잘 정의된 전단 응력 하에서 단세포 이온 전류의 전기 생리학적 기록

이 프로토콜의 목적은 전단 응력에 의한 메카노민성 이온 채널의 실시간 활성화를 조사하는 데 사용하기 위해 변형된 병렬 플레이트 플로우 챔버를 설명하는 것이다.

수정된 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용하면 연구원이 응모에 대한 메카노감이온 채널의 기능적 반응과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실시간 조사가 쉽게 조립되고 재사용 가능한 병렬 플레이트 흐름 챔버에서 활성화된 이온 채널을 플로우할 수 있다는 것입니다. 절차를 시작하려면, 조각 C의 직사각형 공간의 가장자리에 실리콘 탄성 탄성 용액의 얇은 층을 적용하고 부드럽게 사각형 커버 유리, 조각 D를 배치, 완전히 조각 C.의 열린 직사각형 공간을 커버하기 위해 여분의 실리콘 엘라스토머 용액을 닦아.

그런 다음 직사각형 커버 유리, 조각 F를 조각 E의 바닥에 고수하는 절차를 반복하고 실리콘 탄성탄용액이 실온에서 하룻밤 동안 치료할 수 있도록 합니다. 이제 MPP 유량 챔버를 조합하여 각 조각을 이전 위에 순차적으로 배치하여 하단 챔버, 조각 E, 조각 C, 조각 B, 그리고 상단에 조각 A로 시작하십시오. 다음으로, 각 조각의 나사 구멍을 모서리에 정렬하고 MPP 흐름 챔버로의 흐름을 관리하면서 누출이 발생하지 않도록 조각을 단단히 나사로 고정합니다.

6웰 플레이트에 4~5, 12mm 커버 유리 원을 각 웰에 놓습니다. 10%와 30%의 결합 사이의 세포를 저장하여 단일 세포가 전기 생리학적 기록에 접근할 수 있도록 합니다. 이어서, 내피 세포가 평평해지고 24시간 이상 감속시 종자시 패치가 어려워지기 때문에, 세포가 부착할 수 있도록 2시간 이상 표준 배양 조건하에서 세포를 배양한다.

다음으로, 6웰 플레이트의 우물에서 부착된 세포를 함유한 커버 글래스를 제거하고 PBS에서 빠르게 헹구는다. 그런 다음, 세포로 커버 글래스를 전기 생리적 BAF 용액 의 2 밀리리터를 포함하는 35mm 페트리 접시로 옮는다. 즉시 MPP 흐름 챔버에 셀커버 글래스를 전송합니다.

커버 글래스 원을 MPP 플로우 챔버의 C 조각에 부착된 직사각형 커버 글래스, 조각 D로 옮겨. BAF 솔루션을 추가하여 커버 유리 원과 셀을 완전히 침수합니다. 이어서, 커버 글래스 원을 조각 D에 배치하여 세포가 조각 B.의 슬릿 개구부와 일치하도록 하여 커버 유리 원이 플로우 애플리케이션에 의해 커버 글래스 원의 위치의 중단을 피하기 위해 용액 유리 접착을 통해 D 조각을 부착하도록 한다.

그런 다음, 적절한 순서로 조각을 함께 나사로 하여 MPP 흐름 챔버를 조립한다. 챔버를 현미경 단계로 옮기고 즉시 BAF 용액으로 챔버를 인내합니다. 다음으로, 실험을 위한 어두운 테두리및 명백한 핵을 가진 건강한 세포를 확인합니다.

흐릿하게 보이는 세포 나 다른 세포와 접촉하는 세포를 피하십시오. 전단 응력을 제어하려면 30 밀리리터 졸업 한 주사기 실린더를 마이크로 보어 튜브가 장착 된 3 방향 Luer 잠금 장치로 연결하여 중력 관류 시스템을 설정합니다. 다음으로, 양면 테이프를 사용하여 전기 생리학 장비를 둘러싼 패라데이 케이지에 졸업 된 실린더를 부착합니다.

MPP 챔버에 튜브를 삽입하기 전에 BAF 용액으로 주사기 및 튜브를 미리 채웁니다. 이어서, 튜브를 MPP 플로우 챔버 입구 구멍에 삽입하여 MPP 흐름 챔버를 용액으로 미리 채우므로 진공 저장소에서 제거된다. 챔버로의 흐름을 멈추고 졸업한 실린더를 맨 위 마크로 다시 채웁니다.

주어진 주사기 실린더 높이에서 챔버를 통해 솔루션이 흐르도록 하여 스톱워치를 사용하여 수동으로 유량을 계산합니다. 주사기를 들어 올리거나 낮게 하여 흐름을 변경하고 이 방정식을 사용하여 병렬 챔버에서 전단 응을 계산합니다. 원하는 수준의 전단 응력이 발견될 때까지 이 과정을 반복합니다.

이어서, 부착된 세포를 포함하는 조립된 챔버를 전기생리학 장비의 현미경 단계로 이송한다. 그리고 BAF 용액으로 미리 채워진 튜브를 A.Then 의 구멍에 삽입하고 챔버를 채우고 BAF 용액 10 밀리리터로 세포를 동시에 세척합니다. 원하는 패치 구성이 성공적으로 완료되면 실온에서 정적 욕조에서 채널 전류가 안정화되도록 합니다.

전류가 안정화되는 즉시 전단을 단계별 방식으로 적용하여 다음 단계의 전단 응력 증가 이전에 증가된 전류가 안정화될 수 있도록 합니다. 챔버로의 흐름을 중지하여 세포에 대한 전단 노출을 제거하여, 메카노감감성 채널 전류가 정적 욕조에서 관찰된 기준선 전류로 돌아갈 수 있도록 합니다. 여기에 표시된 키르 전류의 대표적인 원시 기록은 주목할 만한 선형 외측 누설 전류를 가진 1차 마우스 막심 내피 세포로부터의 대표적인 원시 기록이다.

400밀리초 이상 패치에 음수 140~40밀리볼트의 램프가 적용되었습니다. 누출 전류는 실제 Kir 채널 활동의 분석을 방지합니다. 누출 전류를 빼려면 먼저 누수 전류의 선형 경사 전도도를 계산합니다.

원시 데이터의 누출 전류를 플롯하기 위해 전체 원시 추적의 해당 전압에 의해 여러 G 경사. 선은 바깥쪽 선형 누설을 정확하게 오버레이해야 합니다. 그런 다음, 전체 추적에서 플롯된 누설 전류를 빼서 선형 바깥쪽 전류가 피코파라드당 피코아페레가 0에 약하며 실제 커전류를 분석할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 세포가 실험에 접근할 수 있도록 챔버에 덮개 유리를 올바르게 배치하는 것입니다. 또한, 커버 슬립이 조각 D에 적절하게 부착되어 있는지 확인하여 유체 흐름이 세포를 포함하는 커버 유리를 방해하지 않도록 하십시오.