Name: 도코사헥사에노믹, 에이코사펜타에노믹, 아라키돈산의 에폭시화된 대사산물의 효소 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 배우세요 BM3 효소를 이용한 에폭시화 지방산의 효소 합성 방법을. DHA, EPA, 아라키돈산의 대규모 합성 및 정제 프로토콜을 통해 생물학적 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 R00 ES024806 (건강의 국가 학회), DMS-1761320 (국립 과학 재단) 및 미시간 주립 대학에서 시작 기금에 의해 지원됩니다. 저자는 준 양 박사 (데이비스 캘리포니아 대학)와 라리타 Karchalla (미시간 주립 대학) 효소 반응의 최적화에 대한 도움을 감사하고 자, 박사 토니 쉴밀러 (MSU 질량 분광및 Metabolomics 시설) HRMS 데이터 수집에 대한 지원을 제공합니다.

주의: 나열된 화학물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오.
1. 야생형 BM3의 식
<ol><li>접종 pBS-BM3 DH5α 대장균 (박사 F. 앤 워커의 관대 한 기부) 5 mL의 멸균 LB 국물 0.5 mg의 암피실린을 20 mL 배양 튜브에 첨가했습니다.</li>
	<li>200 rpm에서 24 시간 동안 37 °C에서 셰이커에서 세포 배양을 배양합니다. 펀바흐 또는 에를렌마이어 플라스크에 밤새 스타터 배양(5 mL)과 암피실린 100 mg을 멸균 LB 국물 1L에 넣습니다. 200 rpm에서 6 시간 동안 37 °C에서 흔들어, 200 rpm에서 18 시간 동안 30 °C에서 흔들어.</li>
	<li>세포 배양을 4°C에서 10분 동안 1,000 x g에서수집하고 원심분리한다. 상온액을 버리고 효소 가정제될 때까지 세포 펠릿을 -78°C에서 저장한다. 참고 : 상판은 표백제로 처리하여 화학적으로 살균되거나 오토 클레이브를 사용하여 살균 한 다음 배수구를 부어 줄 수 있습니다.</li>
</ol>2. BM3의 정화.
<ol><li>
세포 라해스
	<ol>
<li>얼음에 세포 펠릿을 해동하고 얼음 감기 (4 °C) 용해 완충제 (10 mM Tris, 0.01 mM 페닐메틸설포닐 불소 (PMSF;), 0.01 mM EDTA; pH 7.8)의 40 mL에서 다시 중단합니다. 주의: PMSF는 접촉시 독성이 있습니다.</li>
		<li>얼음 위에있는 동안 초음파 균질화 (출력 전력 설정 10, 의무 100 %)로 1 분 동안 세포를 초음파 처리한 다음 세포를 용해시키기 위해 얼음에 1 분 간 휴식을 취합니다. 이 절차를 6번 반복합니다. 세포를 4°C에서 30분 동안 11,000 x g에서 펠릿 세포 파편으로 용해시한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
선호도 크로마토그래피
	<ol>
<li>4°C에서 완충A(10 mM Tris, pH 7.8)의 5개의 컬럼 부피(CV)로 세척하여 강한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(재료 표참조, 직경: 2.8 cm x 6 cm, 컬럼 부피: 37 mL)을 준비합니다.</li>
		<li>세포가 평형 컬럼에 용해를 추가하고 차가운 버퍼 A. 차가운 버퍼 B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV)로 컬럼을 세척하여 BM3를 용이시성하는 3 CV로 컬럼을 세척합니다.</li>
		<li>적갈색 용리액 분율을 수집합니다. 단백질을 즉시 사용하지 않는 경우, 글리세롤의 동일한 부피와 혼합하고 액체 질소와 플래시 동결. 냉동 용액을 -78 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. BM3에 의한 DHA의 에폭증
<ol><li>18.8 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 DHA 0.308 g(0.940 mmol)을 첨가하여 2L의 교반 반응 완충액(0.12 M 칼륨인산염, 5 mM MgCl 2, pH 7.4)과 함께 해동된 BM3 효소의 20 nM을 첨가하여 반응을 준비한다. 상기 효소 농도는 일산화탄소/디티오네이트 스펙트럼 분석법19에의해 결정될 수 있다.</li>
	<li>용액이 교반되는 동안, 반응 완충액에 용해된 NADPH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 감소, 테트라소듐 염, 0.808 g, 0.940 mmol)의 1동등한 를 첨가하여 반응을 시작한다. 주사기와 바늘에 부착된 공기 채워진 풍선으로 반응 혼합물을 통해 공기를 버블링하면서 30 분 동안 반응을 저어줍니다.</li>
	<li>분광광도계(재료 표참조)를 사용하여 340 nm에서 반응 혼합물의 흡광도를 확인하여 NADPH가 고갈되었는지 확인합니다. NADPH의 소비를 나타내는 남은 흡광도가 없는 경우, 반응이 완료됩니다. 참고 : 일반적으로 반응은 30 분 후에 완료됩니다.</li>
	<li>용액의 pH가 4에 도달 할 때까지 1 M 옥살리산을 드롭 와이즈로 천천히 첨가하여 반응 혼합물을 담금질하십시오.</li>
</ol>4. EDP 추출
<ol><li>2 L의 디에틸 에테르 (무수, 과산화수소가없는)로 담금질 완충액을 3 회 추출합니다. 에테르층(6L)을 수집하고 무수 황산마그네슘(MgSO 4)으로 건조한다.</li>
	<li>용액으로부터 MgSO 4를 걸러내고 건조된 에테르 층을 로터리 증발기 위에 농축하여 조EDP 잔류물을 생성한다.</li>
	<li>플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화합니다(40 g 실리카 카트리지가 충분함). 헥산에서 10% 에틸 아세테이트(EtOAc)에서 시작하여 22분 이상 헥산에서 최대 60% EtOAc까지 램프합니다. 참고 : 세 가지 주요 피크를 획득하고 수집, 1의 순서로 용리. 미반응 DHA; 2. EDP 이소미의 혼합물; 3. 디에폭사이드(일반 과산화 제품)(그림 1참조).</li>
	<li>분수를 결합하고 회전 증발기에 집중. 이 예에서, 0.074 g, (24%) 반응하지 않은 DHA, 0.151 g (47%) EDP 이소미, 0.076 g, (22%) 디에폭사이드를 얻었다.</li>
</ol>5. EDP의 에스테르화, 16 (S),17 (R)- 및 19 (S), 20 (R)-EDP 및 에스테르의 사포화의 분리
주의: 트리메틸실릴디아조메탄(TMS-디아조메탄)은 접촉과 흡입 모두에 의해 매우 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비가있는 연기 후드에서만 사용하십시오.
<ol><li>무수 탄올(MeOH) 및 무수 톨루엔 3 mL의 2 mL로 둥근 바닥 플라스크 또는 작은 바이알에 에폭신(0.151 g, 0.435 mmol)을 희석하고, 교반바를 추가하고, TMS-다이아조메탄(1.2 어금니골 등가물, 또는 0.26 ml의 2m) 아액에 넣은 다.</li>
	<li>10분 간 기다렸다가 옅은 노란색이 유지될 때까지 TMS-디아조메탄(0.050 mL)을 추가합니다.</li>
	<li>30 분 후, 조심스럽게 회전 증발기를 사용하여 혼합물을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 잔류 물을 정화한다. 헥산에 4% EtOAc(실리카 젤 컬럼 또는 카트리지 40g 사용)을 22분 동안 사용하여 용루합니다. 이 예에서, 19,20-EDP 메틸 에스테르 (0.116 g, 74%) 및 16,17-EDP 메틸 에스테르(0.029 g, 19%), 투명 오일(총 수율, 93%)으로 수득하였다.</li>
	<li>정제된 EDP 메틸 에스테르 레지아좀을 함유하는 분획물을 수집한다. 19(S),20(R)-EDP 메틸 에스테르를 먼저, 16(S),17(R)-EDP 메틸 에스테르가 뒤따른다.</li>
	<li>혼합 분획이 남아 있는 경우(이성물질을 모두 함유하고, 8:1 헥산/EtOAc에서 박층 크로마토그래피(TLC)로 평가할 수 있고, 과망간산 칼륨(KMnO 4)으로 염색됨)을 이전과 동일한 용매 시스템으로 다시 크로마토그래피합니다.</li>
	<li>개별 레지오이솜을 함유하는 분획을 집중시다. 참고: 이 시점에서, 정체성 및 순도는 NMR에 의해 평가될 수 있다(CDCl 3을 용매로 사용; 도2에 대한 범례 참조).</li>
	<li>개별 EDP 메틸 에스테르 regioisomers를 그들의 산 형태로 변환하려면, THF에서 EDP 에스테르를 희석 : 물 (에스테르의 약 0.7 mL / 0.1 mmol). 수성 LiOH 2M(어금니 3개)을 넣고 밤새 저어줍니다. 참고 : 반응의 완전성은 TLC에 의해 평가 될 수있다, 사용하여 3:1 헥산 / EtOAc, KMnO 염색4; 제품의 유지율은 ~0.3입니다.</li>
	<li>혼합물의 pH가 3-4에 도달 할 때까지 포믹 산으로 천천히 반응을 담금질하십시오. 물과 에틸 아세테이트 (에스테르의 1-2 mL / 0.100 mmol)를 추가하고 층을 분리합니다. EtOAc (3 x 5 mL)로 물 층을 추출하고 포화 염수 (NaCl) 용액으로 씻고 무수황산 나트륨 (Na2 SO 4)을 통해 EtOAc 층을 건조시십시오.</li>
	<li>회전 증발기로 에틸 아세테이트 용액을 농축하고 헥산 (10 mL)을 추가하고 다시 농축하십시오. 잔류 포산을 제거하여 아제오열대지방으로 두 번 반복합니다. 15분 동안 10-30% EtOAc로 용출하여 플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화합니다.</li>
	<li>원하는 분획을 농축하고 정제산을 감당하기 위해 진공에서 건조시다. 참고: 이 단계에서, 영항성 순도는 평가될 수 있다(키랄 HPLC에 의해, 도 3에 대한 범례 참조 - 열 및 조건에 대한 그림 4). 화학적 순도는 C18(chiral) HPLC에 의해 평가될 수 있다(재료 표 및 참조 14 참조 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

우리는 DHA의 두 가지 가장 풍부한 에폭시 대사 산물을 준비하기위한 운영적으로 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시 - 19,20 및 16,17-EDP. 이러한 에폭시 지방산은 야생형 BM3 효소를 사용하여 고도로 에난티오퓨어(S,R-이솜) 형태로 제조될 수 있다. 문제 해결에 사용될 수 있는 몇 가지 중요한 점과 AA 및 EPA의 enantiopure 에폭시 대사 산물을 준비하는 우리의 방법의 확장은 아래에 설명되어 있습니다.
BM3 스토리지 지침
정제된 BM3 효소를 저장하는 것은 -78°C 냉동고에 저장하기 전에 동일한 부피의 글리세롤및 플래시 동결액과 액체 질소를 혼합하여 가능하다. 효소가 동결되면 최대 1 년 동안 보관 할 수 있습니다. 효소는 한 번만 해동될 수 있고, 얼음위에 해동되어야 하며, 얼음위에 4시간 동안만 방치할 수 있으며, 얼음 목욕없이 해동되는 효소를 허용하...

고도 불포화 지방산 (특히 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산)이 인간 생물학에서 재생하는 역할에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 증가함에 따라, 연구자들은 자신의 대사 산물이 매력적인 혜택의 넓은 범위의 주의를 촬영하고있다 전시. 특히, 효소의 시토크롬 P450 클래스에 의해 생성된 에폭시 지방산 대사산물은 큰 초점포인트가 되어 왔다. 예를 들어, 에폭시에코사트리노산(EETs), 에폭시도코사펜타에노산(EDPs) 및 에폭시코사테라에노산(EEQs)을 포함한 많은 PUFA 에폭산화물은 혈압 및 염증조절에 중요한 역할을 합니다 1,2 , 3개 , 4개 , 5. 흥미롭게도, AA 및 EPA 에폭사이드의 특정 상체및 레지오머는 혈관 수축에 다양한효과를 가지는 것으로 알려져 있다 6,7. EET및 EEQs의 상체및 레지오좀의 생리학적 효과는 문서화되었지만, DHA로부터 형성된 유사한 에폭시도코사펜타에노산(EDPs)의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. EPA와 DHA가 풍부한 피시 오일8의광범위한 사용은 EDP9에대한 관심을 불러 일으켰습니다. 이러한 보충제의 혜택은 부분적으로 다운스트림 DHA 대사 산물로 인해 것으로 추정된다 (16,17-EDP 와 19,20-EDP는 가장 풍부한 되는) EDP의 생체 내 수준은 다이어트에 DHA의 양과 아주 잘 조정하기 때문에10, 11.
대사체학, 화학 생물학 및 기타 방법에 의한 이러한 에폭시 지방산의 메커니즘과 표적을 연구하는 것은 레지오-및 스테레오 이성물질의 혼합물로 존재하기 때문에 부분적으로 도전적인 것으로 입증되었으며, 순수한 양의 지방을 얻는 방법 적분자 및 레지아이좀이 필요합니다. 화학적으로 이러한 화합물을 합성 하기 위한 전통적인 수단 효과가 입증 되었습니다. 에폭시화를 위한 메타-클로로페록시벤조산과 같은 페록시산의 사용은 많은 단점, 특히 개별 레지오이좀제와 상각체의 고가의 고된 정제를 필요로 하는 에폭시화 선택성의 부족이 있다. DHA 및 EPA 대사산물의 총 합성이 가능하지만, 또한 높은 비용과 낮은 수율12,13과같은 대규모 합성에 비실용적만드는 단점을 앓고 있다. 효소 반응이 레지오-및 스테레오셀렉티브(14)이기 때문에 효소합성으로 효율적인 전체 생산을 달성할 수 있다. 연구 결과에 따르면 AA와 EPA(BM3)의 효소 에피시형성은 재지오선택적 및 enantioselective15,16,17,18,그러나 이 절차는 DHA로 시험되지 않았거나 큰 규모. 우리의 방법의 전반적인 목표는 그들의 개별 enantiomers로 순수한 에폭시 지방산의 상당한 양을 급속하게 생성하기 위하여 이 화학 요법 에폭시를 확장하고 낙관하는 것이었습니다. 여기에 제시 된 방법을 사용하여, 연구원은 EDP 및 기타 PUFA 에폭시 대사 산물의 합성을위한 간단하고 비용 효율적인 전략에 액세스 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>무수 마그네슘 황산</td>염 <td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>무수 메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>무수 황산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>무수 톨루엔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>NA Arachidonic Acid (AA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>는 공기에 민감합니다.</td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>시그마</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO (분자생물학 등급)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>도코사헥사엔산(DHA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>공기에 민감합니다.</td></tr><tr><td>EDTA (에틸렌디아민테트라아세틱 산)</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>&nbsp; U-99A</td><td>는 공기에 민감합니다.</td></tr><tr><td>에틸 아세테이</td>트 <td>시그마&nbsp;</td><td>34858</td><td></td></tr><tr><td>NA 플래시 컬럼 카트리지 25, 40, 4, 12g 크기</td><td>Fisher Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>또는 기존 컬럼 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다</td></tr>. 포<tr><td>름산(HPLC 등급)</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>수산화리튬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>메탄올 (HPLC 등급)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td></td></tr><tr><td>NA NADPH 테트라소듐 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>공기에 민감합니다.</td></tr><tr><td>옥살산</td><td>시그마-알드리치</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 트랜스펙트 DH5&알파; 대장균</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA PMSF (페닐메탄설포닐 플루오라이드)</td><td>시그마</td><td>P7626</td><td>독성!</td></tr><tr><td>칼륨 과망간산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>223468</td><td>TLC 염색용.&nbsp;</td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q 세파로스 고속 흐름 수지 (GE 헬스케어 생명과학)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>효소의 음이온 교환 정제용</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>테트라하이드로푸란, 무수</td><td>시그마-알드리치</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-디아조메탄(헥산 중 2.0M)</td><td>시그마-알드리치</td><td>362832</td><td>매우 독성이 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><<tr><td>strong>또한 필요:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 플래시 정화 시스템 (우리는 Buchi Reveleris X2를 사용했습니다)&nbsp;</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC 란 (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td><td></td> 10,000 x g 키랄 HPLC 란 (럭스 셀룰로오스 3), 250 x 4.6 mm, 5 &micro의 가능한 애질런 <td></td><td></td></tr> 트 <tr><td>분리기</td>;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> M, 1000 &Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 화학 용품: 2L 분리 깔때기, 1000-2000L 용량의 비커 및 삼각 플라스크, 20mL 바이알, HPLC 바이알, 작은 둥근 바닥 플라스크 및 교반 막대.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (우리는 Shimadzu Prominence LC-20AT 분석 펌프와 SPD-20A UV-vis 검출기를 사용합니다</td>. <td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 분광광도계&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NMR NMR: 애질런트 DD2 분광계(500MHz)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic dismembrator 또는 초음파 균질기</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

도코사헥사에노믹, 에이코사펜타에노믹, 아라키돈산의 에폭시화된 대사산물의 효소 합성

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

다양한 불포화 지방산 (PUFAs)의 에폭시화 대사 산물은 에폭시 지방산이라고 불리우며 인간 생리학에서 광범위한 역할을 합니다. 이 대사 산물은 효소의 시토 크롬 P450 클래스에 의해 내인성으로 생산됩니다. 그들의 다양 하 고 강력한 생물학적 효과 때문에, 이러한 대사 산물 공부에 상당한 관심이 있다. 에폭시 지방산이 먼저 상당한 양과 높은 순도로 얻어져야하기 때문에 신체에서 이러한 대사 산물의 독특한 역할을 결정하는 것은 어려운 작업입니다. 천연 공급원으로부터 화합물을 얻는 것은 종종 노동 집약적이며 수용성 에폭사이드 하이드로 라제 (sEH)는 대사 산물을 빠르게 가수 분해합니다. 다른 한편으로는, 화학 반응을 통해 이러한 대사 산물을 얻는 것은 매우 비효율적입니다, 순수한 regioisomers 및 상체 물질을 얻기의 어려움으로 인해, 낮은 수율, 광범위한 (고가의) 정제. 여기에서, 우리는 BM3를 가진 에폭시를통해 DHA에서 19(S),20(R)-및 16(S),17(R)-에폭시도코펜타에노산(EDPs)의 효율적인 효소 합성을 제시합니다, 원래 바실러스에서 분리된 세균 CYP450 효소 megaterium (즉, 쉽게 대장균에표현된다). 순도의 특성화 및 측정은 핵 자기 공명 분광법 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 질량 분석법 (MS)으로 수행됩니다. 이 절차는 PUFA 에폭시 대사 산물의 효소 합성의 이점을 설명하고, 유사한 에폭시에이코사이코노레이노어를 생성하는 아라키돈산(AA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 포함한 다른 지방산의 에폭시화에 적용가능하다. 산 (EETs) 및 에폭시에이코에테라에노산(EEQs).

효소 에폭시화로부터 원유 혼합물의 정제시 얻어진 플래시 컬럼 크로마토그램(아래와 같이 자동화된 플래시 정제 시스템을 사용하여 수행됨)은 도1에 나타내었다. 레지오이머의 에스테르화 및 분리에 이어,순수한 16(S),17(R)-EDP 및 19(S),20(R)-EDYl 에스테르를 수득하였다. 전형적으로, 이들은 대략 1:4 대 1:5 비율로 존재하며, 주요 제품은19(S),20(R)-EDP이다. 다른 EDP 레지오이솜제(예를 들어, 13,14- 또는 10,11-EDP)는 얻어진 적이 없다. 1H-NMR 스펙트럼 16(S), 17(R)-EDP(도2A)및 19(S), 20(R)-EDP(도2B)메틸 에스테르는...

우리는 세균성 시토크롬을 사용하여 아라키돈산(AA), 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜테노산(EPA)의 특정 상악제 및 레지오이좀의 대규모 효소 합성 및 정제에 유용한 방법을 제시합니다. P450 효소 (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

그래서 우리의 프로토콜은 우리가 enantiopure 에폭시 지방산을 준비하는 것을 허용하고, 이 방법은 이 대사 산물이 바디에서 작용하는 기계장치에 대한 연구를 진행하는 것을 도울 수 있습니다. 역사적으로 순수 에폭시 지방산을 얻기가 매우 어렵습니다. 따라서 우리의 프로토콜은 간단하고 빠르며 비용 효율적이며 이러한 대사 산물의 상당한 양을 준비할 수 있습니다.예, 우리는 DHA에 대한 프로토콜을 개발, 하지만 그것은 또한 EPA와 아라키도니아산에 대 한 아주 잘 작동. 시약의 일부는 공기에 민감한, 특히 DHA와 NADPH이기 때문에 신속하게 작업하고 설정이 간단하도록 모든 것을 미리 페어링해야합니다. 또한, 위험을 주의하십시오.우리의 프로토콜은 효소학과 유기 화학 모두에서 기술을 사용합니다. 시각화는 이러한 분야의 특수 기술에 익숙하지 않은 독자와 시청자를 돕기 위해 매우 중요합니다. 접종을 하려면 pBS-BM3 의 글리세롤 스톡에 담근 멸균 루프 또는 파이펫을 0.5 밀리그램의 암피실린으로 보충한 멸균 LB 국물의 5밀리리터에 담근 멸균 루프 또는 파이펫을 사용하십시오.200 rpm에서 24 시간 동안 섭씨 37도에서 셰이커로 세포 배양을 배양하십시오. 그런 다음, 5 밀리리터 스타터 배양과 100 밀리그램의 암피실린을 Erlenmeyer 플라스크에 멸균 LB 국물에 1리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 6시간 동안 200rpm에서, 섭씨 30도에서 200rpm에서 18시간 동안 흔들어 보겠습니다.그 후, 원심분리기 튜브로 세포 배양을 수집하고, 1, 000g에서 10분 동안 섭씨 4도에서 세포 배양을 원심분리한다. 상체를 다른 플라스크에 붓습니다. 표백제또는 오토클레이브를 사용하여 오염을 제거하고 효소가 정화될 때까지 세포 펠릿을 섭씨 영하 78도에 보관합니다.세포 용해를 수행하기 위해 먼저 얼음에 세포 펠릿을 해동하고 Tris, PMSF 및 EDTA를 포함하는 얼음 차가운 용용화 버퍼40 밀리리터에서 다시 중단하십시오. 얼음에 있는 동안, 초음파 균질화로 1 분 동안 세포를 초음파 처리, 출력 전원 설정 10 및 100의 의무, 세포를 lyse하기 위해 얼음에 1 분 휴식. 이 절차를 여섯 번 반복합니다.원심분리기세포는 세포 잔해를 11, 000배에서 30분 동안 섭씨 4도에서 흘린다. 친화도 크로마토그래피를 수행하기 위해, 슬라이딩 도어가있는 차가운 방이나 냉장고에서 섭씨 4도에서 먼저 pH 7.8에서 10 밀리알러 트리스의 5 개의 열 볼륨으로 수지를 세척하여 강력한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 다음으로, 셀 용액의 상체를 평형 컬럼에 추가하고, 차가운 완충제 A.Then의 3개의 컬럼 부피로 컬럼을 세척하고, 10밀리머 트리스의 6개의 컬럼 부피와 600밀리알라 나트륨염화로 컬럼을 세척하여 BM3를 엘테한다.붉은 갈색 용액 분획을 수집합니다. 단백질이 즉시 사용되지 않는 경우 동일한 양의 글리세롤과 혼합하고 액체 질소와 플래시 프리즈를 넣습니다. 냉동 용액을 영하 78도에 보관하십시오.DHA의 편광을 수행하기 위해, 일산화탄소 디티온인테 스펙트럼 분석 방법에 따라 먼저 해동 된 BM3 효소의 농도를 결정한다. 그런 다음, 자기 교반 판에 교반되는 반응 버퍼의 두 리터를 포함하는 비커에서, DMSO의 18.8 밀리리터와 BM3 효소가 20 나노 몰라로 희석된 DHA의 0.94 밀리몰을 추가합니다. 용액이 교반하는 동안 NADPH의 0.94 밀리몰을 함유한 반응 버퍼8.7 밀리리터를 추가하여 편산화 반응을 시작합니다.반응에 30분 동안 저어주사기에 부착된 공기가 채워진 풍선과 비커 내부에 바늘이 부착되어 반응 혼합물에 공기를 부적시세요. 그 후, 반응 혼합물의 마이크로리터 1개를 끌어서 나노드롭 분광광계에 넣어 340 나노미터에서 흡광도를 측정한다. 물을 빈 칸으로 사용하십시오.NADPH가 소비되었음을 나타내는 남은 흡광도가 없는 경우 반응이 완료됩니다. 용액의 pH가 약 4에 도달할 때까지 1-어금다 옥살산을 드롭와이즈로 천천히 첨가하여 반응 혼합물을 담급니다. 이제 담금질 버퍼 용액을 과산화수소가 없는 디틸 에테르 2리터로 추출합니다.분리 깔때기를 사용하여 레이어를 흔들고 분리하고 에테르를 Erlenmeyer 플라스크로 수집합니다. 두 번 더 반복하고 약 50 그램의 무수 마그네슘 황산염을 추가하여 에테르를 건조시킵니다. 진공 필터 깔때기에 말린 에테르를 부어 황산 마그네슘을 걸러내고 여과 된 에테르 층을 회전 증발기의 둥근 바닥 플라스크로 옮춥니다.회전 속도를 중간 크기로 조정하고 진공을 시작하여 액체를 농축하여 원유 EDP 잔류물을 산출합니다. 잔류물을 40그램의 실리카 카트리지에 적재하여 자동화된 플래시 정화 기를 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피를 수행합니다. 헥산에서 10%에틸 아세테이트에서 시작하여 22분 동안 헥산에서 최대 60%의 아세테이트를 장착할 수 있습니다.분수는 자동으로 튜브에서 수집됩니다. 그런 다음 각 피크의 분획을 둥근 바닥 플라스크에 결합하고 회전 증발기에 넣고 증발을 시작합니다. 3개의 분획, DHA, EDP 이소마, 및 디옥사이드를 얻습니다.얻은 0.151 그램의 에폭료를 원형 플라스크 또는 작은 유리병에 에스로티화하려면 무수성 메탄올 2 밀리리터와 무수 성 톨루엔 3 밀리리터를 추가하고 저어바를 추가합니다. 플라스크를 고무 중격과 바늘을 통해 아르곤으로 채워진 풍선으로 연결하고 교반하는 동안 주사기를 통해 2 개의 어금니 TMS-diazomethane0의 0.26 밀리리터를 추가하십시오. 10분간 기다린 후 TMS-diazo메탄의 05 밀리리터를 추가하여 옅은 노란색이 나타날 때까지 기다립니다.30분 후, 회전 증발기를 사용하여 혼합물을 조심스럽게 농축하고, 플래시 크로마토그래피 기계에 40그램 실리카 젤 컬럼 카트리지를 사용하여 잔류물을 정화한다. 22분 동안 헥산에서 4%에틸 아세테이트의 동위 층 농도를 가진 엘루트. 정제된 19S, 20R-EDP 메틸 에스테르를 함유한 분획을 먼저 수집하고, 그 다음으로 16S, 17R-EDP 메틸 에스테르가 그 뒤를 이다.지금, 8 대 1 헥산 -에틸 아세테이트 혼합물에서 얇은 층 크로마토그래피에 의해 분획을 평가합니다. 과만가네이트 칼륨을 가진 얼룩은 두 이소마를 포함하는 혼합 분획을 확인합니다. 회전 증발기에 각 피크에 해당하는 분획을 농축한 다음 균형에 무게를 두어 얻은 EDP 에스테르의 양을 결정합니다.혼합 분획이 남아 있으면 이전에 사용했던 것과 동일한 용매 시스템으로 다시 크로마토그래프를 다시 사용합니다. 개별 혈관성자를 포함하는 각 분획을 회전 증발기에 농축합니다. 개별 EDP 메틸 에스테르 regioisomers를 그들의 산 형태로 변환하려면, 물 0.1밀리리터와 함께 에스테르의 0.1 밀리몰당 THF의 약 0.7 밀리리터와 작은 유리병에 EDP 에스테르를 희석.유리병을 얼음 욕조에서 섭씨 0도까지 식히고, 수산화 리튬 용액 3개 상당을 추가하고, 실온으로 따뜻해지는 동안 밤새 아르곤 아래 의욕판을 저어줍니다. 아침에, 혼합물의 pH가 3 ~ 4에 도달 할 때까지 천천히 포믹 산을 추가하여 반응을 담금질. 그런 다음, 층을 분리하기 위해 물과 에틸 아세테이트의 두 밀리리터를 추가합니다.에틸 아세테이트 10밀리리터를 3회 추출하고, 포화염수 액액 20밀리리터로 세척하고, 에틸 아세테이트 층을 건조시키기 위해 용액에 여러 그램의 무수성 나트륨 황산염을 첨가한다. 회전 증발기를 사용하여 에틸 아세테이트 솔루션을 농축하고, 육사 10밀리리터를 추가하고, 다시 농축한다. 잔류 포믹 산을 제거하기 위해 두 번 반복하십시오.플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화하여 15분 동안 10~30%의 아세테이트로 희석합니다. 회전 증발기에 원하는 분획을 농축하고, 정제산을 감당하기 위해 바쿠오에서 건조한다. 효소 에편화로부터 조분 혼합물의 정화 시 얻은 플래시 컬럼 크로마토그램이 여기에 나와 있다.세 가지 주요 피크를 얻어, 첫 번째, 비반응 DHA, 두 번째, EDP 이소마의 혼합물, 그리고, 세 번째, 디옥사이드의 순서로 청례, 이는 정상적인 과산화 제품입니다. 혈관성모의 에스테르화 및 분리에 이어, 양성자 NMR 스펙트럼은 고순도 16S, 17R-EDP 및 19S, 20R-EDP 메틸 에스테르를 획득했음을 나타낸다. 키랄 HPLC는 EDP의 산 형태의 내황 순도를 확인했습니다.오염을 피하기 위해 처리 하고 접종하는 동안 국물을 멸균하십시오. 편산화는 다른 지방산에 사용될 수 있다. 그래서 우리는 또한 아라키도닉과 에이코사펜타테노산으로 시도했고, 우리는 그 enantiopure 에산화물의 좋은 수확량을 얻었기 때문에 14, 15-EET 및 17, 18-EEQ.그래서 연구원이 에폭시 지방산에 접근할 수 있게 하는 프로토콜은 이 화합물의 생물학 기능에 대한 연구에 도움이 될 수 있습니다, 이는 약물 리드로 그들의 사용으로 이어질 수 있습니다. 유해 화학물질은 접촉에 의해 유해한 PMSF와 접촉 및 흡입에 의해 매우 독성이 있는 TMS-diazo메탄입니다. 그래서 후자는 연기 후드와 적절한 개인 보호 장비에 사용해야합니다.

enzymatic-synthesis-epoxidized-metabolites-docosahexaenoic

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

산화 적 변환에 대한 보조 인자 - 우리는 과산화수소의 광 촉매 작용으로 발생하는 프로토콜을 기술한다.

라이트 기반 효소 탈 카르 복 실화

카이 랄 아미노 알콜 건설 기계 유기 합성에 사용 하기 위해 다양 한 분자입니다. 패-리 신에서 시작, 우리 diastereoselective C H 산화 촉매 dioxygenase에 의해 해당 수 아미노산의 carboxylic 산 moiety의 분열에 의해 다음에 의해 결합 하는 효소 캐스케이드 반응에 의해 아미노 알콜을 합성 한 decarboxylase입니다.

패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응

이 프로토콜에서 포드는 phenyoxadiazolyl 메 틸 sulfone 기반 시 약 쓰이므로, 특히 항 체의 thiols 화물의 사이트 선택 첨부 파일에 대 한 종합을 설명 합니다. 또한, 합성 및 포드 베어링 bifunctional chelator 및 모델 항 체에의 활용의 설명 합니다.

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

이 작품은 C. elegans에있는 endocannabinoid 2-아라키도노이드 글리세롤 (2-AG)를 검출하고 정량화하는 강력하고 간단한 방법을 기술합니다. 분석 적 증명 기준은 동위원소 희석 및 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화-탠덤 질량 분석법(LC-ESI-MS/MS)에 의한 2-AG의 정량화에 제조및 사용되었습니다.

케노하브디티스 예쁜꼬마선충에서 2-아라키도노일글리세롤의 정량화를 위한 신분화 표준의 합성

여기에서는 생체 내 갈색 지방 조직의 총 지방산 de novo 지방 형성 분석을 위해 산화중수소 및 가스 크로마토그래피 질량분석법(GCMS)을 활용하는 저렴한 정량 분석법을 제시합니다.

산화중수소를 사용한 갈색 지방 조직에서 de novo 지방산 합성의 정량적 측정

에 따라 상호 복합 십자형 형광 1,4 - distyryl -2,5 - 비스 (arylethynyl) 벤젠 benzobisoxazole 핵은 질적으로 다양 루이스 산성 루이스 기본적인 분석을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 분석 첨가시 관찰되는 cruciforms 방출 색상의 차이에 의존한다. 구조적으로 밀접한 관련이 종은 서로 구별 할 수 있습니다.

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배우세요 BM3 효소를 이용한 에폭시화 지방산의 효소 합성 방법을. DHA, EPA, 아라키돈산의 대규모 합성 및 정제 프로토콜을 통해 생물학적 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

도코사헥사에노믹, 에이코사펜타에노믹, 아라키돈산의 에폭시화된 대사산물의 효소 합성

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