Name: RNA 차세대 염기 서 열 분석 및 생물 정보학 파이프라인은 궤적 특이 수준에서 발현 된 라인-1s를 식별 한다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 배우세요 RNA-Seq 및 생물정보학 파이프라인을 사용하여 DU145 전립선 종양 세포주에서 좌위 특이적 LINE-1 발현을 식별하는 방법을 배우세요. 이 엄격한 프로토콜은 배경 소음을 제거하고 정확한 정량화를 가능하게 합니다.

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우리는 DU145 전립선 종양 세포에 대 한 박사 얀 동에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리는 슈퍼 컴퓨터 스크립트를 만드는 그의 지도와 조언에 네이 선 Ungerleider 감사 드립니다. 이 작품 중 일부는 PD에 GM121812 R01 NIH 교부 금, VPB에 AG057597 R01, 그리고 5TL1TR001418에 대 한 투자를 TK로 지원 했다. 우리는 또한 암 십자군과 Tulane 암 센터 생물 정보학 코어에서 지원을 인정 하 고 싶습니다.

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<li>Solyom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+orphan+transduction+created+by+a+nonreference+LINE-1+retrotransposon%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Pathogenic orphan transduction created by a nonreference LINE-1 retrotransposon.</a> Human Mutation. 33 (2), 369-371 (2012).</li>
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L1 활성은 질병27,28,29에 기여 하는 유전적 손상 및 불안정성을 야기 하는 것으로 나타났다. 약 5000의 전체 길이 L1 사본 중, 수십 개의 진화 하는 젊은 L1s 대부분의 개조 활동2를 차지 합니다. 그러나, 증거가 있다 심지어 일부 오래 된, 소급 적 인 L1s는 여전히 단백질을 손상 DNA를 생산할 수 있는30. 게놈 불안정성 및 질병에서 L1s의 역할을 충분히 인식 하기 위해, 궤적 특이 수준에서 L1 발현이 이해 되어야 한다. 그러나 l1과 관련이 없는 다른 RNAs에 내장 된 L1-관련 서 열의 높은 배경은 진정한 L1 표현을 해석 하는데 중요 한 과제가 된다. 식별 하 고 따라서 개별 L1 좌 위의 표현 패턴을 이해 하는 또 다른 도전은 많은 짧은 읽기 시퀀스가 하나의 고유 한 궤적에 매핑하는 것을 허용 하지 않는 그들의 반복적인 성격 때문에 발생 합니다. 이러한 과제를 극복 하기 위해, 우리는 RNA-서 열 데이터를 사용 하 여 개별적인 L1 좌 위의 발현을 식별 하는 전술한 접근법을 개발 하였다.
우리의 접근법은 높은 레벨을 필터링 합니다 (99% 이상). L1의 서 열에서 생성 된 전사 노이즈의 여러 단계를 취하여 L1-전치와 무관 하다. 첫 번째 단계는 세포질 RNA의 준비를 포함 한다. 세포질 RNA에 대 한 선택 하 여, L1 관련 된 읽기 핵에서 발현 된 인 트로 닉 mRNA 내에서 발견은 크게 고갈. 시퀀싱 라이브러리 준비에서, L1s 관련이 없는 전사 노이즈를 감소 시키기 위해 취한 또 다른 단계는 폴 리아 데 닐 화 전사체의 선택을 포함 한다. 이것은 비 mRNA 종에서 찾아낸 L1 관련 전사체 잡음을 제거 합니다. 다른 단계는 안티 센스 L1 관련 전사체를 동정 하 고 제거 하기 위해 스트랜드 특이 적 시퀀싱을 포함 한다. L1s에 매핑되는 RNA-서 열 전사체의 수를 동정 할 때 기능적인 프로모터 영역과 함께 전장 L1s 대 한 주석의 사용은 또한 잘린 L1s에서 비롯 된 배경 잡음을 제거 한다. 마지막으로, L1 소급 성과 관련이 없는 L1 서 열의 전사 잡음을 제거 하는 마지막 중요 한 단계는 RNA-서 열 전사체가 맵핑된 것으로 확인 된 전장 L1s의 수동 큐 레이 션 이다. 수동 큐 레이 션은 L1 프로모터 로부터 발현이 시작 되는 것을 확인 하기 위해 주변 게놈 환경의 맥락에서 각각의 생물 학적으로 식별 가능 하 게 표현 된 L1 궤적을 가시화 하는 것을 포함 한다. 이러한 접근법은 DU145, 전립선 종양 세포 라인에 적용 되었다. 배경 소음을 줄이기 위해 준비 관련 단계를 모두 수행 하는 경우에도 l1 좌 위의 약 50%가 다른 전사 소스에서 발생 하는 l1 배경 노이즈로 거부 되었습니다 (그림 4). 신뢰성 있는 결과를 생성 하는 데 필요한 엄격 함을 강조 합니다. 수동 큐 레이 션을 사용 하는이 접근법은 노동 집약적 이지만 전체 길이 L1을 둘러싼 게놈 환경을 평가 하 고 이해 하기 위해이 파이프라인을 개발 하는 데 필요 합니다. 다음 단계에는 일부 큐 레이 션 규칙을 자동화 하 여 필요한 수동 큐 레이 션의 양을 줄이는 것이 포함 되지만, 게놈 표현의 아직 완전히 알려지지 않은 성질로 인해, 참조 게놈에서 주석이 없는 소스 발현의 경우, 낮은 영역 mappability, 및 참조 게놈의 구성과 관련 된 복잡 한 요소도이 시점에서 L1 큐 레이 션을 완전히 자동화할 수 없습니다.
시퀀싱으로 개별 l1 좌 위의 발현을 식별 하는 두 번째 과제는 반복적인 L1 전사체의 매핑에 관한 것 이다. 이 정렬 전략에서는, 전사체가 맵핑 되기 위해 참조 게놈에 고유 하 고 동시에 선형적으로 정렬 되어야 합니다. 코드를 매핑하는 쌍을 이루는 끝 시퀀스를 선택 하면 참조 게놈에서 발견 되는 L1 좌 위에 고유 하 게 정렬 되는 전사체의 양이 증가 합니다. 이 독특한 매핑 전략은 특히 하나의 L1 궤적에 대 한 읽기 매핑의 호출에 자신감을 제공 합니다, 그것은 잠재적으로 식별 될 각각의 표현 량을 과소 평가 하지만, 반복적 인 L1. 이 과소 평가에 대해 대략 정확 하 게 하기 위해, 그 mappability에 기초한 각 L1 궤적에 대 한 "mappability" 점수는 고유 하 게 매핑된 전사체 판독의 수를 개발 하 고 적용 하였다 (도 6). 그것은 이상적으로, mappability는 일치 하는 WGS 샘플에 따라 전체 길이 L1에 걸쳐 전체 커버리지 읽기에 득점 해야한다. 여기에서, 우리는 DU145 전립선 종양 세포 주에 l1 좌 위에 매핑 읽기 팽창 또는 수축 하기 위해 각 L1 좌 위의 mapp 능력 점수를 결정 하기 위해 헬 라 셀의 wgs를 사용 합니다. 이 mappability 계산은 조 수정 점수입니다, 하지만 선택 된 ' 완전 한 커버리지 mappability '의 400 읽기는 마음에 종양 세포 주의 동적 특성으로 결정 되었다. 그것은 보충 그림 1에서 관찰 될 수 있다, 매핑된 읽기의 매우 높은 숫자와 함께 몇 L1 좌 위가 있다. 이러한 가능성이 그 좌 위 완전 한 mappability 범위를 대표 하는 것으로 선택 되지 않은 이유입니다, 참조 게놈 내에 있지 않습니다 헬 내에서 중복 된 염색체 서 열에서 온다. 대신에 보충도 1 에 따라 100%의 판독 커버리지의 평균이 400 읽기 전후에 발생 하 고이 평균이 DU145 종양 전립선 세포 라인에도 적용 된다고 가정 하였다.
100-200 bp와의이 정렬 전략은 RNA-서 열 기술 또한 우선적으로 이전 L1s 그들을 더 매핑 할 수 있도록 독특한 돌연변이 시간이 지남에 축적으로 참조 게놈 내에서 진화 한 오래 된 L1s에 대 한 선택. 이 접근법은 L1s의 최 연소 뿐만 아니라 비 참조 다형성 L1s 식별에 관해서 제한 된 감도를가지고 있습니다. L1s의 막내를 확인 하기 위해, 우리는 더 이상 읽기21을 사용 하 게 pacbio 같은 L1 전사체와 시퀀싱 기술의 5 ' 경주 선택을 사용 하는 것이 좋습니다. 이것은 더 독특한 맵핑을 허용 하 고 따라서 표현 된 젊은 L1s의 자신감 있는 식별을 가능 하 게 합니다. RNA-서 열 및 PacBio 접근법을 함께 사용 하면 진정으로 표현 된 L1s의 보다 포괄적인 목록으로 이어질 수 있습니다. 확실 하 게 표현 된 다형성 L1s를 식별 하기 위해 첫 번째 다음 단계는 참조 게놈에 다형성 서 열의 구성 및 삽입을 포함 합니다.
반복 시퀀스를 연구 하는 데 있어서 생물학적 및 기술적 과제는 큰 것 이지만, RNA 시퀀싱 기술을 사용 하 여 전환에 관한 L1 시퀀스의 전사 노이즈를 제거 하는 위의 엄격한 절차를 통해 선별 하기 시작 합니다. 전사 배경 소음의 큰 수준과 자신 있게 그리고 엄격 하 게 개별 궤적 수준에서 L1 식 패턴과 수량을 식별 하는 것입니다.

레트로바이러스는 RNA 중간체를 통해 카피 앤 페이스트 메커니즘으로 게놈에서 "점프" 할 수 있는 반복적인 DNA 요소입니다. 레트로바이러스의 한 서브 세트는 긴 산재 요소-1 (라인/L1s)으로 알려져 있으며, 500 개 이상의 복사본1로 인간 게놈의 여섯째를 만든다. 그들의 풍요로 움에도 불구 하 고, 이러한 사본의 대부분은 결함 및 활성 것으로 생각 하는 추정 80-120 L1 요소와 잘립니다2. 전체 길이 L1은 5 ' 및 3 ' 번역 되지 않은 영역, 내부 프로모터 및 관련 안티 센스 프로모터, 2 개의 비중첩 열린 판독 프레임 (orfs) 및 신호와 polya 꼬리를 가진 길이 약 6kb이 고,5 . 인간에서, L1s는 나이가 많은 가족 들에 비해 시간이 지남에 따라 더 독특한 서 열 돌연변이를 축적 한 것으로 진화 시대에 의해 구별 되는 하위 가족 들로 이루어져 있다 L1HS6,7. L1s는 유일 하 게 자율적이 고, 인간 레트로바이러스 이며 그들의 ORFs는 역 역전사, 효소, 및 RNPs를 RNA 결합 및 샤 페론과 함께 해독 하 고 게놈에 삽입 하는 데 필요한 활동을 표적으로 하는 과정에서 해독 한다 역 전사8,9,10,12.
L1s의 재 변이는 이식 돌연변이 유발, 표적 부위 삭제 및 재배열을 포함 하는 다양 한 메카니즘에 의해 인간 생식 계열 질환을 야기 하는 것으로 보고 되었으며,13,14 , 16. 최근 L1s는 다양 한 상피 암에서 관찰 되 고 있는 돌연 변이 원소의 발현 및 삽입 사건 증가에 따라 발암 및/또는 종양 진행에 역할을 할 수 있다는 가설을가지고 있다17,18 . 모든 200 출산19에 하나의 새로운 L1 삽입이 있는 것으로 추정 된다. 따라서, 활발 하 게 발현 하는 L1s의 생물학을 더 잘 이해 하는 것이 필수적 이다. 다른 유전자의 전사체 내에서 발견 되는 반복 되는 본질과 불완전 한 사본의 풍부 함은 이러한 수준의 분석을 어렵게 만들었습니다.
다행히도, 높은 처리량 시퀀싱 기술의 출현으로, 분석을 통해 L1s 특정 수준에서 진정으로 표현 하는 것을 식별 하기 위해 진전을 이루었습니다. RNA 차세대 염기 서 열 분석을 사용 하 여 발현 된 L1s를 가장 잘 식별 하는 방법에 대 한 다른 철학이 있습니다. 궤적 특정 수준에서 L1 전사체를 맵핑하는 데 제안 된 두 가지 합리적인 접근법만이 있었다. 하나는 L1 폴 리아 데 닐 화 신호와 플 랭킹 시퀀스 (20)를 통해 판독 하는 잠재적 인 전사에만 초점을 맞추고 있다. 우리의 접근은 L1 요소 사이의 작은 시퀀스 차이를 활용 하 고 유일 하 게 하나의 궤적21에 매핑되는 RNA-서 열 판독을 매핑합니다. 이러한 방법 모두는 성적 증명서의 정량화 측면에서 한계가 있다. 정량화는 각각의 L1 궤적 (21)의 ' 고유 mappability '에 대 한 보정을 추가 하거나 특정 궤적 (22)에 고유 하 게 맵핑 될 수 없었던 다중 매핑 판독을 재분배 하는 보다 복잡 한 알고리즘을 사용 하 여 잠재적으로 개선 될 수 있다. 여기서, 우리는 궤적 특이 수준에서 발현 된 L1 원소를 동정 하기 위해 단계별로 RNA 추출 및 차세대 염기 서 열 분석 및 생물 정보학 프로토콜을 상세히 설명 한다. 우리의 접근 방식은 기능 L1 요소의 생물학에 대 한 우리의 지식을 최대한 활용 합니다. 이것은 기능 L1 요소가 l1 요소의 시작 부분에서 시작 되는 l1 프로모터 로부터 생성 되어야 한다는 것을 알고 포함 하 고, 세포질에서 번역 되어야 하 고 그의 전사체는 게놈과 공동 선형 이어야 한다. 간단히, 우리는 신선 하 고, 세포질 rna를 수집 하 고, 폴 리아 데 화 전사체를 선택 하 고, 가닥 특이 적 rna-서 열 분석을 활용 하 여 인간 기준 게놈에서 L1 좌 위에 읽기를 고유 하 게 매핑합니다. 이러한 정렬 된 읽기는 여전히 광범위 한 수동 큐 레이 션을 요구 하 여, 진정으로 표현 된 L1으로 궤적을 지정 하기 전에 L1 프로모터 로부터 전사체 읽기가 시작 되는지 확인 합니다. 우리는 DU145 전립선 종양 세포 선 샘플에이 접근을 적용 하 여 비활성 사본의 질량에서 상대적으로 몇 개의 활발 하 게 전사 된 L1 멤버를 식별 하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ16924AE</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 바이오 분석기 2100</td><td>애질런트 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>애질런트 RNA 6000 나노 키트</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>bedtools.26.0</td><td></td><td></td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/installation.html</td></tr><tr><td>나비 넥타이 -0.12.8</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/0.12.8/</td></tr> <tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>올림푸스 플라스틱</td><td>25-270</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>리서치 제품 인터내셔널 코프</td><td>50-488-644</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Gibco (Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Thomas Scientific</td><td>BBI-8541906</td><td></td></tr><tr><td>IGV 2.4</td><td></td><td></td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-500</td><td></td></tr><tr><td>mac2unix</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/cs-cmdtools/files/mac2unix/</td></tr> <tr><td>Q-tips</td><td>Fisher</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 이후 용액</td><td>Invitrogen</td><td>AM7022</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 오염 제거 용액</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>samtools-1.3</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/samtools/files/</td></tr> <tr><td>sratoolkit.2.9.2</td><td></td><td></td><td>https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/Downloads</td></tr><tr><td>SUPERase&middot; RNase 억제제</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-018</td><td></td></tr><tr><td>물(DNASE, RNASE 무료)</td><td>Fisher</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

rna 차세대 염기 서 열 분석 및 생물 정보학 파이프라인은 궤적 특이 수준에서 발현 된 라인-1s를 식별 한다

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

긴 산재 요소-1 (라인/L1s)은 게놈 불안정성 및 돌연변이 유발을 초래 하는 유 전체에 복사 하 고 무작위로 삽입할 수 있는 반복적인 원소입니다. 개별 수준에서 L1 좌 위의 발현 패턴을 이해 하는 것은이 돌연 변이 요소의 생물학에 대 한 이해를 빌려 줄 것입니다. 이 자율 요소는 99%가 잘리고 결함이 있지만 50만 이상의 복사본을 가진 인간 게놈의 상당 부분을 차지 합니다. 그러나, 그들의 풍부 하 고 지배적 인 결함 사본의 수는 다른 유전자의 일부로 서 표현 된 L1 관련 서 열에서 진정으로 표현 된 L1s을 식별 하는 것을 어렵게 만든다. 또한 요소의 반복적인 특성으로 인해 어떤 특정 L1 궤적을 표현 하는지 확인 하는 것도 쉽지 않습니다. 이러한 어려움을 극복 하기 위해, 우리는 궤적 특정 레벨에서 L1 발현을 식별 하는 RNA-서 열 생물 학적 접근법을 제시 한다. 요약 하자면, 우리는 세포질 rna를 모으고, 폴 리아 데 화 전사체를 선택 하 고, 가닥 특이 적 rna-서 열 분석을 활용 하 여 인간 기준 게놈에서 L1 좌 위에 읽기를 고유 하 게 매핑합니다. 우리는 시각적으로 자신의 프로모터에서 전사를 확인 하 고 각 개별 L1 궤적의 mappability에 대 한 계정으로 매핑 된 전사체 읽기를 조정 하는 고유 하 게 매핑된 읽기와 각 L1 궤적을 선별. 이러한 접근법은 소수의 전체 길이 L1 원소 로부터 발현을 검출 하는이 프로토콜이 프로토콜의 능력을 입증 하기 위해 DU145, 전립선 종양 세포 라인에 적용 되었다.

도 1 에 도식 적으로 설명 된 단계 들이 인간 전립선 종양 세포 DU145에 적용 되었다. RNA 샘플은 사이토 플 라이 크를 준비 하 고, 폴 리-선택 된 가닥 특이 적, 쌍 단 프로토콜에서 시퀀싱 된 다음 세대 였다. 보우 타이를 사용 하 여, 페어-엔드 시퀀싱 파일은 다른 게놈 위치와 비교 하 여 쌍 단 판독을 하나의 게놈 위치와 더 잘 일치 시키는 유일한 일치만 허용 하도록 정렬 되었습니다. DU145 sequence 파일은 작성자 요청 시 사용할 수 있는 bam 파일을 만드는 인간 참조 게놈에 정렬 되었습니다. Bedtools을 사용 하 여 전체 길이 L1s에 매핑된 읽기 수에 DU145 가닥으로 분리 된 bam 파일에서 데이터를 추출 했습니다. 이러한 판독은 스프레드 시트에서 가장 큰 것부터 가장 작은 것까지 정렬 되었고 IGV의 각 L1 궤적 주위의 게놈 환경을 검사 하 여 수동으로 선별 하 여 진위를 확인 했습니다 (보조 표 1). 샘플이 진정으로 표현 되도록 선별 된 경우, 그것은 오른쪽 가장 열에 그것의 수용에 대 한 설명과 함께 색상 코드 녹색 이었다. 상기 방법 섹션에 기재 된 지침에 따라 진정으로 표현 되는 L1 좌 위의 예는 도 2a-b에 나타내 었 다. 샘플이 확실 하 게 표현 되는 것으로 거부 된 경우, 가장 오른쪽 열에 거부 이유가 있는 빨간색으로 색으로 구분 되었습니다. L1 좌 위의 예는 방법 섹션에 기재 된 자신의 다음의 가이드라인 이외의 프로모터 로부터의 발현 때문에 거부 된 것은 도 2의c-e 에 상세히 설명 되어 있다.
여기서, 온전한 프로모터 영역이 있는 전장 L1s 연구 되었다. 이러한 구분이 수행 되지 않으면 잘린 L1s에서 시작 되는 전사 노이즈의 큰 소스가 도입 됩니다. DU145에서의 잘린 L1s의 예는 도 3a-b 에 나타나 있으며,이는 RNA-서 열 판독을 고유 하 게 매핑된 것으로 확인 되었다. 그러나 IGV에서는, 그 전사체가 잘린 L1 으로부터 개시 되지 않았지만, 발현 된 유전자 로부터 또는 하류에서 L1 서 열을 포함 하는 것이 명백 하다.
전반적으로 DU145에서, 수동 큐 레이 션 후에 진정한 표현으로 거부 되는 전체 길이 l1 좌 위 및 읽기의 비율은 약 50%입니다 (보충 표 2) l1 매핑된 전사체 판독의 높은 수준을 시연 그렇지 않으면 수동 큐 레이 션 없이 거짓 긍정으로 기록 됩니다. 구체적으로, DU145에는 총 3152 읽기의 감지 방향으로 고유 하 게 매핑 된 판독을 갖는 전체 전장 L1 좌 위 114이 있었지만, 60 좌 위는 1879 판독으로 수동 큐 레이 션 후에 자신의 프로모터를 발현 하는 것으로 확인 되었다 ( 보조 표 1). 이는 세포질 mRNA를 선택 함으로써 L1 생물학과 무관 한 발현을 감소 시키기 위해 걸음 수를 취한 경우에도 마찬가지 이다. DU145에서 가장 높은 수준의 매핑된 전사체가 있는 궤적은 진정한 L1을 표현 하지 않았기 때문에 거부 되었습니다 (그림 4). 전반적으로 특정 l1 좌 위에 대 한 매핑된 전사체의 수는 수동 큐 레이 션 후에 진정으로 표현 된 대로 허용 되 고 거절 된 l1 좌 위 사이에서 유사 하 게 범위 (도 4).
수동 큐 레이 션 후에 고유 하 게 매핑하는 읽기의 수는 175에서 DU145 범위에서 특정 L1 좌 위를 표현 하 여 10 번의 읽기에서 임의로 선택 된 최소 컷오프를 읽습니다 (그림 5). L1s에 고유 하 게 매핑된 전사체 판독을 식별 하는 이러한 접근법은 발현을 정확 하 게 정량화 하는 능력을 제한 한다. 이를 고려 하기 위해, 각 궤적의 mappability에 따라 수정 계수가 만들어졌습니다. 이 수정 계수를 만들기 위해, 첫 번째 bedtools은 모든 전체 길이 L1 좌 위에 정렬 하 고 가장 낮은 매핑 된 전사체 읽기 (보조 )에서 그 좌 위에 맞춰진 헬 라는 게놈 bam 파일에서 고유 하 게 매핑된 읽기의 수를 추출 하는 데 사용 되었다 그림 1). 그것은 임의로 지정 되었다 400와 L1s 전체 커버리지 mappability 했다. 글 라이 게놈 시퀀싱 샘플에서 l1 궤적에 맵핑 할 수 있는 판독의 수는 400 읽기에 상대적으로 스케일링 되었고, 그 스케일링 된 숫자는 각각에 매핑된 읽기의 수에 곱 게 DU145의 l1 좌 위를 표현 하였다 (보조 표 2) . 예상 대로, mappability에 대 한 더 큰 수정 점수를 가진 L1 요소는 L1PA2 같은 젊은 하위 가족에서 왔다 (보충 표 2). 일단 각 궤적에서의 mappability 점수에 대 한 판독을 조정 하였으며, 대부분의 좌 위에 대 한 발현에 대 한 정량은 증가 하였다 (도 6). 고유 하 게 매핑되는 읽기의 수는 DU145의 mappability 교정으로 특정 L1 좌 위를 표현 했다 612에서 4 읽기 및 가장 낮은 표현 좌 위의 재정렬이 있었다 (그림 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig01v2.jpg"> 그림 1: 워크플로우 회로도 인간 샘플에서 발현 된 L1s를 식별 하는 단계는 그래픽으로 설명 된다. 적절 한 파일을 이미 사용할 수 있는 경우 1과 2 단계를 반복할 필요가 없습니다. 이러한 적절 한 파일은 보충 파일 1a-b 및 보충 파일 2에서 다운로드할 수 있습니다. 빨간색 상자는 동일한 감지 방향으로 L1s에 매핑하는 읽기 수를 계산 하기 위해 bedtools 커버리지 프로그램을 사용 하는 단계를 나타냅니다. 센스 지향 매핑 읽기와 이러한 좌 위 수동으로 큐레이터 해야 하는 L1s입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig02v2.jpg"> 그림 2: DU145에서 큐 레이 팅 된 L1 좌 위의 예 IGV에 로드 된 참조 게놈은 레퍼런스 게놈 버전 (보충 파일 1)과 일치 하는 전체 길이 L1 gff 어노테이션 파일, DU145 bam 파일, 그리고 마지막으로 모든 저자에 게 사용 가능한 mappability를 평가 하는 게놈 라 헬 라 bam 파일입니다. 요청. 주석이 달린 L1의 방향을 시각화 하는 데 도움이 되도록 화살표가 추가 되었습니다. 빨간색 화살표와 읽기는 오른쪽에서 왼쪽으로 순서 대로 방향이 조정 됩니다. 화살표와 파란색의 읽기는 왼쪽에서 오른쪽으로 순서 대로 방향이 조정 됩니다. a) igv에서,이 l1 궤적은 5 kb를 초과 하는 센스 방향으로 l1의 상류가 판독 되지 않기 때문에 자체 프로모터를 발현 하는 것으로 보인다. 이 L1은 낮은 mappability를 가지 며, 유전자에는 없고, 예상 되는 안티 센스 프로모터 활성 (26)의 증거를 가진다. b) igv에서,이 l1 로커 스는 5kb 이상의 센스 방향으로 l1의 상류가 판독 되지 않기 때문에 자체 프로모터를 발현 하는 것으로 보인다. 이 L1은 낮은 mappability과 반대 방향의 유전자 내에 있다. c) igv에서,이 l1 궤적은 5kb 내에서 동일한 방향으로 업스트림 읽기가 존재 함에 따라 표현 된 l1으로 서 거부 되었다. 이 L1은 동일한 방향의 유전자 내에 있기 때문에 전사체의 판독은 발현 된 유전자의 프로모터 로부터 유래 되는 것이 가장 가능성이 있다. d) igv에서,이 l1 궤적은 5kb 내에서 동일한 방향으로 업스트림 읽기가 존재 함에 따라 표현 된 l1으로 서 거부 되었다. 이 L1은 동일한 방향으로 고도로 발현 된 유전자의 하류에 있어서, 전사체 판독은 가장 가능성이 발현 된 유전자의 프로모터 로부터 유래 하 고 정상적인 유전자 종결자를 넘어서 연장 된다. e) igv에서,이 l1 궤적은 5kb 내에서 동일한 방향으로 업스트림 읽기가 존재 함에 따라 표현 된 l1으로 서 거부 되었다. 이 L1은 참조 유전자 내의 주석이 달린 유전자 내에 있거나 그 근처에 있지 않기 때문에 L1 요소의 이러한 전사체 내 및 업스트림의 기원은 주석이 없는 프로모터를 제안 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig03v2.jpg"> 그림 3: 배경 소음은 잘린 L1s 발생 합니다. L1 주석은 배경 소음의 주요 원인으로 잘린 L1s 포함 되지 않습니다. 주석이 달린 L1의 방향을 시각화 하는 데 도움이 되도록 화살표가 추가 되었습니다. 화살표와 파란색의 읽기는 왼쪽에서 오른쪽으로 순서 대로 방향이 조정 됩니다. a) 입증은 2706 BPS 인 L1MB5 sufamily에서 잘린 L1의 예입니다. IGV에서 읽기는 발현 된 유전자의 하류 확장에서 기인 한다는 것이 명백 하다. b)는 잘린 L1의 또 다른 예를 나타낸다. 이 L1은 4767 bp 길이의 L1PA11입니다. IGV에서는 l1을 고유 하 게 매핑하는 것은 l1이 내에 있는 표현 된 엑손에서 시작 된다는 것이 명백 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig04v2.jpg"> 그림 4: DU145 전립선 종양 세포 대사에서 발현 되는 인간 게놈에서 온전한 전체 길이 그대로 L1s에 고유 하 게 매핑되는 전사체 판독. 블랙에서 특정 좌 위는 진정으로 수동 큐 레이 션 후에 표현 되 고 적색으로는 구체적인 좌 위는 수동 큐 레이 션 후에 진정으로 표현 된 판독으로 거부 되는 것으로 확인 되어야 한다. 회색은 각각에 매핑 10 개 미만의 읽기와 좌 위입니다. 이러한 좌 위는 자막 읽기의 작은 부분을 나타내므로 수동으로 선별 되지 않았습니다. X 축 눈금 표시는 모든 100 전체 길이, 손상 되지 않은 L1s 나타냅니다. 약 4500 좌 위는 매핑 읽기가 0 인 것 처럼 그래픽으로 표시 되지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig05v2.jpg"> 그림 5: DU145 전립선 종양 세포 대사에서 진정으로 전체 길이의 온전한 L1s을 표현 하는 것을 유일 하 게 매핑하는 전사체 읽기. 표시는 수동 큐 레이 션 후 DU145 세포에서 특정 좌 위에 매핑하는 전사체 판독의 숫자입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig06v2.jpg"> 그림 6: 맵 읽기에 의해 조정 될 때, 확실 하 게 L1을 표현 하는 매핑. DU145 셀에서 L1 좌 위를 수동으로 선별 하는 데 매핑되는 좌 위 별 mappability 점수로 조정 된 성적표 수입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1: 방향에 따라 온전한 인간 L1s 전체 길이에 대 한 주석. a) FL-L1-BLAST_RM_minus. b) FL-L1-BLAST_RM_plus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: 섹션 4에 자세히 설명 된 생물 정보학 파이프라인을 자동화 하는 데 사용 되는 슈퍼 컴퓨터 스크립트입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile_2.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 그림 1: L1 mappability를 결정 하는 데 사용 되는 게놈 DNA 샘플. 표시 되는 것은 게놈에서 모든 5000 전장 L1 좌 위에 고유 하 게 매핑되는 헬 라 세포 라인 시료 로부터 게놈 전사체 판독의 수 이다. 400는 L1에 지도를 읽을 때 L1은 전체 커버리지 mappability을가지고 지정 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFigure_1.pdf" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
추가 표 1: DU145에서 L1s의 수동 큐 레이 션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 표 2: mappability 조정을 DU145에서 선별 된 L1s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기에서, 우리는 궤적 특정 수준에서 라인 1 발현을 식별 하기 위해 생물 학적 접근법 및 분석을 제시 한다.

RNA 차세대 염기 서 열 분석 및 생물 정보학 파이프라인은 궤적 특이 수준에서 발현 된 라인-1s를 식별 한다

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

모바일 요소는 인간의 유전 불안정의 주요 소스 중 하나입니다. 다른 조직 및 조건에서 그들의 표현을 이해하는 것은 게놈에 그들의 충격을 이해하는 것이 중요합니다. L1 성적증명서의 광대 한 L1 수명 주기에 아무 런이 없는 다른 성적 증명서에 L1 관련 시퀀스를 수동적으로 포함 의 결과.우리의 접근 방식은 이 관련이 없는 배경을 제거합니다. 이 프로토콜은 어떤 모바일 요소의 연구 결과, 또는 어떤 순서 게놈에 있는 바이러스에 적응될 수 있습니다. loci 간의 차별을 허용하려면 적어도 일부 시퀀스 변형이 필요합니다.이 방법의 시각적 데모는 궤적 별 수준에서 표현된 L1 반복 적 요소를 자신있게 식별하는 데 필요한 끈성과 주의를 보여주는 데 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포질 RNA 추출 및 차세대 시퀀싱으로 이 절차를 시작합니다. 세포질 RNA를 선택함으로써, 핵에서 발현 성 내 mRNA 내에서 발견되는 L1 관련 판독은 현저히 고갈된다.시퀀싱 라이브러리 준비에서 L1s와 관련이 없는 전사 소음을 줄이기 위해 취한 또 다른 단계는 폴리아데니졸트 성적증명서의 선택을 포함한다. 이것은 비 mRNA 종에서 찾아낸 L1 관련 성적증명서 소음을 제거합니다. 리눅스 단말에서 명령줄을 입력하여 bowtie1을 사용하여 관심의 RNA seq 샘플과 정렬 패러다임을 시퀀싱 FASTQ 파일을 실행합니다.이 정렬 전략은 성적 증명서가 고유하고 철저한 게놈 검색과 일치하도록 요구합니다. 이 전략은 하나의 L1 궤적에 대해 특히 읽기 매핑을 호출하는 데 대한 확신을 제공합니다. 스트랜드는 SAMtools 및 Linux 명령을 사용하여 출력 BAM 파일을 분리하여 상단 가닥과 하단 가닥을 선택합니다.표준 차세대 시퀀싱 프로토콜을 사용하지 않는 경우 실제 플래그 값이 다를 수 있습니다. 이 가닥 분리 단계는 잠재적인 안티센스 L1 관련 매핑된 읽기를 제거하여 L1 소급처리와 관련이 없는 L1 시퀀스 내에서 생성된 전사 노이즈를 필터링하는 데 효과적입니다. 침구를 사용하여 L1 loci에 대한 주석에 대한 읽기 카운트를 생성합니다.먼저 명령줄을 입력하여 맨 위 가닥의 센스 방향으로 L1에 대한 읽기 수를 생성한 다음 명령줄을 입력하여 하단 가닥의 센스 방향으로 L1에 대한 읽기 수를 생성합니다. L1을 식별하는 데 사용되는 주석은 잘린 L1에서 발생하는 배경 잡음을 제거하기 위해 작동하는 기능성 프로모터 영역으로 전체 길이 L1을 나타냅니다.생성된 읽기 카운트 텍스트 파일을 복사하여 하단 가닥에 대해 만든 텍스트 파일을 복사하여 페이지를 minus_bottom 레이블을 지정합니다. 열 J.Copy에서 가장 낮은 읽기 수에 따라 상위 가닥에 대해 생성된 읽기 수 텍스트 파일을 정렬합니다. 열 J.에 있는 가장 낮은 읽기 수에 따라 모든 열을 정렬하고 페이지를 top_plus 레이블을 지정합니다.결합된 것으로 표시된 세 번째 페이지를 만들고 minus_bottom 페이지와 plus_top 페이지에서 10개 이상의 읽기로 모든 loci를 추가합니다. 열에서 발견되는 가장 낮은 수의 읽기수를 기준으로 모든 열을 정렬 J.To하여 특히 L1 loci 또는 그 근처에서 전체 게놈 페어링 및 시퀀싱 파일을 NCBI에서 다운로드하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 FASTQ 파일로 변환했습니다. 이제 BAM 파일을 색인하여 파일을 로드하기 전에 IGV를 축약한 통합 유전체학 뷰어에서 볼 수 있도록 합니다.IGV에서 인가 유전자를 시각화하기 위해 관심의 기준 게놈을 로드한다. 또한 전체 길이 L1 요소에 대한 음권 파일을 로드하여 인간 RNA 발현을 위한 BAM 파일인 L1 음표를 시각화하여, 유전체 영역의 절단성을 평가하기 위한 관심 샘플 및 BAM 파일로부터 매핑된 성적증명서를 시각화한다. 각 BAM 파일과 연결된 적용 범위 및 접합 행을 제거합니다.인간의 RNA 발현과 인간 게놈 mappability를 위해 BAM 파일을 압축하여 모든 IGV 트랙이 한 화면에 맞도록 합니다. L1 소급과관련이 없는 L1 서열의 전사 소음을 제거하는 마지막 중요한 단계는 RNA를 매핑한 것으로 확인된 전체 길이 L1s의 수동 생성이다. 수동 큐레이션은 발현이 L1 프로모터로부터 유래함을 확인하기 위해 주변 게놈 환경의 맥락에서 각 발현 L1 궤적의 시각화를 포함한다.스프레드시트 결합 페이지에 나열된 L1 loci의 좌표를 사용하여 IGV에서 주변 유전체 환경을 검사하여 각 L1 궤적을 고유하게 매핑한 성적증명서로 수동으로 큐레이터합니다. L1 방향으로 최대 5킬로베이스까지 상류에 판독이 없는 경우 궤적을 직접 표현하도록 큐레이트합니다. 녹색으로 녹색으로 표시하고 왜 그것이 진정으로 표현 된 L1인지 주목하십시오. L1의 상류 영역이 절충할 수 없는 경우 이 규칙에 대한 예외가 존재합니다.이 경우 행을 빨간색으로 레이블을 지정하고 L1 프로모터의 영역 상류의 표현을 평가할 수 없으므로 L1의 식을 자신있게 결정할 수 없습니다. 최대 5킬로베이스까지 상류로 읽히면 궤적을 진정으로 표현하지 않도록 큐레이트하십시오. 빨간색으로 빨간색으로 레이블을 지정하고 인증된 L1이 아닌 이유를 표시합니다. L1의 상류를 읽는 것과 같은 방향으로 표현유전자의 하류인경우, 또는 L1의 상류를 읽는 것과 같은 방향으로 표현유전자의 하류인 경우, 또는 L1의 상류를 읽는 무분별한 발현 패턴을 위해 궤적을 거짓으로 큐레이한다. 이 규칙의 예외는 L1 프로모터 시작 사이트를 직접 겹치는 최소 읽기가 있지만 L1의 약간 상류에 있을 때 적용됩니다. 이와 같은 L1 케이스의 상류에 다른 읽기가 없는 경우 이 L1을 진정으로 표현해야 합니다.행을 녹색으로 표시하고 인증된 L1인 이유를 표시합니다. 매핑된 읽기 패턴이 특정 L1의 절전 기능 영역과 상관관계가 없는 경우 L1 궤적을 잘못 처리합니다. L1이 매우 절박하지만 L1 내의 응축 된 영역에서 읽기 더미만 있는 경우 자체 프로모터에서 L1 발현과 관련이 있을 가능성이 적으며 exons 또는 LtR과 같은 별표가 없는 소스에서 파생될 가능성이 높습니다. 이와 같은 경우, 로시를 주황색으로 큐레이트하고 궤적이 의심되는 이유를 유의하십시오.UCSC 게놈 브라우저에서 L1 위치를 확인 하여 의심스러운 더미의 소스를 확인 합니다. 산발적으로 발현되지 않은 영역의 게놈 환경 내에 있는 경우, 궤적을 진정으로 표현하지 않도록 큐레이트한다. 읽기는 L1의 상류10킬로베이스를 나타낼 수 있다. 그러나 매 10 킬로베이스 정도, 매핑 된 읽기가 있고 그 중 일부는 L1과 일치합니다. 이 L1s는 유전체 식의 명목 패턴으로 인해 읽기를 매핑했을 가능성이 높습니다.이와 같은 경우 로시를 빨간색으로 큐레이트하고 궤적이 의심스러운 이유를 유의하십시오. 각 L1 loci의 절단성을 지원하기 위해 침구 프로그램, FL-L1 음장 및 정렬된 게놈 서열 데이터를 사용하여 L1 loci에 고유하게 매핑된 판독횟수를 결정합니다. 400개의 고유한 읽기가 정렬될 때 L1 궤적을 전체 커버리지 mappability로 지정합니다.각 개별 L1에 대해 400으로 정렬된 유전체 DNA를 확장하거나 축소하는 데 필요한 요인을 결정합니다. 개별 L1 궤적 절름발이에 따라 발현의 척도를 갖기 위하여, RNA 전사체의 수에 의해 계수를 곱하여 개별적으로 발현된 L1s 개별에 정렬한다. 각 단계는 자체 프로모터에서 표현된 L1 요소와 L1 요소가 L1 수명 주기와 관련이 없는 다른 성적증명서에 포함될 수 있는 모든 방법 간의 차이를 강조하는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 성적증명서는 DU145 전립선 종양 세포주에서 발현된 인간 게놈의 모든 전체 길이 에 만전된 L1s에 고유하게 맵을 읽는다.검은색은 수동 큐레이션 후 정식으로 표현된 것으로 확인된 특정 loci입니다. 그리고 빨간색으로 는 수동 큐레이션 후 본격적으로 표현 된 읽기로 거부 된 특정 loci입니다. 회색으로 는 각각 10 개 미만의 읽기 매핑이있는 loci입니다.이 loci는 성적 증명서 읽기의 작은 부분을 나타내기 때문에 수동으로 선별되지 않았습니다. 약 4,500개의 로시가 그래픽으로 표시되지 않으며 매핑된 읽기가 0개나 많았습니다. 수동 큐레이션 후 DU145에서 특정 L1 로시를 진정으로 표현하기 위해 고유하게 매핑되는 읽기 수는 175읽기에서 임의로 선택된 최소 10개 읽기에 이르기까지 다양합니다.읽기가 각 궤적에서 절름발이 점수로 조정되면 대부분의 loci에 대한 표현수량이 증가했습니다. DU145에서 절름발이 보정기능이 있는 특정 L1 loci를 진정으로 표현하기 위해 고유하게 매핑된 읽기 수는 612에서 4개의 읽기까지 다양하며 가장 높은 표현loci로 재정렬되었습니다. 각 단계는 높은 수준의 전사 배경 소음을 줄이는 데 중요한 역할을 합니다.그러나 가장 중요한 단계는 각 L1 궤적의 수동 큐레이션으로 자체 프로모터의 전사를 확인하는 것입니다. DU145 세포에서 생체정보학적으로 확인된 L1 loci의 약 50%는 다른 전사 소스에서 유래하는 L1 배경 잡음으로 거부되었으며 신뢰할 수 있는 결과를 생성하는 데 필요한 엄격함을 강조했습니다. L1s의 막내를 식별하기 위해, 우리는 더 긴 읽기를 활용하고 더 독특한 매핑을 허용하는 PacBio와 같은 L1 성적 증명서의 다섯 프라임 레이스 선택 및 시퀀싱 기술을 사용하는 것이 좋습니다.이 방법을 통해 L1 식 패턴을 엄격하고 확실하게 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이것은 개별 L1 loci의 규제와 잠재적인 충격을 더 잘 이해하는 쪽으로 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

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배우세요 RNA-Seq 및 생물정보학 파이프라인을 사용하여 DU145 전립선 종양 세포주에서 좌위 특이적 LINE-1 발현을 식별하는 방법을 배우세요. 이 엄격한 프로토콜은 배경 소음을 제거하고 정확한 정량화를 가능하게 합니다.

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