화 (TTC) 염색과 결합 할 수 있다는 증거를 제공합니다.

카본 블랙 잉크의 혈관 재관류은 뇌 혈관의 신뢰성 시각화 수 있습니다

친 유성 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다.

혈관 시각화를위한 DiI 관류<em&gt; 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

마우스 뇌의 자유 부동 면역 염색

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

예비 조사 결과 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 주위 세포 사멸을 유발한다는 사실이 확인되었습니다. SAH 후 세포주위 수축성을 평가하려면 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주피를 구별해야 합니다. 따라서 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 동시에 라벨링하는 절차가 개발되어 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰을 용이하게 합니다.

지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징

뇌혈관 기능 장애를 조사하기 위한 모델로 생쥐의 대혈관 확장을 화학적으로 유도하는 것을 시연하고 있으며, 이는 혈관성 치매 및 알츠하이머병 모델링에 사용할 수 있습니다. 또한 실리콘 고무 화합물을 주입하여 혈관 구조를 시각화하고 혈관 크기의 변화를 측정하기 위한 명확한 시각적 지침을 제공하는 방법을 보여줍니다.

A visual approach for inducing dolichoectasia in mice to model large vessel-mediated cerebrovascular dysfunction(대혈관 매개 뇌혈관 기능 장애를 모델링하기 위해 마우스에서 백우절충증을 유도하기 위한 시각적 접근법)

배우세요 뇌와 뇌하수체 혈관 라벨링 기법을 심장 관류와 DiI 형광 염료를 사용하여 메다카(Oryzias latipes)에서 수행하는 방법을. 이 효율적인 프로토콜은 신경과 혈관 구조 간 관계 연구에 활용됩니다.

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

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