Name: 안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 배우세요 인간 면역 체계와 장내 미생물군유전체를 동시에 갖는 이중 인간화 BLT 마우스를 만드는 방법을. 이 모델은 면역학과 미생물군유전체 연구에 활용됩니다.

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BLT 인간화된 마우스 를 생성하는 데 도움을 준 얀민 완, 강구빈, 팔라비 쿤두에게 감사드립니다. 우리는 기능 유전체학 NE-INBRE P20-INBRE P203427-14, 신경 감각 시스템 CoBRE 의 분자 생물학, 프레드 & 파멜라에서 네브래스카 연구 네트워크에서 부분지원을받는 UNMC 유전체학 핵심 시설을 인정하고 싶습니다 버핏 암 센터 - P30CA036727, 뿌리와 뿌리 줄기 혁신 센터 (CRRI) 36-5150-2085-20, 네브래스카 연구 이니셔티브. 우리는 네브래스카 대학 - 링컨 생명 과학 별관과 그들의 도움을 주셔서 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) 교부금 R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 신경 에이즈 (CHAIN) 센터에서 만성 HIV 감염 및 노화에 의해 부분적으로 지원됩니다, 1R01AI111862 Q Li.  기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 원고 준비 또는 출판 결정에 아무런 역할을하지 않았습니다.

여기에 설명된 모든 방법은 네브래스카 링컨 대학(UNL)의 기관 동물 관리 및 연구 위원회(IACUC)승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. UNL의 IACUC는 이중 후 마우스를 포함하여 hu-BLT 마우스를 생성하고 사용하는 두 가지 프로토콜을 승인했습니다. 또한 UNL의 과학 연구 감독 위원회(SROC)는 인간 적인 쥐 연구를 위한 고급 생명 과학 자원에서 조달되는 인간 배아 줄기 세포 및 태아 조직의 사용을 승인했습니다(SROC# 2016-1-002).
1. 마우스 하우징 및 유지 보수
<ol><li>구입 6-8 주 오래 된 NSG 마우스 (NOD. Cg-Prkdc는Il2rgtm1Wjl/SzJ)를 scid.</li>
	<li>온도, 습도 및 압력이 조절된 실내에 공기 교환, 프리필터 및 HEPA 필터(0.22 μm)를 적용하여 SPF 조건하에서 마우스를 보관하십시오.<ol>
<li>마우스를 사전 필터 및 HEPA 필터(0.22 μm)로 공기 교환을 관리할 수 있는 랙 시스템에서 오토클레이브된 개별 마이크로이솔레이터 케이지에 보관하고 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>70% 에탄올로 전처리된 Class II 타입 A2 생물학적 안전성 연기 후드에서 마우스의 모든 절차 및 조작을 수행합니다. 동물방에서 일하기 전에 샤워를 하고 깨끗한 스크럽, 타이벡 슈트, 부츠 커버, 헤어 캡, 페이스 마스크, 장갑으로 바꿔보라고 합니다. 수술 시 tyvek 정장 위에 수술 가운을 착용하십시오. 참고: 자외선(UV) 빛 오염 제거도 절차 전에 선호됩니다.<ol>
<li>가능하면 모든 기기와 시약을 오토클레이브한 다음 연기 후드로 옮기기 전에 소독하십시오.</li>
		<li>시술 중에 동물의 개별 통풍 케이지를 랙에서 제거하고 연기 후드로 옮기기 전에 소독하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쥐에게 조사된 식단을 공급하고 오토클레이브 수를 제공합니다. 조사된 음식 ab libitum을 제공하고 필요에 따라 추가 조사 된 음식과 보충. 매주 또는 필요에 따라 오토클레이브 워터를 변경하십시오. 참고: 오토클레이브 산성수도 사용할 수 있습니다. 제공된 조사된 규정식은 제조 후에 6 달의 유효 기간을 가졌습니다.</li>
</ol>2. 인간화 된 BLT 마우스의 생성
참고: 후-BLT 마우스의 생성은 이전에22,23,24를기재하였다.
<ol><li>수술 당일, 마우스에게 체중의 12 cGy/g의 용량으로 전신 조사를 하십시오.</li>
	<li>수술을 위해 마우스를 준비합니다.<ol>
<li>각 조사된 마우스에 마취를 위한 자궁내(IP) 주사에 의한 체중을 기준으로 마우스 당 130-170 μL의 농도로 100 mg/kg과 자일라진의 작동 농도에서 케타민을 혼합합니다. 케타민과 자일라진 혼합물 3 ml를 준비하려면 100 mg/mL의 재고 농도에서 케타민 0.27 mL, 자일라진 의 0.03 mL를 100 mg/mL에서 멸균 식염수 2.7 mL로 넣고 잘 섞습니다. 주입 전에 70 % 이소 프로판놀로 피부를 소독하십시오.</li>
		<li>각 조사 된 마우스 Buprenorphine을 제공 1 몸 무게의 mg/kg (반 라이브 72 시간, SR-LAB) 피하 주사에 의해 오래 지속 통증 관리.</li>
		<li>수술 전 항생제 예방을 위한 IP 주사에 의해 세파졸린의 각 조사된 마우스 100 μL(858 μg)을 준다.</li>
		<li>왼쪽 신장을 노출하는 데 사용되는 후기 수술 부위에서 마우스의 왼쪽 측면 및 내측 주위의 전기 헤어 클리퍼를 사용하여 마우스의 모발을 면도합니다.</li>
		<li>페달 반사 (단단한 발가락 핀치)로 적절한 수준의 마취를 확인하십시오.</li>
		<li>수술 중 언제든지 추가 마취가 필요한 경우 isoflurane 가스를 3-5 %로 하십시오.</li>
		<li>각막 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 적용하십시오. 필요한 경우 귀 태그를 바하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>왼쪽 신장 캡슐에 간과 흉선 조직을 이식하는 수술을 수행합니다.<ol>
<li>수술 부위의 중앙에서 시작하여 원형방식으로 바깥쪽으로 이동하여 수술 부위의 피부를 소독합니다. 이 과정을 70% 이소프로판올과 요오드로 세 번째로 반복하십시오.</li>
		<li>집게를 사용하여 먼저 인간 태아 간 조직 단편 을 트로카에 로드하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 한 인간의 태아 흉선 조직 조각을 트로카에 로드하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 다른 인간 태아 간 조직 단편을 트로카에 로드하십시오. 티슈는 트로카의 내부 치수에 맞게 1-1.6 mm3으로 절단해야합니다.</li>
		<li>포셉을 사용하여 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 세로로 작은 컷을 만듭니다. 마우스 왼쪽에서 1.5-2cm로 잘라냅니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 근육 층을 들어 올리고 가위를 사용하여 세로로 작은 컷을 만듭니다. 신장을 노출하기 위해 필요에 따라 절단을 확장합니다.</li>
		<li>신장을 둘러싼 지방 조직을 부드럽게 파악하여 신장을 노출시다. 신장 자렌치마를 직접 만지지 마십시오.</li>
		<li>메스를 사용하여 신장 캡슐의 후방 끝에서 1-2mm 절개를 합니다.</li>
		<li>천천히 신장의 긴 축에 평행 절개를 통해 미리로드 된 트로카를 삽입하고 신장 캡슐과 신장 사이의 조직을 해제.</li>
		<li>신장과 창자를 정상 위치로 조심스럽게 되돌려 놓습니다. 흡수성 5/0 P-3(P-13) 봉합사를 13mm 3/8 원 바늘로 사용하여 근육 층과 수술용 스테이플을 닫아 피부를 닫습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술 후, 회복을 위해 깨끗한 오토클레이브 마이크로이솔레이터 케이지에 마우스를 넣습니다.<ol>
<li>수술 후 회복 중 열 손실을 최소화하려면 물을 따뜻하게 하고 순환시키는 워터 펌프에 연결된 가열 패드에 마우스가 들어있는 케이지를 놓습니다.</li>
		<li>그들은 흉골 recumncy를 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 모니터링.</li>
	</ol></li>
	<li>수술 완료 후 6 시간 이내에 꼬리 정맥을 통해 인간 태아 간 조직에서 분리 된 CD34 + 조혈 줄기 세포를 주입하십시오.<ol>
<li>열 램프로 마우스를 따뜻하게합니다. 꼬리를 70 % 이소 프로판놀로 소독 한 다음 꼬리 정맥에 1.5 ~ 5 × 105 줄기 세포 / 200 μL을 주입하십시오.</li>
		<li>주사로 인한 출혈을 막고 마우스를 마이크로이솔레이터 케이지와 마이크로이솔레이터 케이지로 케이지 랙으로 되돌릴 수 있습니다. 참고: 수술 후 마우스는 일반적으로 함께 보관, 마이크로 이졸레이터 케이지 당 5, 동안 과 복구 후. 그러나, 마우스는 모두 같은 날에 수술을 받은 경우에만 함께 보관됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>매일 마우스를 확인합니다. 조심스럽게 수술 스테이플을 모니터링하고 필요에 따라 교체하십시오. 마우스에 감염이나 불편함의 징후가 있는지 면밀히 모니터링하십시오. 수술 후 며칠 동안 마이크로이솔레이터 케이지 바닥에 오토클레이브 식품을 공급합니다.</li>
	<li>수술 후 7-10 일 수술 스테이플을 제거하십시오. 마우스를 마취시키기 위해 이소플루란 가스를 3-5%로 줍니다. 조심스럽게 스테이플을 제거한 다음 항생제와 통증 완화 연고를 부위에 바르습니다.</li>
	<li>인간 면역 세포의 재구성을 위해 9-12 주를 허용한 다음, 인간화 된 각 마우스로부터 내측 사페누성 정맥으로부터 말초 혈액을 수집합니다.<ol>
<li>호흡을 위해 마우스 의 머리 근처의 개구부와 한쪽 다리를 격리하기 위해 마우스 뒤쪽 근처의 개구부로 적절한 크기의 플라스틱 콘 구속을 사용하여 의식이 있는 마우스를 억제합니다. 마우스를 먼저 구속 콘 헤드에 넣고 다리 개구부를 통해 한쪽 다리를 부드럽게 당깁니다.</li>
		<li>고립 된 다리의 내측을 70 % 이소 프로판올로 스프레이 한 다음 항생제와 통증 완화 연고를 동일한 부위에 퍼뜨리고. 참고 : 연고는 제모할 필요없이 정맥의 위치를 밝히는 데 도움이되며 혈액 방울 형성을 돕습니다.</li>
		<li>90° 각도에서 25 게이지 바늘을 사용하여 정맥을 뚫고 EDTA 코팅 혈액 수집 튜브를 사용하여 50-100 μL의 혈액을 수집합니다. 멸균 거즈로 부위에 압력을 가하여 출혈을 멈춥시다. 출혈이 멈추면 마우스를 케이지로 되돌려 놓습니다. 참고: 수집된 최대 혈액 량은 일반적으로 주당 50 μL 또는 2주마다 100 μL입니다.</li>
		<li>수집된 말초 혈액을 사용하여 hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19에 대한 항체를 이용한 유세포측정을 사용하여 인간 면역 세포 재구성수준을 시험한다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 항생제 치료
<ol><li>항생제 치료 전에 전처리 배설물 샘플을 수집합니다. 마우스를 새로운 오토클레이브 마이크로이솔레이터 케이지로 이동합니다.</li>
	<li>매일 광범위한 항생제의 신선한 칵테일을 준비하십시오.<ol>
<li>생쥐의 각 마이크로이졸레이터 케이지에 갓 준비된 메트로니다졸(1 g/L), 네오마이신(1 g/L), 반코마이신(0.5 g/L), 암피실린(1 g/L)을 함유한 250 mL의 물을 준비합니다. 참고: 항생제 보충 식수에는 오토클레이브 또는 멸균 수를 사용하십시오.</li>
		<li>9.2 g의 포도 설탕 가당 음료 믹스를 항생제 보충 물 250 mL에 넣습니다. 참고 : 포도 설탕 가당 음료 믹스 믹스의 사용은 항생제의 쓴 맛을 마스크하고 쥐의 탈수를 방지하는 데 도움이됩니다.</li>
		<li>항생제와 포도 설탕 가당 음료 믹스 보충 물을 변경 하 고 매일 새로운 오토 클레이 브 케이지에 마우스를 배치. 참고: 마우스는 coprophagic 이며 매일 케이지를 변경 하면 창 자 박테리아와 함께 자신을 다시 접종에서 마우스를 방지 합니다.</li>
		<li>인간과 같은 장내 미생물군유전체의 최대 생착을 위해 14일 동안 항생제를 제공하십시오. 항생제 치료 하는 동안, 체중 감소와 탈수에 대 한 마우스를 모니터링. 체중 감소는 치료 기간 동안 그 후 처음 3-4 일 및 고원 동안 예상된다. 탈수증이 발생하면 복강 내 주사를 통해 마우스 식염수 또는 링거 용액을 제공합니다. 참고: 다른 창 자 미생물 인간화 프로토콜 항생제의 구두 인식에 대 한 호출. murine 창 자 박테리아를 고갈에 효과적, 우리는 식수에 항생제를 추가 하는 덜 침략적인 방법은 우리의 인간화 된 쥐에 덜 스트레스를 넣어 하 고 더 나은 결과 주도 발견.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 기증자 샘플 및 대변 이식
<ol><li>인간 기증자 배설물 샘플을 준비합니다.<ol>
<li>대변 이식으로 인간화 된 마우스로 배설물 이식에 대 한 배설물 microbiota 이식 (FMT) 물질의 적절 하 게 준비 된 소스를 사용 합니다.</li>
		<li>FMT 제제를 해동시키고 혐기성 챔버에서 혐기성 조건하에서 이를 알리쿼트한다.</li>
		<li>원하는 경우, 이 단계에서 배설물 샘플의 동일한 부분을 함께 혼합하여 편견없는 "인간"샘플을 만듭니다.</li>
		<li>FMT 재료의 동결 및 해동을 최소한으로 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간 배설물 이식<ol>
<li>14일 항생제 치료를 마친 후 식수를 오토클레이브 수로 바꾸고 마우스를 새로운 오토클레이브 케이지로 옮니다. 매일 케이지 변경을 중지하고 일정변경 일람을 1-2주에 한 번씩 실행합니다.</li>
		<li>항생제의 24 및 48 시간 포스트 중단에 2개의 배설물 이식을 줍니다.</li>
		<li>항생제 치료 후 24시간, FMT 물질의 필요한 양을 해동하고, 각 마우스에게 경구 위축을 통해 FMT 물질의 200 μL을 준다. 48 시간 포스트 항생제에서 다시 절차를 반복하십시오.</li>
		<li>남은 또는 남은 해동된 FMT 물질을 인간화된 마우스의 털 에 또는 케이지 침구에 퍼뜨리게 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 신선한 배설물 샘플 수집
<ol><li>연기 후드로 옮기기 전에 개별 종이 봉투를 오토클레이브하십시오.</li>
	<li>연기 후드에, 각 개별 종이 가방에 하나의 마우스를 넣고 마우스가 배변 할 수 있도록.</li>
	<li>멸균 집게를 사용하여 배설물 샘플을 1.5 mL 플라스틱 튜브로 수집하고 -80 °C에서 동결하십시오. 마우스를 마이크로졸레이터 케이지로 되돌리. 참고 : 대변 샘플을 수집하는이 방법은 어떤 스트레스 유도 조작없이 개별 마우스에서 신선한 배설물 샘플 수집을 할 수 있습니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

여기에 설명된 프로토콜은 기능성 인간 면역 계통과 안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체를 특징으로 하는 이중 hu-BLT 마우스의 생성을 위한 것입니다. 이 프로토콜은 GF 동물 및 그놈학적 시설에 대한 필요 없이 다른 인간화 또는 비인간화 마우스 모델에 적응될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 비교적 간단하지만 이중 hu-BLT 마우스의 성공적인 생성에 중요한 몇 가지 중요한 세부 사항이 있습니다. NSG 마우스는 극단적으로 면역결핍및 감염을 방지하는 것은 마우스의 장기 생존에 열쇠입니다. 우리는 감염을 방지하기 위해 다음과 같은 조치를 취했습니다. 첫째, 동물은 전용 제품군에서 공기 환율 관리가 있는 랙 시스템에 HEPA 필터(0.22 μm)가 있는 개별 마이크로이솔레이터 케이지에 보관되었습니다. 랙용 에어 핸들러에는 HEPA 여과(0.22 μm) 공급 및 배기 공기와 함께 사전 필터가 포함되어 있으며 케이지 배기 공기 온도 및 상대 습도에 대한 실시간 온라인 모니터링이 포함되어 있습니다. 둘째, 동물방에 들어간 모든 사람들...

인간화된 마우스(hu-mice)는 조혈, 면역, 암, 자가면역질환, 전염병 1,2,3, 4를 포함한 인간 건강과 질병의 여러 측면에 대한 연구를 변화시켰습니다. ,5,6,7,8,9. 이러한 후 마우스는 기능적인 인간 면역 계통을 가지고 있고 인간 특정 병원체에 감염될 수 있다는 점에서 다른 마우스 모델에 비해 뚜렷한 이점이 있다. 그럼에도 불구하고, 장내 미생물군유전체의 중요성은 비만, 대사증후군, 염증성 질환, 암10,11,12, 13. 점막 면역 계통 및 창자 microbiome는 창자 및 조직 항상성을 유지하기 위하여 상호 적으로 통제됩니다. 면역 계통은 창자 microbiome에 의해 제출된 항원에 의해 형성되고 면역 계통은 공생 창자 박테리아를 승진시키고 병원체 제거에 있는 중요한 규제 역할을 합니다14,15, 그러나,후마우스의 장내 미생물군유전체는 잘 특성화되지 않았으며, 뮤린 장내 미생물군유전체는인간17과의 조성 및 기능면에서 실질적으로 다르다. 이는 뮤린과 인간의 장 사이의 진화적, 생리적, 해부학적 차이뿐만 아니라 식이요법과 같은 다른 중요한 요인들, 이는 후마우스 질환 모델18의실험 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 따라서, 휴 마우스의 뮤린 창자 미생물군유전체의 분류를 넘어, 생체 내에서 인간 질병의 복잡한 상호 작용을 연구하기 위해 인간 면역 체계와 인간 장내 미생물군유전체를 모두 특징으로 하는 동물 모델이 필요하다.
인간의 과목에서 직접 인간의 질병의 연구는 종종 비실용적이거나 비윤리적이다. 많은 동물 모델은 인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1)과 같은 인간 병원체를 연구하는 데 사용할 수 없습니다. 비 인간 영장류 모형은 유전으로 교배되고, 아주 비싸고, 많은 인간 적인 병원체에 영향을 받기 쉽지 않습니다. 세균이 없고 인간과 같은 장내 미생물군유전체로 재구성된 마우스는 인간의 건강과 질병을 연구하기 위해 널리 사용되고 있다19,20. 그러나, 이러한 동물은 인간의 면역 체계를 가지고 있지 않으며 GF 동물과 함께 일하려면 전문 시설, 절차 및 전문 지식이 필요합니다. 따라서, 장내 미생물군유전체와 인간 면역 계통의 복잡한 관계를 연구하기 위한 개선된 전임상 모델에 대한 필요성이 있다. NOD와 같은 마우스의 많은 변종. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), GF로 상업적으로 사용할 수 없습니다. GF 동물은 또한 미생물21의생착에 의해 완전히 반전되지 않는 오래 지속되는 면역 결핍으로 고통받을 수 있습니다. 따라서, 우리는 기능성 인간 면역 계통 및 특정 병원체 자유로운 (SPF) 조건 의 밑에 안정된 인간 같이 창자 microbiome를 모두 특징으로 하는 이중 hu-마우스를 만들었습니다. 이중 후 마우스를 생성하기 위해, NSG 마우스에서 골수, 간, 흉선 인간화 마우스(hu-BLT)를 생성하기 위한 수술을 수행하였다. hu-BLT 마우스는 그 때 건강한 인간 기증자 견본을 가진 배설물 이식을 광스펙트럼 항생제로 취급하고 그 후에 주어졌습니다. 우리는 45개의 이중 hu-BLT 마우스 및 4개의 인간 배설물 기증자 견본에서 173의 배설물 견본의 세균성 창자 microbiome를 특성화했습니다. 이중 hu-BLT 마우스는 이식되는 개별 적인 인간 공여자 견본에 근거를 둔 독특한 16S rRNA 유전자 단면도가 있습니다. 중요한 것은, 이식된 인간과 같은 미생물군유전체는 이식 후 최대 14.5주까지 연구 기간 동안 마우스에서 안정하였다. 또한, 예측된 메타게놈은 이중 hu-BLT 마우스가 인간 공여자 샘플과 더 유사한 후마우스보다 다른 예측 된 기능 능력을 갖는다는 것을 보여주었다.

<table><tbody><tr><td>동물 먹이 바늘 18G</td><td>Cadence Science</td><td>9928B</td><td></td></tr><tr><td>Clidox-s 활성제</td><td>제약 연구 실험실</td><td>95120F</td><td></td></tr><tr><td>Clidox-s 베이스</td><td>제약 연구 실험실</td><td>96125F</td><td></td></tr><tr><td>DGM 108 케이지 랙</td><td>Techniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플랫 브라운 식료품 가방 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>12R063</td><td></td></tr><tr><td>FMT 상위 전달 미생물군 제제&nbsp;</td><td>오픈바이옴</td><td>FMP30</td><td></td></tr><tr><td>포도 쿨에이드</td><td>크래프트 푸드 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCD19-PE/Cy5</td><td>Biolegend</td><td>302209</td><td></td></tr><tr><td>hCD3-PE</td><td>Biolegend</td><td>300408</td><td></td></tr><tr><td>hCD4-Alexa 700</td><td>Biolegend</td><td>300526</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td></td></tr><tr><td>hCD8-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301016</td><td></td></tr><tr><td>젖산 완충 링거 솔루션</td><td>Boston BioProducts Inc&nbsp;</td><td>PY-906-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>103111</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 100 K3E</td><td>Microvette</td><td>20.1278.100</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin 응급 처치 항생제/통증 완화 연고</td><td>Neosporin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NSG 마우스(NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)</td><td>잭슨 연구소</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 25G 니들</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>RS200 X선 조사기</td><td>RAD Source Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sealsafe Plus GM500 마이크로아이솔레이터 케이지</td><td>Techniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 부직포 거즈</td><td>Fisherbrand</td><td>22-028-558</td><td></td></tr><tr><td>Teklad 글로벌 16% 단백질 조사 마우스 차우</td><td>Teklad</td><td>2916</td><td></td></tr></tbody></table>

안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 blt 마우스 모델

A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System

기능성 인간 면역 계통을 특징으로 하는 인간화된 마우스(hu-mice)는 인간 병원체 및 질병에 대한 연구를 근본적으로 변화시켰다. 그(것)들은 인간 또는 그밖 동물 모형에서 공부하는 그렇지 않으면 어렵거나 불가능한 질병을 모델링하기 위하여 이용될 수 있습니다. 창 자 미생물 은 인간의 건강 및 질병에 깊은 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 뮤린 창 자 미생물은 인간에서 발견 하는 것 보다 매우 다른.  생착된 인간 장내 미생물군유전체를 가진 개선된 전임상 후마우스 모델에 대한 필요성이 있다. 따라서, 우리는 인간의 면역 체계와 안정적인 인간 같은 창 자 미생물을 특징으로 하는 이중 hu-마우스를 만들었습니다. 끄 덕. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스는 면역 결핍의 그들의 높은 수준으로 인해 인간화를 위한 최고의 동물 중 하나입니다. 그러나, 세균이 없는 NSG 마우스 및 기타 다양한 중요한 세균 없는 마우스 모델은 현재 시판되고 있지 않다. 또한, 많은 연구 설정은 그놈 바이오 틱 시설에 액세스 할 수 없습니다, 그리고 gnotobiotic 조건에서 작업하는 것은 종종 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 중요한 것은, 세균이 없는 마우스는 세균의 생착 후에도 존재하는 몇몇 면역 성이 결핍이 있습니다. 따라서, 우리는 세균이없는 동물이나 뇨대 생물 시설을 필요로하지 않는 프로토콜을 개발했다. 이중 후 마우스를 생성하기 위해, NSG 마우스는 골수, 간, 흉선 인간화 (hu-BLT) 마우스를 만들기 위해 수술 전에 방사선으로 처리하였다. 마우스는 그 때 기존의 뮤린 창자 미생물군유전체를 고갈시키기 위하여 광범위한 스펙트럼 항생제로 취급되었습니다. 항생제 치료 후, 마우스는 경구 위장을 통해 건강한 인간 기증자 샘플을 가진 배설물 이식을 받았다. 이중 hu-BLT 마우스는 이식된 개별 인간 공여자 샘플에 기초하여 독특한 16S rRNA 유전자 프로파일을 가졌다. 중요한 것은, 이식된 인간-유사 미생물군유전체는 이식 후 최대 14.5주까지의 연구 기간 동안 이중 후-BLT 마우스에서 안정하였다.

도 1은 이중 hu-BLT 마우스를 생성하는 데 사용되는 방법의 개요를 보여주고 NSG 마우스에 기능성 인간 면역 계통 및 안정된 인간유사 장성 미생물군유전체를 추가하는 과정을 간략하게 설명한다. 도 2는 수술 후 10주 동안 인간화된 BLT-마우스로부터 말초 혈액의 유세포분석의 예를 나타낸다. 도 3은 이중 후마우스를 생성하기 위해 장내 미생물군유전체를 전달하는 데 사용되는 인간 배설물 공여자 샘플의 상대적 풍부도를 나타낸다. 도 4는 비장 및 흉모에 대한 항생제 치료에 의해 유도된 현상형 변화를 나타내며, 세균이 없는 동물에서 관찰되는 것과 유사하다. 도 5는 이중 후마우스가 인간 공여자 샘플에 고유한 인간과 같은 장내 미생물군유전체를 가지고 있음을 밝히는 16...

우리는 기능적인 인간적인 면역 계통 및 안정한 생착한 인간 같이 창자 microbiome를 특징으로 하는 이중 인간화한 BLT 마우스를 생성하기 위한 새로운 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 세균이 없는 마우스 또는 뇨바이오틱 시설에 대한 필요 없이 따를 수 있다.

안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be ...

우리의 프로토콜은 인간 적인 창 자 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 가진 마우스를 재현적으로 만드는 것을 이용하기 위하여 이용될 수 있기 때문에, 중요합니다. 우리는 이 마우스, 이중 인간화마우스를 부릅니다. 이중 인간화된 마우스 모델은 인간 적인 창 자 미생물군유전체와 인간 면역 체계 사이의 생체 내 관계의 연구를 포함하여 기본 및 번역 생물 의학 연구 모두에 사용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 포스트독인 장진수와 우리 실험실에서 박사 학위를 취득한 장일룬이 될 것입니다. 간과 흉선 조직을 왼쪽 신장 캡슐에 이식하려면 먼저 마우스를 후드에 넣습니다. 수술 당일, 몸 전체의 치사성 조사로 마우스를 체중 량 1그램당 12센티미터씩 치료하십시오.적절한 수준의 침전을 확인한 후 왼쪽 측면 및 내측 주위의 각 마우스를 면도합니다. 동물의 눈에 안과 연고를 바르고 필요에 따라 귀 태그를 바치게 됩니다. 3개의 순차요오드와 70%의 이소프로판올 스크럽으로 피부를 소독합니다.피부가 준비되면, 1~6밀리미터의 인간 태아 간 조직 조각을 트로카에 싣고, 그 다음에 1-1.6밀리미터의 인간 태아 흉선 조직 단편을 적재합니다. 포셉을 사용하여 피부를 들어 올리고 메스를 사용하여 피부에 작은 세로 절단을 합니다. 절단을 마우스 왼쪽에 있는 1.5~2cm로 확장합니다.그리고 집게를 사용하여 근육 층을 들어 올립니다. 가위를 사용하여 근육 층을 세로로 열고 신장을 노출하기 위해 필요에 따라 절단을 확장하고 신장을 둘러싼 지방 조직을 부드럽게 잡습니다. 메스를 사용하여 신장 캡슐의 후부 끝에서 1-2 밀리미터 절개를 하고 신장의 긴 축과 평행한 절개에 미리 로드된 트로카를 천천히 삽입합니다.신장 캡슐과 신장 사이 조직을 풀어 놓고, 그들의 일반적인 위치에 신장과 창자를 반환합니다. 그런 다음 봉합사를 사용하여 근육 층과 수술 용 스테이플을 닫아 피부를 닫습니다. 마우스를 완전한 방수까지 모니터링하여 자동 마이크로이졸라이터 케이지에 넣습니다.수술 후 6시간 후, 마우스를 열램프 아래에 놓고 70%의 이소프로파놀로 꼬리를 소독합니다. PBS의 200 마이크로리터에서 1.5~5회 CD34 양성 인간 태아 간 조직 분리 된 혈청 줄기 세포를 동물 당 하나의 팽창 꼬리 정맥으로 주입하십시오. 그런 다음 부드러운 압력으로 출혈을 멈추고 마우스를 홈 케이지로 돌려놓습니다.수술 후 9~12주 동안 적절한 크기의 플라스틱 빗 구속을 사용하여 한 개의 인간화된 마우스의 한 쪽 다리를 분리하고, 분리된 다리의 내측을 70%의 이소프로판올로 분사한다. 항생제와 통증 완화 연고를 수집 부위에 퍼뜨리세요. 90도 각도로 유지되는 25게이지 바늘을 사용하여 사페누스 정맥을 천자하여 EDTA 코팅 혈액 수집 튜브에 50~100마이크로리터의 혈액을 수집합니다.적당한 양의 혈액이 얻어지면, 마우스를 케이지로 되돌리기 전에 출혈을 막기 위해 멸균 된 거즈 조각으로 부위에 압력을 가하십시오. 그런 다음 수집된 말초 혈액 샘플을 사용하여 인간 CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 및 마우스 CD45에 대한 항체를 사용하여 혈동 세포측정에 의한 인간 면역 세포 재구성의 수준을 평가한다. 신선한 배설물 샘플 컬렉션을 위해 개별 오토클레이브 종이 봉투를 연기 후드에 넣고 각 동물이 배변할 때까지 각 가방에 마우스 한 개를 넣습니다.그런 다음 마우스를 케이지로 돌려보내고 멸균 집게를 사용하여 각 배설물 샘플을 마우스 당 1.5 밀리리터 튜브로 영하 80도 저장하도록 옮킨다. 14일 항생제 치료가 끝나면 식수를 자동 살균물로 바꾸고 마우스를 새로운 오토클레이브 케이지로 옮킨다. 항생제의 중단 후 24 및 48 시간 대변 미생물 이식 물질의 제대로 준비 된 소스를 해동하고 혐기성 조건하에서 혐기성 챔버에서 샘플을 알리쿼트.배설물 이식을 수행하기 위해 경구 개비지를 통해 200마이크로리터의 배설물 미생물 이식 물질을 각 실험 동물에 전달하고, 인간화된 마우스의 털이나 케이지 침구에 남은 해동 물질을 확산시킵니다. 여기서, 인간화된 BLT 마우스로부터 말초 혈액의 유동 세포측정 분석의 예가 10주 후 수술 후 나타난다. T 및 B 세포 집단은 CD4 및 CD8 양성 T 세포 하위 집합뿐만 아니라 둘 다 식별될 수 있다.이 그래프에서 이중 인간화된 마우스를 생성하기 위해 장내 미생물군유전체를 이송하는 데 사용되는 인간 대변 기증자 샘플의 상대적 풍부를 관찰할 수 있다. 항생제 치료에 의해 유도된 비장 과 cecum에 대한 현상제 변화는 세균이 없는 동물에서 관찰된 것과 유사합니다. 대표적인 16S 리보소말 RNA 염기서열 분석 데이터의 이 주요 성분 분석 플롯은 이중 인간화된 마우스가 인간 기증자 샘플에 고유한 인간과 같은 장용 미생물군유전체를 가지고 있음을 보여준다.이 프로토콜의 가장 중요한 측면은 마우스가 건강하게 유지하고 인간의 창자 미생물군유전체를 유지하기 위해 원치 않는 박테리아의 도입을 제한하는 것입니다. 이 모델은 개인화 된 의학을 발전시키고 인간 질병이 다른 완화 요인을 제어하는 동안 장 내 미생물군유전체에 미치는 영향을 볼 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

a-double-humanized-blt-mice-model-featuring-stable-human-like-gut

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

인간화 마우스를 사용하여 종양 특정 T 세포의 생성 및 특성이 여기에 설명되어 있습니다. 인간 thymic 조직 및 유전자 변형 인간의 조혈 줄기 세포는 면역 저하 된 쥐에 이식되어 있습니다. 안티 종양 면역 반응의 생체 시험에서 허용하는 엔지니어링 인간의 면역 시스템의 reconstitution에이 발생합니다.

줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

이 비디오는 기능적인 인간 면역 체계와 안정적인 생착 인간과 유사한 장내 미생물 군집을 가진 이중 인간화 뼈 BLT(골수, 간 및 흉선) 마우스를 생성하는 방법을 보여줍니다.

이중 인간화 BLT(Bone-Marrow, Liver, Thymus) 마우스 모델 생성

이 비디오는 인간 면역 체계와 간 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이는 인간 간 세포와 조혈 줄기 및 전구 세포를 비장 내 주사를 통해 형질전환 면역 결핍 마우스에 이식하여 간 세포의 생착과 인간 면역 세포의 발달을 유도하는 것을 포함합니다.

인간 간 세포와 면역 세포를 이용한 인간화 마우스 모델 개발

나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

이 프로토콜 신생아 NSG 쥐 방사선 조절로 인간 조 혈 줄기 세포의 intrahepatic 주입을 통해 humanized 쥐 (hu-NSG)를 설정 하는 방법을 제공 합니다. Hu NSG 마우스 HIV 감염 및 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 취약 하 고 HIV 복제 및 대기 시간 조사에 대 한 적합 한 병 태 생리 모델 역할.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

neuroHuMiX는 근접 및 대표 공동 배양 조건에서 박테리아, 상피 및 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위한 고급 gut-on-a-chip 모델입니다. 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 통신의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하기 위한 gut-on-a-chip 모델

이 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계(HIS) 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 이 모델에 이식된 인간 종양에 대한 인간 면역치료제를 시험하기 위한 이 모델의 사용에 있어서의 지침 및 고려사항은 종양에 대한 인간 면역계의 반응을 특성화하는 것에 중점을 두고 제시된다.

인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트

배우세요 인간 면역 체계와 장내 미생물군유전체를 동시에 갖는 이중 인간화 BLT 마우스를 만드는 방법을. 이 모델은 면역학과 미생물군유전체 연구에 활용됩니다.

안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델

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