Name: 온도 제어 기능을 갖춘 수직 관찰을 위한 현미경 단계 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 학습하세요 온도 제어 기능을 갖춘 수직 현미경 단계 제작 방법을 통해 생물 샘플의 중력 영향 및 온도 의존적 행동을 관찰하는 기술을. 이 프로토콜은 신경과학 및 생물학 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Drum, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscope+Observations+of+Diatos%5BTitle%5D)+AND+%22Osterreichische+Botanische+Zeitschrift%22%5BJournal%5D)">Electron Microscope Observations of Diatos.</a> Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321(1969).</li>
<li>McBride, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+Random+Distributions+of+Datom+Values+on+Microscope+Slides%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceangraphy%22%5BJournal%5D)">Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides.</a> Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).</li>
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<li>Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sideSPIM+-+selective+plane+illumination+based+on+a+conventional+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope.</a> Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).</li>
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<li>Claudet, C., Bednar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-optical+tweezers+built+around+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope.</a> Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).</li>
<li>Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+analysis+and+ultrastructural+study+of+a+colonial+diatom%2C+Bacillaria+paxillifer%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer.</a> Microscopy. 65, 211-221 (2016).</li>
<li>Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+modalities+and+responses+to+environmental+changes+of+the+mudflat+diatom+Cylindrotheca+closterium+%28Bacillariophyceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phycology%22%5BJournal%5D)">Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae).</a> Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).</li>
<li>Bannon, C. C., Campbell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinking+towards+destiny%3A+High+throughput+measurement+of+phytoplankton+sinking+rates+through+time-resolved+fluorescence+plate+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy.</a> PLoS One. 12, 16(2017).</li>
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<li>Edgar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+Locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Computer-Assisted+Analysis+of+Cine+Film+British+Phycological+Journal%22%5BJournal%5D)">Diatom Locomotion.</a> Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).</li>
<li>Iversen, M. H., Ploug, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effects+on+carbon-specific+respiration+rate+and+sinking+velocity+of+diatom+aggregates+-+potential+implications+for+deep+ocean+export+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes.</a> Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).</li>
<li>Riebesell, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sinking+and+Sedimentation-Rate+Measurements+in+a+Diatom+Winter+Spring+Bloom%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom.</a> Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).</li>
<li>Drum, R. W., Hopkins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+Locomotion+-+An+Explanation%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Diatom Locomotion - An Explanation.</a> Protoplasma. 62, (1966).</li>
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움직이는 규조류 세포의 궤적 분석은 규조류 운동성을 평가하는 데 유용한 접근법입니다. 그러나, 일반적인 반전된 현미경은 견본을 수평으로 관찰하는 동안, 수직 방향으로 중력 또는 부동 운동의 영향의 관측에 적합하지 않습니다. 여기에서 개발되고 기술된 것은 온도 제어를 가진 수직 현미경 단계이고 90°에 의해 회전된 반전된 현미경에 붙어 있습니다. 온도 조절이 있는 이 현미경 단계는 규조류 세포의 온도 의존적 수직 운동을 관찰할 수 있게 합니다.
프로토콜 내에서 중요한 단계는 컨트롤러 회로 설계입니다. 안전을 보장하기 위해 차단기 회로가 구현되었습니다. 센서가 샘플에서 분리되거나 마이크로 컨트롤러가 제대로 작동하지 않으면 히터에 대한 전류가 마이크로 컨트롤러와 다른 회로에 의해 차단됩니다.
제어 계통이 히터의 전류를 제어하기 위해 PID 시스템을 채택했기 때문에 PID의 최적의 파라미터를 찾는 기술이 필요합니다. 기존 방식과 비교하여...

광학 현미경 검사법은 렌즈와 가시광선을 가진 견본의 확대를 통해 관찰 가능한 세부사항을 증가하기 위하여 이용된 기술입니다. 광학 현미경 검사법에서 빛은 시료로 전달된 다음, 관찰을 위해 돋보기를 통해 투과, 반사 또는 형광광을 포착합니다. 현미경의 각종 모형은 다른 용도 및 관측 방법을 수용하기 위하여 디자인에 있는 다른 유효합니다. 다른 디자인은 위에서 관찰을 위해 아래에서 견본을 점등하기 위하여 구조물로 구조되는 직립 현미경을 포함하고, 아래에서 관찰을 위해 위에서 견본을 점등하는 반전한 현미경을 포함합니다. 직립 현미경은 가장 일반적이고 널리 사용되는 디자인입니다. 거꾸로 된 현미경은 종종 용기의 바닥에 부착 배양 세포와 같은 위에서 가까운 거리에서 렌즈를 허용 할 수없는 샘플을 관찰하는 데 사용됩니다. 많은 연구 그룹은 반전 현미경1,2,3,4,5,6,7을사용하여 다양한 분야에서 관찰을보고했다. 반전 된 현미경 8, 9,10,11,12,13의 특징을 활용하는 많은 추가 장치가 개발되었습니다. .
현재 모든 종래의 현미경 설계에서 현미경 단계는 수평이므로 중력, 부력, 운동 등으로 인해 수직 평면에서 움직임을 생성하는 샘플의 관찰에 적합하지 않습니다. 이러한 관찰을 가능하게 하려면 현미경 단계와 광 경로를 수직으로 회전시켜야 합니다. 수직 단계는 유리 슬라이드 또는 페트리 접시와 같은 샘플 용기를 무대에 수직으로 장착하는 데 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 90 °로 기울어진 옆으로 반전 된 현미경이 이미 고안되었습니다. 그러나 테이프 또는 기타 접착제로 샘플을 부착해도 장기적인 부동이 발생하지 않습니다. 여기서 설명된 것은 필요한 안정성을 달성할 수 있는 장치이다. 이 장치는 수직 평면에서 샘플 이동 시간에 따라 관찰할 수 있습니다. 실리콘 고무 히터를 장착하면 시료 거동에 대한 온도 변화의 영향을 관찰할 수 있습니다. 온도 데이터는 Wi-Fi를 통해 인터넷 서버로 전송되며 PC 또는 스마트폰에서 원격으로 온도 설정 및 로그 모니터링을 제어할 수 있습니다. 우리의 지식에, 90°에 의해 기울어진 옆으로 기울어진 현미경에 붙어 있던 단계는 아직 이전 연구 결과에서 보고되지 않았습니다.
현미경 단계는 3개의 알루미늄 판으로 이루어진다. 중간 알루미늄 플레이트는 무대에 부착된 하부 알루미늄 플레이트에 장착됩니다. 온도 센서를 포함하는 실리콘 고무는 중간 및 상부 알루미늄 플레이트 사이에 부착됩니다. 고무 밴드는 샘플을 부착하는 데 사용됩니다. 발톱은 고무 밴드를 고정하기 위해 상부 알루미늄 판의 왼쪽과 오른쪽 4 개 점에 부착됩니다. 온도 조절기의 제어 회로는 실리콘 고무에 내장된 온도 센서로부터 신호를 수신하고 펄스 폭 변조(PWM) 방법에 의해 전력을 조절한다. 온도는 1°C 단위로 50°C로 점진적으로 증가될 수 있다. 이 장치는 수직 샘플 모션이 온도에 따라 달라질 수 있는 응용 제품에 유용합니다.
이 보고서는 규조류의 부동 현상에 대한 온도 영향의 예를 제공합니다. 규조류 관측 연구의 예로, 세포 군집의 침전 속도 측정, 운동 분석, 초미세 구조 연구 등14,15,16,17등이 보고되었다. , 18세 , 19세 , 20개 , 21세 , 22세 , 23. 광합성 유기체와 함께 물에 떠있는 규조류의 비중은 물보다 약간 높기 때문에 가라 앉는 경향이 있습니다. 그러나 약간의 대류가 발생하면 상승합니다. 이 현상을 연구하기 위해 유리 슬라이드가 현미경 단계에 수직으로 부착되고 규조류 수직 운동에 대한 온도 상승의 효과가 관찰됩니다.

<table><tbody><tr><td>AC 어댑터 12V2A</td><td>아키즈키 전철 통쇼 주식회사</td><td>AD-D120P200</td><td>일본 도쿄</td></tr><tr><td>ADS1015 기판</td><td>Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.</td><td>adafruit 제품 ID: 1083</td><td>일본 도쿄알루미늄</td></tr><tr><td>플레이트(뒷면 플레이트)</td><td>Inoval Co., Ltd.</td><td>W 150mm&times; L 200?&times; T 1.5mm</td><td>일본 기후현</td></tr><tr><td>알미늄 플레이트(앞판)</td><td>Inoval Co., Ltd.</td><td>W 150mm&times; L 200?&times; T 2mm</td><td>일본 기후현</td></tr><tr><td>알미늄 플레이트(중간 하부 플레이트)</td><td>Inoval Co., Ltd.</td><td>W 150mm&times; L 200?&times; T 4mm</td><td>일본 기후현</td></tr><tr><td>알미늄 플레이트(중간 상부 플레이트)</td><td>Inoval Co., Ltd.</td><td>W 150mm&times; L 200?&times; T 5mm</td><td>일본 기후현</td></tr><tr><td>알루미늄 받침대(하판)</td><td>Inoval Co., Ltd.</td><td>D 100mm&배; T 3mm (30&)</td><td>기후현, 일본</td></tr><tr><td>알루미늄 받침대(상판)</td><td>Inoval Co., Ltd.</td><td>D 100mm&배; T 3mm (30&)</td><td>기후현, 일본</td></tr><tr><td>대담한 변성 기초 담수 영양 용액</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>B5282-500ML</td><td>미국 세인트루이스</td></tr><tr><td>컨트롤러 케이스</td><td>Marutsu Elec Co., Ltd.</td><td>PFF-13-3-9</td><td>일본 도쿄</td></tr><tr><td>CPU</td><td>아키즈키 전철 Tsusho Co., Ltd.</td><td>ESP-WROOM-02D</td><td></td></tr><tr><td>일본 도쿄 도립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX 53</td><td>일본 도쿄</td></tr><tr><td>저온 경화 에폭시 수지 접착제</td><td>(주) ThreeBond</td><td>TB2086M</td><td>일본 도쿄,</td></tr><tr><td>멀티 턴 반 고정 볼륨 수직 형 500 &Omega;</td><td>주식회사 아키즈키 전철 츠쇼</td><td>3296W-1-501LF</td><td>일본</td></tr><tr><td>도쿄 OLED 모듈</td><td>Akihabara Inc.</td><td>M096P4W</td><td>일본 도쿄</td></tr><tr><td>프레스 코르크 (지지전극용) (Tera</td> <td>Co., Ltd.)</td><td>W 42mm&타임스; L 30?</td><td>이시카와현, 일본</td></tr><tr><td>프레스 코르크 (하부 디스크)</td><td>Tera Co., Ltd.</td><td>D 100mm&배; T 0.5mm (20&C)</td><td>이시카와현, 일본</td></tr><tr><td>프레스 코르크 (상부 디스크)</td><td>Tera Co., Ltd.</td><td>D 100mm&배; T 2.5mm (20&)</td><td>이시카와현, 일본</td></tr><tr><td>로터리 엔코더와 스위치 부착 2색 LED</td><td>아키즈키 전철 주식회사</td><td>P-05772</td><td>일본 도쿄도</td></tr><tr><td>실리콘 고무 히터</td><td>주식회사 쓰리하이</td><td>D 100mm&배; T 2.5mm (20&)</td><td>가나가와현, 일본</td></tr><tr><td>공급자</td><td>:Substrate Seeed Technology Co., Ltd.</td><td>MH5.0</td><td>중국 심천</td></tr><tr><td>온도 센서</td><td>Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.</td><td>NXFT15XH103FA2B050</td><td>일본 도쿄</td></tr><tr><td>3단자 직류 / DC 레귤레이터 3.3V</td><td>마루츠 일렉 주식회사</td><td>BR301</td><td>일본</td></tr><tr><td>도쿄 범용 플렉시블 암</td><td>Banggood Technology Co., Ltd.</td><td>YP-003-2</td><td>중국 홍콩</td></tr><tr><td>USB 케이블 USB-A - MicroUSB</td><td>Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd.</td><td>USB 케이블 A-MICROB</td><td>JAPAN 도쿄, 일본</td></tr><tr><td>비디오 Canera</td><td>Sony Corporation</td><td>HDR-CX590</td><td>일본 도쿄</td></tr></tbody></table>

온도 제어 기능을 갖춘 수직 관찰을 위한 현미경 단계 제작

Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function

견본은 일반적으로 현미경 관찰을 위한 수평 현미경 단계에 두어. 그러나, 샘플에 중력의 영향을 관찰하거나 해상 행동을 연구하기 위해, 현미경 단계 수직으로 만들 필요가있다. 이를 위해 90°로 기울어진 옆으로 뒤집힌 현미경이 고안되었습니다. 이 현미경으로 샘플을 관찰하려면 페트리 접시 또는 유리 슬라이드와 같은 샘플 용기를 수직으로 스테이지에 고정해야 합니다. 수직 현미경 단계에서 샘플 용기를 고정할 수 있는 장치가 개발되어 여기에 설명되어 있습니다. 이 장치를 스테이지에 부착하면 수직 평면에서 샘플 역학을 관찰할 수 있습니다. 실리콘 고무 히터를 사용하여 온도를 조절하는 기능은 온도 에 의존하는 샘플 거동을 관찰할 수 있게 합니다. 또한 온도 데이터는 인터넷 서버로 전송됩니다. 온도 설정 및 로그 모니터링은 PC 또는 스마트폰에서 원격으로 제어할 수 있습니다.

도 2는 고무 히터의 온도 분포를 나타낸다. 고무 히터의 표면 온도는 각 온도에서 균일했다. 그림 3은 온도 변화를 설정하기 위해 측정된 온도의 응답성을 보여줍니다. 주황색 선은 설정된 온도를 나타내고 파란색 선은 샘플 온도의 변화를 보여줍니다. 설정 변경에 대한 측정값의 오버슈트가 작고 추적이 빠를 수 있습니다.
규조류 세포는 이 장치의 사용에 대한 구체적인 예를 제공하는 것으로 관찰되었다. 움직이는 규조류 세포의 궤적 분석은 규조류 세포의 운동성을 평가하는 데 유용한 접근법입니다. 그러나, 정상적인 반전된 현미경이 시료를 수평으로 관찰하지만, 중력의 영향이나 수직 방향으로의 부동 움직임의 관찰에는 적합하지 않다.
<p class="jove_cont...

여기에 제시된 샘플 용기를 수직 현미경에 장착할 수 있는 온도 제어 현미경 단계를 사용하는 프로토콜이 제시된다.

Samples are usually placed onto a horizontal microscope stage for microscopic observation. However, to observe the influence of gravity on a sample or ...

이 장치는 중력의 영향을 관찰하고 관심있는 샘플에 작업 할 수 있도록 수직 현미경 단계에 샘플을 고정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 장치를 단계에 부착하면 수직 프레임에서 샘플 역학을 관찰할 수 있으며 온도 의존식 샘플 동작의 관찰을 허용합니다. 알루미늄 플레이트를 제작하려면 레이저 가공 기계를 사용하여 150에서 200까지 101mm 의 구멍을 2밀리미터 알루미늄 플레이트로 절단하여 최전선 플레이트로 사용할 수 있습니다.접시 바깥쪽 의 8개 지점에서 발톱을 만들어 두 개의 고무 밴드가 접시의 길이 또는 너비에 걸쳐 부착되도록 합니다. 다음으로 150~200mm 의 중앙에 130mm 구멍을 잘라 5mm 알루미늄 플레이트를 중간 상부 플레이트로 사용하고, 접시의 길이 또는 너비에 걸쳐 두 개의 고무 밴드를 배치할 수 있도록 8개의 노치를 만듭니다. 그런 다음 중앙에 130mm 구멍을 150~ 200년까지 4mm 알루미늄 플레이트로 잘라 중간 하부 플레이트로 사용하고, 150~200의 중앙에 30mm 구멍을 잘라 1.5밀리미터 알루미늄 플레이트를 베이스 플레이트로 사용하였다.받침대를 제작하려면 직경 100mm, 두께 3mm 두께의 알루미늄 플레이트의 중앙에 30mm 구멍을 자르고 플레이트 한쪽면에 30mm 깊이의 42mm 너비를 만듭니다. 그런 다음 직경 100mm, 4mm 두께의 알루미늄 플레이트의 중앙에 30mm 구멍을 자르고 플레이트 의 중심에서 25밀리미터 3 개의 3 밀리미터 구멍을 뚫고 서로 120도 간격을 두드냅니다. 압착 코르크 디스크의 제조를 위해 워터 제트 커팅 머신을 사용하여 직경 100mm, 2mm 두께의 압착 코르크 디스크의 중앙에 20mm 구멍을 자르고 42mm 너비를 30mm 깊이로 만들고 4밀리미터 너비를 5밀리미터 깊이로 5밀리미터 깊이로 만듭니다.다음으로 직경 100mm, 1mm 두께의 코르크 디스크의 중앙에 20mm 구멍을 자르고 42mm 너비의 30mm 깊이, 4mm 너비1개를 디스크 의 각 측면에 40mm 깊이로 만듭니다. 그런 다음 42mm 너비를 100mm 직경의 디스크에서 30mm 깊이의 누르는 코르크 플레이트를 잘라냅니다. 실리콘 고무 히터를 제작하려면 직경 100mm, 2.5mm 두께의 실리콘 고무 디스크중앙에 20mm 구멍을 잘라 낸다.그런 다음 조작 된 부품을 설명한 대로 쌓고 필요에 따라 나사 또는 접착제로 적절한 조각을 고정합니다. 전용 케이블을 사용하여 컨트롤러 케이스의 고무 히터와 히터를 통합하여 현미경 단계를 시스템에 연결하고 컨트롤러를 사용하여 Wi-Fi 신호를 장착하고 고무 히터의 전류를 제어합니다. 시스템을 구축한 후, 컨트롤러 케이스의 센서 단말과 테미저 와이어를 연결하고, 테미저에 의해 측정된 온도 신호를 수신한다.컨트롤러의 노브를 사용하여 설정 온도를 변경합니다. 그런 다음 측정된 온도, 설정 온도 및 시간 정보를 컨트롤러에서 서버로 인터넷을 통해 전송합니다. 시료를 분석하려면, 현미경 단계에 샘플을 지면표면에 수직으로 배치하고, 4개의 길이 발톱을 사용하여 두 개의 고무 밴드로 시료를 고정한다.컨트롤러를 사용하여 온도를 섭씨 40도로 설정하고 디스플레이의 온도를 확인합니다. 그런 다음 노브를 눌러 온도 제어를 시작합니다. 파란색 LED가 켜져 열 공급이 개시되었음을 나타냅니다.이 수치에서 고무 히터의 대표적인 온도 분포가 표시됩니다. 고무 히터의 표면 온도는 각 온도에서 균일했다. 여기서, 온도 변화를 설정하는 측정된 온도의 반응성의 예가 도시된다.주황색 선은 설정된 온도를 나타내고 파란색 선은 샘플 온도의 변화를 나타냅니다. 장비가 올바르게 조립되면 측정된 값의 설정 변경에 대한 오버슈트는 일반적으로 작으며 추적이 빠습니다. 본 실험에서, 규음의 온도 의존적인 수직 운동이 성공적으로 기록되어 규음의 수직 운동의 궤적이 검출될 수 있게 하였다.분비 세포의 수직 부동 현상에 열 대류의 효력은 그 때 직접적인 관측에 의해 시각화될 수 있었습니다. 센서가 샘플에서 분리되었거나 마이크로 컨트롤러가 제대로 작동하지 않는 경우 히터의 전류가 마이크로 컨트롤러에서 차단되었는지 확인합니다. 이 방법을 이용하여, 물 에서 유기체의 수직 이동에 온도 변화의 효과를 관찰할 수 있다.현미경에 부착하는 단계의 부분의 구조가 복잡하기 때문에, 미래 연구는 그 구조의 단순화를 다룰 것입니다. 시료를 실온보다 낮게 냉각하려면 향후 작업을 고려 중인 복잡한 냉각 장치가 필요합니다.

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연구

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공학

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상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

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