Name: 실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 학습하세요 RAF 키나아제 돌연변이체의 질병 관련 특성화를 위한 민감하고 재현성 높은 생화학적 방법을 통해 세포 신호 전달 메커니즘을 이해하고 치료 전략을 개발하는 데 활용하세요.

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저자는 위안 지민의 지원을 위한 털이 많은 세포 백혈병 동호회를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 아시아 펀드 암 연구 (AFCR2017 / 2019-JH), 듀크 누스 쿠 브릿지 자금 조달 상 (듀크 - NUS-KBrFA / 2018 / 0014), NCCRF 브리징 보조금 (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF 파일럿 보조금 (NCCRF-YR2017-2017)에 의해 지원되었습니다. 연구 보조금 (AM/ TP011/2018).

1. RAF 돌연변이의 촉매 활동을 측정하기위한 체외 키나제 분석
<ol><li>Gibson 어셈블리 또는 기존분자 복제 방법을 사용하여 C-종단에서 RAF 돌연변이체(그림 1A)를 FLAG(DYKDDDDK) 태그로 코딩하는 벡터를 생성합니다.
	<ol>
<li>PRS에 의해 RAF 코딩 서열에 FLAG 태그 및 돌연변이를 소개하고, 깁슨 어셈블리 또는 T4 DNA 결찰을 사용하고 제조의 프로토콜을 따라 pCDNA3.1(+) 벡터에 전체 서열을 삽입합니다. PCR 반응에 대해 다음과 같은 조건을 사용하십시오: (1) 95°C, 2분; (2) 95 °C, 30s; (3) 59 °C, 30s; (4) 68 °C, 3 분; (5) 20 사이클 (2 받는 번째 4); (6) 4 °C 홀드. 참고: 복제를위한 PCR 프라이머 : 5- AAATAATACGACTATATAGGGAGACCC-3 및 5-CAGCGGGTTTAAACGCCCTCTCtA-3.</li>
		<li>1.1.1단계에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 GST 융합 RAF 돌연변이를 코딩하는 벡터를 생성하기 위해 RAF 돌연변이 코딩 서열의 상류에 GST 코딩 시퀀스를 삽입한다.</li>
		<li>형질전환 전에 DNA 염기서열 분석으로 모든 벡터를 검증합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플레이트 293T 세포는 5 x 105 셀의 밀도로 6 웰 플레이트에서 1 일 전에 형질전환전에 잘. 세포 밀도가 둘째 날에 80~90% 합류에 도달하면, 제조의 형질전환 시약 프로토콜에 따라 1.1단계에서 FLAG 태그가 지정된 RAF 키나제 또는 이들의 돌연변이체를 코딩하는 벡터를 트랜스펙트(표오브재료)로 한다.</li>
	<li>형질전환 후 배양 배지 24h를 교체한다.</li>
	<li>배양 배지를 48시간 후 흡인하고 400 μL/well 의 라시스 버퍼(25 mM Tris· HCl, 150 mM NaCl, 1 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) 프로테아제 및 인산아제 억제제로 보충하여 얼음 에 세포를 용해시켰다. 참고: 용해 완충액에서의 NP-40의 농도는 시험관 내에서 중간 정도의 이량친 친화도/안정성을 가진 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 검출하는 데 매우 중요하다. 고농도의 세제 또는 라시스 버퍼의 강한 세제는 RAF 이측정기를 파괴하여 RAF 키나제 또는 돌연변이체의 촉매 활성을 죽일 수 있습니다.</li>
	<li>세포 용해를 1.5 mL 튜브로 옮기고 4 °C에서 10 분 동안 12,000 x g씩 회전하여 세포 파편을 고갈시.</li>
	<li>깨끗한 전체 세포 의 샘플 당 300 μL을 1.5 mL 튜브로 용해시키고, 안티 플래그 친화 구슬 샘플 당 20 μL을 추가하고, 냉장실 (4 °C)에서 1 시간 동안 회전합니다. 또한 아래에 설명된 바와 같이 RAF 돌연변이체의 발현 및 활성(phospho-ERK1/2)을 검출하기 위해 깨끗한 전체 세포 용해의 샘플당 40 μL을 취한다.</li>
	<li>용해 완충제로 한 번 반 플래그 구슬을 세척한 다음 키나아제 반응 완충액(20 mM HEPES, 10 mM MgCl2,0.5 mM Na3VO4,0.5 mM DTT, pH 7.2)을 한 번 추가하고 키나아제 반응 혼합물 20 μL(MEK1(K97A) 및 100μg 의 20μg을 추가합니다. 샘플당 작업 버퍼)를 제공합니다. 참고: 비드 세척은 부드럽고 빠르게 완료되어야 하며, 잔류 완충액은 키나아제 반응 혼합물을 첨가하기 전에 완전히 흡인되어야 하며, 이 단계의 모든 작업은 냉장실에서 4°C에서 수행되어야 한다.</li>
	<li>실온(25°C)에서 키나아제 반응을 10분 동안 배양하고, 인큐베이션 동안 다른 분마다 손가락으로 키나아제 반응을 함유하는 튜브를 뒤집는다.</li>
	<li>5x SDS 샘플 버퍼 5μL 추가(375 mM Tris· HCl, 9% 나트륨 도데실 황산염 (SDS), 50 % 글리세롤, 0.03 % 브로모페놀 블루) 키나아제 반응을 중지한 다음 샘플을 90 °C에서 5 분 동안 가열합니다.</li>
	<li>0.1% SDS로 9~12% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에서 샘플을 실행하고, 단백질을 니트로 셀룰로오스 막으로 옮기고, 면역 혈전에 의한 샘플에서 인포스 포 MEK 및 RAF 돌연변이체의 수준을 검출합니다. 참고: 포스포-MEK는 또한 γ32P-ATP 혼입을 사용하여 정량화될 수 있다. 간략하게, 10 μM γ32P-ATP가 키나아제 반응 완충액에 첨가되고, 인산화된 MEK의 양은 표준 자가방사선, 인광 이미징, 또는 액체 현미 계수 기술을 사용하여 PAGE 분리 후 정량화된다. 해당.</li>
</ol>2. 키나제 죽은 RAF 돌연변이의 알로스터활성 평가를 위한 RAF 공동 활성화 분석
<ol><li>RAF 수신기를 인코딩하는 벡터(CRAF 키나아제 도메인과 비인료 NtA 모티프, AAFF) 또는 키나아제 죽은 RAF 활성제(인산화 모방된 NtA 모티프를 가진 RAF 키나아제 도메인, SSDD, DDEE 또는 DGEE)로(그림1A) 1.1단계에 설명되어 있습니다.</li>
	<li>Transfect 293T 세포는 RAF 수신기 및 키나아제 죽은 RAF 활성제 또는 단계 1.2 및 1.3에 기재된 바와 같이 하나의 단백질을 코딩하는 2개의 벡터를 인코딩한다.</li>
	<li>형질전환 후 24시간에서 배양배지를 교체하고, 1.4 단계 및 1.5단계에서 기재된 바와 같이 전체 세포 가액을 준비하기 위해 48시간에서 293T 트랜스펙트들을 수확한다.</li>
	<li>깨끗한 전체 세포용액을 실온(25°C)에서 5x SDS 샘플 버퍼와 빠르게 혼합한 다음 90°C에서 5분간 끓입니다.</li>
	<li>삶은 전체 세포 용해 샘플을 0.1% SDS로 9~12% PAGE에서 실행하고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 인광-ERK1/2 수준을 검출하고 면역혈전으로 단백질을 조절합니다.</li>
</ol>3. RAF 돌연변이체의 상대적 이체 친화력/안정성 측정을 위한 무료 분할 루시퍼라제 분석
<ol><li>1.1단계에서 설명한 바와 같이, 플래그 태그가 있는 RAF 돌연변이를 Nluc의 N-종단(반딧불 루시페라아제의 N-종점, aa2-416) 또는 C-종단(반딧불 루시페라아제의 C-종점, aa398-550)에 융합한 생성 벡터.</li>
	<li>Transfect 293T 세포는 1.2단계에서 기재된 바와 같이 상이한 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체를 인코딩하는 한 쌍의 벡터를 갖는다.</li>
	<li>형질전환 후 24시간에서, 293T 세포 트랜스펙트를 컬러 프리 배지(즉, 페놀 레드가 없는 DMEM)로 잘 당 2x10 5의 세포 밀도에서 크리스탈 블랙 이미지 플레이트로 재플레이트한다.</li>
	<li>24시간 후, 293T 세포 투명제에 D-루시페린(0.2 mg/mL)을 넣고 30분 동안 배양하고, 다중 검출 시스템(재료 표)을 사용하여 루시퍼라제 신호를 측정한다.</li>
	<li>루시퍼라제 신호를 측정한 후, 배지를 흡인하고 293T 트랜스펙트와 라시스 버퍼를 사용하여 단계 1.4 및 1.5에 기재된 바와 같이 전체 세포 가해를 준비한다.</li>
	<li>전체 세포 용해 샘플을 0.1% SDS로 9~12% PAGE에서 실행하고 2.5단계에서 설명한 바와 같이 항-FLAG 면역블롯에 의한 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체의 발현 수준을 검출한다. 293T 트랜스펙트에서 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체 모두의 상대발현 수준은 그들의 면역블롯으로부터의 이미지 J를 사용하여 정량화된다.</li>
	<li>Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체의 발현 수준에 따라 293T 세포 트랜스펙트의 루시퍼라아제 신호를 정상화한다. 간략하게, 이것은 3.6 단계에서 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체의 상대적인 발현 수준으로 원시 루시퍼라아제 신호를 분할함으로써 달성된다.</li>
</ol>

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<li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudokinases+from+a+structural+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li>
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<li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li>
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<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+relationships%3A+the+regulation+of+the+Ras%2FRAF%2FMEK%2FERK+pathway+by+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).</li>
<li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22RAF%22+neighborhood%3A+protein-protein+interaction+in+the+Raf%2FMek%2FErk+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li>
<li>García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions%3A+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li>
<li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein%E2%80%93protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li>
<li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF%2C+EGFR%2C+and+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li>
</ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 무료 분할 루시페라아아제 분석법을 포함하는 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하는 세 가지 방법을 제시했습니다. RAF 키나아제는 촉매 활성과 알로스테릭 활성을 모두 갖기 때문에, 다양한 RAF 돌연변이체는 두 가지 메커니즘을 통해 다운스트림 신호를 활성화할 수 있다13,14,16,17, 18. 구성활성 RAF 돌연변이체는 하류 이펙터 MEK를 직접 인산화하는 반면, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 야생형 의 대응물질을 거래함으로써 다운스트림 신호를 트리거한다. 그러나, 둘 다 구성적으로 활성 및 키나제 죽은 RAF 돌연변이체는 그들의 기능<sup class="xref"...

RAF 계모 키나아제는 RAS/RAF/MEK/ERK 신호 캐스케이드의 핵심 구성 요소로, RAS로부터 신호를 전송하여 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MEK)1,2,3,4를활성화합니다. 키나아제의 이 가족은 세포 성장, 생존 및 분화에 중요한 역할을 하며, 이들의변화는 많은 질병, 특히 암 5,6,7,8을유발한다. 최근, 게놈 염기서열 분석은 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드9,10,11의신호 전송에 상이한 특성을 나타내는 많은 질병 관련 RAF 돌연변이체를 확인하였다. RAF 돌연변이체의 신중한 특성화는 RAF 돌연변이체가 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드의 신호 출력을 변경하는 방법의 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되며, 결국 다양한 RAF 돌연변이 구동 질환 치료에 적합한 접근법을 선택하는 데 도움이 됩니다.
RAF 패밀리 키나제는 3개의 멤버, CRAF, BRAF 및 ARAF를 포함하며, 이는유사한 분자 구조를 가지고 있지만 다운스트림 신호화 1,2,3,4를활성화하는 다른 능력을 가진다. 이러한 파라로그 중에서 BRAF는 인산화된 NtA(N -terminal acidic) 모티프12,13,14,ARAF가 가장 낮은 것으로 나타났습니다. 비 정식 APE 모티프에서 발생하는 활동15. 이것은 질병에 있는 RAF paralogs의 다른 돌연변이 주파수를 설명할 수 있습니다: BRAF>CRAF>ARAF. 더욱이, 동일 RAF paralog 내의, 다른 사이트에 있는 돌연변이는 RAF 가족 키나아제의 규칙에 복잡성의 또 다른 층을 추가하는 별개의 방식으로 다운스트림 신호를 시작할 수 있습니다. 최근 연구는 모든 RAF 키나제는 촉매 및 allosteric 활동모두 13,14,16,17,18을가지고 있음을 입증했다. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 MEK를 인산화하여 하류 신호를 직접 켜는 반면, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 좌우 이량화를 통해 야생 형 대응을 트랜스 활성화하고 MEK-ERK 신호 16을 활성화할 수 있습니다. ,19,20. 이량친 친화성/안정성은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 결정할 뿐만 아니라 조직적으로 활성RAF 돌연변이체(15,21)의 촉매 활성에 영향을 미치는 주요 파라미터이다. 22. 높은 이분화 친화성/안정성을 가진 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 내인성 야생형 RAF를 직접 15로 변환 할 수 있으며 중간 이량 친화성 / 안정성을 가진 돌연변이는 활성 Ras 또는 야생 형 RAF 분자의 높은 수준은 기능13,15,20,21,23. 유사하게, 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 이량체 의존적 방식으로 MEK를 인산화하고, 낮은 이량친 친화성/안정성을 가진 사람들은 약한 RAF 이동기를 깨뜨리는 면역 침전 시 시험관내에서 촉매 활성을 잃는다15, 21,22. 이량친친화성/안정성은 또한 그들의 억제제에 대한 RAF 돌연변이체의 민감도를 결정하고, RAF 억제제(24)의 내성에 긍정적으로 상관관계가 있다. 따라서 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하기 위해서는 촉매 및 알로스테릭 활동을 측정하고 친화성/안정성을 변화시켜야 합니다.
최근 몇 년 동안, 우리의 실험실 및 다른 RAF 가족 키나아제와 그들의 돌연변이를 특성화 하는 다양 한 방법을 개발 했다. 우리의 실험실 및 다른 사람의 경험에 따르면, 우리는 다음 세 가지 분석이 질병 관련 RAF 돌연변이를 정의하는 데 장점이 있다고 생각합니다: (1) 체외 키나아제 분석제는 구성적으로 촉매 활성을 검출하기 위해 쉽게 수행 될 수 있습니다. 활성 RAF돌연변이체 15; (2) RAF 공동 활성화 분석법은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체13,15,21, 22,23의알로스테릭 활성을 측정하는 안정적이고 편리한 방법이다. 25; (3) 기존의 동면역침전 분석과 는 달리 RAF 돌연변이체의 상대이량 친화성/안정성을 측정하는 데 훨씬 더 높은 감도를 가지며, 첨단 장비 없이도 수행할 수 있는 무료 분할 루시페라아제 분석 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석15,22와같은 정량적 분석 방법과는 대조적이다. 이 3개의 검사를 결합하는, 우리는 질병 관련 RAF 돌연변이가 어떻게 하류 신호를 바꾸는지 쉽게 이해할 수 있고, 그로 인하여 이 RAF 돌연변이에 기인한 질병을 취급하기 위하여 적당한 치료 전략을 이용하.

<table><tbody><tr><td>anti-phosphoERK1/2</td><td>세포 신호 기술</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>anti-phosphoMEK1/2</td><td>세포 신호 기술</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK1/2</td><td>AB 클론</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>anti-MEK1/2</td><td>세포 신호 기술</td><td>9124</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(마우스)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(Rabbit)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG beads(M2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated anti-mouse IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated 안티-래빗 IgG</td><td>잭슨 연구소</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>In vitrogen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning&nbsp; Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM w/o phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis 태그 MEK1 (K97A)</td><td>&nbsp; 이전 연구에서 준비했습니다</td><td>.</td><td>참조 15.</td></tr><tr><td>GloMax-Multi 감지 시스템.</td><td>프로메가</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table>

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 raf 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

급속하게 가속화된 섬유육종 (RAF) 가족 키나아제는 세포 생물학에 있는 중앙 역할을 하고 그들의 역기능은 암과 발달 무질서로 이끌어 냅니다. 질병 관련 RAF 돌연변이체의 특성화는 우리가 이 질병 취급을 위한 적당한 치료 전략을 선택하는 것을 도울 것입니다. 최근 연구에 따르면 RAF 패밀리 키나아제는 촉매 작용과 알로스테릭 활동이 모두 있으며, 이는 이분화에 의해 엄격하게 조절됩니다. 여기에서, 우리는 촉매 및 allosteric 활동 및 RAF 가족 키나아제 및 그들의 돌연변이체의 상대적인 이량친 친화성/안정성을 결정하기 위하여 실용적이고 실행 가능한 방법의 세트를 건설했습니다. 첫째, 완충제의 세제 농도를 줄이고, 완만한 세척 절차를 활용하고, RAF 이분분석(GST) 융합을 사용하여 RAF 이완제 중 해리되는 것을 방지함으로써 고전적인 시험관내 키나아제 분석기를 개정했습니다. 정화. 이를 통해 우리는 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 적절히 측정할 수 있다. 둘째, N-말단 절단 된 RAF 단백질을 사용하여 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 평가하기 위한 새로운 RAF 공동 활성화 분석방법을 개발하여 현재 프로토콜에서 활성 Ras의 요구 사항을 제거하고 더 높은 것을 달성했습니다. 감도. 마지막으로, 우리는 전통적인 동면역침전 분석실험에 비해 더 안정적이고 민감한 다양한 RAF 돌연변이체의 상대적 이량친 친화성/안정성을 정량적으로 측정하기 위해 독특한 상보성 분할 루시페라아아제 분석법을 생성했다. 요약하자면, 이러한 방법에는 다음과 같은 장점이 있습니다: (1) 사용자 친화적인; (2) 고급 장비없이 효과적으로 수행 할 수; (3) 비용 효율적; (4) 매우 민감하고 재현 가능.

RAF 패밀리 키나아제는 촉매 및 알로스테릭 활동을 모두 가지고 있으며, 이는 질병 관련 돌연변이가 다른 메커니즘13,14,16,17을 통해 하류 신호를 켤 수 있게 합니다. ,18. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 직접 그들의 기질을 인산화하고, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 야생형 대응물질을 거래하여 그들의 기능을 수행한다. 그림 1B에도시된 바와 같이, 두 가지 로구성 활성 RAF 돌연변이체(예: 규제 척추(R-척추) 돌연변이체(BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M) 및 ARAF(DGEE/L358M))<sup class="xref...

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

이 방법은 질병 관련 RAF 키나아제 방법의 효과적인 특성화를 용이하게 한다. 이 기술은 매우 민감하고 재현 가능하며 비용 효율적이며 사용자 친화적이며 고급 장비가 필요하지 않습니다. RAF 돌연변이의 촉매 활성을 측정하려면 표준 프로토콜에 따라 전체 서열을 적절한 벡터에 삽입하기 전에 PCR에 의해 RAF 코딩 서열에 플래그 기술 돌연변이를 삽입합니다.글루타티온을 RAF 돌연변이 코딩 시퀀스의 트랜스퍼라제 코딩 시퀀스 업스트림으로 삽입하여 글루타티온을 트랜스포마이즈 융합 RAF 돌연변이체로 인코딩하는 벡터를 동일한 방식으로 생성한다. 표준 프로토콜에 따라 표태그가 지정된 RAF 키나아제 또는 돌연변이를 코딩하는 벡터를 가진 80%에서 90%의 컨런트 293T 세포 배양을 변환합니다. 24 시간의 문화 후 각 문화에서 매체를 교체하십시오.48시간의 배양 후, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 400마이크로리터의 용액을 얼음 위에 잘 넣습니다. 5-10분 후에 세포는 세포 잔해를 퇴적시키기 위해 원심분리를 위해 1.5 밀리리터 튜브로 용해됩니다. 각 샘플의 300마이크로리터를 개별 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기습니다.다운스트림 도매 용액 화석 추가 세포 신호 조절 키나아제 1 및 2 발현 및 활성 아미노 블롯 분석을 위한 샘플 당 40 마이크로리터를 따로 설정합니다. 각 튜브에 안티 플래그 친화성 구슬 20 마이크로 리터를 추가하여 섭씨 4도의 차가운 방에서 회전하여 1 시간 동안 인큐베이션을 합니다. 인큐베이션의 끝에서 는 차가운 방에 리시스 버퍼로 한 번, 키나제 반응 버퍼로 한 번 안티 플래그 구슬을 재빨리 세척한 후 키나아제 반응 혼합물의 20 마이크로리터를 첨가한다.디마 선호도가 낮은 그래프 돌연변이는 디마 해리때문에 체외에서 촉매 활성을 잃을 수 있습니다. 따라서 빠르고 부드러운 세척이 중요합니다. 실온에서 10분 동안 다른 분마다 뒤집힌 후, 샘플당 5개의 XSDS 샘플 버퍼로 키나아제 반응을 멈추고 샘플을 섭씨 90도에서 5분간 끓입니다.인큐베이션의 끝에서, 0.1%SDS를 가진 9-12%의 폴리아크릴아미드 전기포고이젤에 견본을 실행한 다음, 면역 분비질에 의하여 각 견본에 있는 인산 미토겐 활성화한 단백질 키나아제 및 RAF 돌연변이의 수준을 검출할 수 있도록 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전송합니다. 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스터 활성을 평가하기 위해 RAF 수신기 또는 키나아제 죽은 RAF 활성제를 인코딩하는 벡터를 구성합니다. 2개의 벡터를 가진 트랜스Ct 293 T 세포는 RAF 수신기와 키나아제 죽은 RAF 활성제, 또는 단일 벡터를 코딩하는 것으로 입증된 바와 같이 단백질 중 하나를 인코딩하였다.전체 셀용액을 48시간 동안 수확한 후, 깨끗한 전체 셀 용액을 실온에서 5개의 XSDS 샘플 버퍼와 빠르게 혼합한 후, 90°C에서 5분간 용재를 끓입니다. 그런 다음 삶은 전체 세포 용해 시료를 9~12%의 폴리아크릴아미드 전기포고이스 젤로 실행하고 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이송하여 인엑스트라 세포 신호 조절 키나아제 1및 2의 수준을 검출하고 면역 블로팅에 의한 단백질을 조절한다. RAF 돌연변이의 상대적 이머 친화성 및 또는 안정성을 측정하기 위해 반딧불 루시파라제 또는 C 터미누스 반딧불 루시파라제의 종족에 융합된 플래그 기술 드래프트 돌연변이를 인코딩하는 벡터를 구성한다.반딧불 루시파제 RAF 돌연변이체와 C 터미누스의 상이하고 종신을 코딩하는 벡터 쌍의 293 T 세포를 반딧불 루시파제 RAF 돌연변이체. 트랜스프션 후 24시간 10~5차 293T 셀 트랜잭션을 잘 하여 색이 없는 매체의 크리스탈 블랙 이미지 플레이트로 한다. 복장 도착 후 48 시간 293 T 세포 경배분에 루시퍼린을 추가하고 30 분 동안 배양합니다.복수 검출 시스템에서 루시파아제 신호를 측정하기 전에. 측정의 끝에서 슈퍼 네티텐트를 흡인하고, 입증 된 대로 리사 버퍼와 거래 된 293 T 셀을 블리빙. 전체 세포 용액 샘플을 9~ 12% 폴리아크릴아미드 전기포레시스 젤에 0.1%SDS로 실행합니다.반딧불이 루시파라제 RAF 돌연변이의 종말 종단의 발현 수준을 감지하거나, 반딧불 루시파라기 RAF 돌연변이의 C 종점은 입증된 바와 같이 안티 플래그 아미노 블롯에 의한 반딧불 루시파라기 RAF 돌연변이의 종자. 그런 다음 반딧불 루시파라제와 반딧불 루시파라제 RAF 돌연변이체의 C 종단의 발현 수준에 따라 293 T 세포 경피제의 루시파래아제 신호를 정규화한다. 체외 키나아제 아사는 일부 구성 활성 R-척추 돌연변이체의 촉매 활성을 효과적으로 조사하는 데 사용할 수 있지만, 융합된 C-척추를 가진 키나아제 죽은 돌연변이의 활성은 그렇지 않습니다.그러나 약한 이질친 친화성 또는 안정성을 가진 구성 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성은, 정화 과정에서 그들의 희미한 자가 파손되기 때문에 이 ASA를 사용하여 조사되지 않을 수 있다. 약한 이질친 친화성 또는 안정성을 가진 RAF 돌연변이의 촉매 활성의 손실을 피하기 위해, 이러한 돌연변이는 돌연변이의 촉매 활성을 구출하기 위해 글루토티오나 트랜스포아제와 융합될 수 있다. RAF 공동 활성화 ASA는 키나아제 죽은 RAF 돌연변이의 알로스터 활성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.산성 말단 모티프 및 C 척추 융합을 가진 키나아제 죽은 돌연변이체와 같이, 알로스테릭 활성제로서 기능하여 293T 세포에서 공동 발현될 때 비 인광체 절제성 산성 말단 모티브를 가진 돌연변이체의 촉매 활성을 유발한다. 또한 무료 분할 루시파라제 SA는 RAF 가족 키나아제 및 돌연변이의 상대적인 이머 친화성 또는 안정성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 세제의 농도가 낮은 리사 버퍼를 사용하고, 시료 정제 시 빠른 부드러운 세척 절차는 시험관내 키나아제 SA에 필수적이다. 이 기술은 연구원이 질병이 RAF 돌연변이를 중계하고, 다운스트림 통로를 활성화하고, 질병 처리를 위한 적당한 치료 전략의 선택을 촉진하는 방법을 정확하게 결정하는 것을 도울 것입니다.

characterize-disease-related-mutants-raf-family-kinases-using-set

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.

키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

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Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

학습하세요 RAF 키나아제 돌연변이체의 질병 관련 특성화를 위한 민감하고 재현성 높은 생화학적 방법을 통해 세포 신호 전달 메커니즘을 이해하고 치료 전략을 개발하는 데 활용하세요.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

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