Name: E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 s
Description: 배우세요 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 해마 및 피질 뉴런을 이용한 신경구 생성 방법. 이 저비용 플랫폼은 신경치료제 선별 연구에 활용됩니다.

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우리는 CSIR-IICB 동물 시설에 감사드립니다. G. D. 감사 ICMR, J. K. 및 V. G. DST 영감 감사, D. M. 그들의 동료에 대 한 인도 DBT 감사. S. G. 친절 하게 SERB (EMR/2015/002230) 재정 지원을 제공 하는 인도를 인정 합니다.

동물과 관련된 모든 실험 절차는 CSIR-인도 화학 생물학 연구소의 기관 동물 윤리위원회 (IICB / AEC / 회의 / 4 월 / 2018 / 1)에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 미디어 준비
<ol><li>폴리-D-리신(PDL) 용액: 탈이온수에서 0.1 mg/mL의 농도로 PDL 용액을 준비하고 사용할 때까지 4°C에 보관하십시오.</li>
	<li>해리 매체: 멸균, 여과 된 탈이온수 1 L에 염화 나트륨 (8 mg / mL), 염화 칼륨 (0.4 mg / mL), 칼륨 인산 염 모노 베이직 (0.06 mg / mL), D-글루코스 (1 mg / mL), 나트륨 인산염 디베이직 (0.479 mg / mL), 및 1 M HEPES [4-(2-하이드록세틸)-1-피페라진에설포닉 산; 10 mM]. 모든 성분을 소용돌이로 적절히 혼합하고 사용할 때까지 4°C에 보관한다. 참고: 해리 시에는 얼음-차가운 형태로 해리 배지를 사용하지만 실온(RT)에서는 세척 및 기타 용도로 사용하십시오.</li>
	<li>도금 매체: 도금 매체는 다음과 같은 것으로 구성됩니다: 최소 필수 배지 (MEM) 이글의 얼의 균형 잡힌 소금 용액 (BSS; 88.4%), D-포도당 (0.6%), 말 혈청 (10%), 페니실린/연쇄상 구균 (1%). 구성 요소를 각각의 비율로 결합하고 멸균 조건하에서 후드 내부의 절차를 수행합니다. 참고: 모든 성분의 열화를 방지하기 위해 항상 신선하게 준비된 도금 매체를 사용하십시오.</li>
	<li>유지 매체: 신경기재(97%), 0.5 mM 상업적으로 얻은 글루타민 샘플, B27 혈청 프리 보충제(2%), 페니실린/스트렙토마이신(1%)의 각각 비율로 다음을 결합하여 유지 매체를 준비한다. 구성 요소를 각각의 비율로 결합하고 멸균 조건하에서 후드 내부의 절차를 수행합니다. 모든 구성 요소가 새로 준비되었는지 확인하십시오.</li>
</ol>2. 커버립준비
<ol><li>직경 12mm의 둥근 유리 커버슬립을 가지고 4시간 동안 1M 염산(HCl)에 담가 둡니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게를 사용하여 증류수에 덮개를 옮기고 산을 완전히 제거하기 위해 부드럽게 돌십시오.</li>
	<li>100% 에탄올이 함유된 비커에서 세척된 커버슬립을 추가로 세척합니다.</li>
	<li>커버립을 사용하기 전에 티슈 페이퍼에 보관하여 층상 후드에서 잘 건조시십시오.</li>
</ol>3. 뉴런 배양용 폴리-D-리신 코팅 플레이트 준비
<ol><li>24 개의 웰 플레이트를 가져 가라 : 고밀도 도금용과 저밀도 도금용 다른 플레이트. 멸균 패킷은 층상 후드 내부에서만 엽니다.</li>
	<li>24 웰 플레이트에 12mm의 멸균 유리 커버립을 옮김을 옮김.</li>
	<li>300 μL의 PDL 용액(탈이온수에서 0.1 mg/mL)을 각 우물에 부어 커버슬립의 표면을 완전히 덮습니다.</li>
	<li>건조를 방지하고 CO2 인큐베이터에 밤새 보관하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 감싸십시오.</li>
	<li>다음날(도금 전) PDL 용액을 흡인하고 300 μL의 멸균 탈이온수로 2~3회 제대로 세척한다.</li>
	<li>갓 제조된 도금 매체 200 μL을 추가하고 도금될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 되돌려 보냅니다.</li>
</ol>4. 태아의 제거 및 참수
참고: 알루미늄 호일에 포장된 모든 수술 기구를 121°C(15psi)의 오토클레이브에서 30분 동안 소독하십시오. 여기에는 한 쌍의 무딘 말단 가위, 집게, 미세 집게, 2 개의 미세 가위 및 전체 절차에 대한 하나의 동맥 집게가 포함됩니다.
<ol><li>뉴런과 신경구를 생성하기 위해, 시간 적 임신 한 Sprague Dawley 쥐를 사용하고 질 플러그 검출을 E0로 하루를 표시하십시오. 참고: E14-E16 간에 문화권이 수행되어야 합니다.</li>
	<li>문화의 날에멸균 유리 페트리 플레이트를 얼음 위에 놓고 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 채웁니다.</li>
	<li>E14-E16 임신 한 쥐를 복강 내 (즉)의 체외 (즉)로 마취시키고 체중 90 mg의 케타민 / kg과 10 mg의 자일라진 / kg을 주입 한 다음 자궁 경부 탈구를 수행하여 희생하십시오. 참고: 쥐는 또한 자일라진 또는 다이아제팜과 함께 펜토바르비탈또는 케타민과 과다 복용하여 안락사시킬 수 있습니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 분사하여 댐의 복부를 살균하고 멸균 집게와 무딘 끝 가위를 사용하여 복부 부위에 V 자른자를 만듭니다.</li>
	<li>차가운 HBSS 용액으로 페트리 플레이트에 조심스럽게 배아 주머니를 가져 가라. 참고 : 내부 장기를 오염시킬 수 있기 때문에 피부에 방금 사용 된 것과 동일한 집게와 가위를 사용하지 마십시오. 내부 장기에 다른 가위/집게 세트를 사용합니다.</li>
	<li>신선하고 차가운 HBSS에서 배아 주머니에서 배아를 꺼내십시오.</li>
	<li>멸균 가위로 머리를 참수하십시오.</li>
</ol>5. 해마와 피질의 뇌와 해부제거
<ol><li>시작하기 전에 차갑고 멸균된 HBSS로 90mm 멸균 페트리 접시를 채우소서.</li>
	<li>멸균, 무딘 종료 드레싱 집게를 사용하여 멸균 접시에 머리를 전송합니다.</li>
	<li>스테레오 현미경 에서, 멸균, 톱니 모양의 집게와 주전자 영역에서 머리를 잡고 피부와 두개골을 열어 절단하여 뇌를 제거합니다.</li>
	<li>HBSS 용액에서 동일한 방식으로 모든 배아 뇌를 수집합니다.</li>
	<li>뇌간을 잡고 반구와 중뇌에서 모든 수막을 제거합니다.</li>
	<li>조심스럽게 해마와 피질을 포함하는 버섯 모자를 닮은 그대로 반구를 제거합니다.</li>
	<li>10 mL의 해리 배지를 포함하는 15 mL 원엽 관에서 피질 및 손상되지 않은 해마를 포함하는 반구를 수집합니다.</li>
</ol>6. 피질 과 해마 조직을 단일 뉴런으로 해리
<ol><li>수집 된 조직이 정착하고 해리 매체를 흡인하게하여 배지의 5 %-10 %를 남깁니다.</li>
	<li>조직에 신선한 해리 배지 10 mL를 추가하고 6.1 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>해리 배지 4.5 mL과 0.25% (1x) 트립신 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세테이트) 용액을 추가하십시오.</li>
	<li>소화가 진행될 수 있도록 조직을 인큐베이터에 37°C에서 20분 동안 유지한다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 소화된 조직에 연속적으로 해리 및 도금 배지10 mL를 첨가한다.</li>
	<li>소화 된 조직이 정착하고 해리 배지를 흡인할 수 있도록하십시오. 도금 매체 2.5 mL를 추가하고 90mm 멸균 접시의 베이스에 부어.</li>
	<li>1,000 μL 파이펫 팁을 사용하여 접시의 코너 베이스에 있는 소화된 조직을 최소한의 부피를 차지하도록 삼중화한다.</li>
	<li>얻어진 세포 현탁액을 조직의 덩어리를 제외한 70 μm 세포 스트레이너를 통과한다.</li>
	<li>trypan 청색 염료 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 밀도를 결정하고 자동화된 세포 카운터에서 셀 수를 계산합니다.<ol>
<li>트라이판 블루 염료 배제 방법의 경우, 셀 현탁액의 10 μL 및 0.4% 트라이판 블루 얼룩의 10 μL을 취하고, 철저하게 혼합하고, 일회용 챔버 슬라이드의 두 개의 동봉된 챔버 중 하나에 혼합물의 10 μL을 첨가한다.</li>
		<li>혼합물을 포함하는 슬라이드를 셀 카운터에 삽입하고 판독값을 얻습니다. 참고 : 트라이판 블루 염료 배제 방법은 살아있는 세포 (그대로 막으로 인해)가 trypan 파란색 염료를 배제하고 따라서 쉽게 트립팬 블루를 차지하고 파란색으로 나타나는 실행 불가능한 세포에 비해 명확한 세포질이 표시된다는 원리를 기반으로합니다. 색상15.</li>
	</ol></li>
	<li>도금 배지각각 30 mL를 함유하는 두 개의 분리된 튜브에서 저밀도를 위해 플레이트 1.5 x 105 셀/mL및 저밀도20,000 셀/mL에 얻어진 셀수를 희석한다.</li>
	<li>이전에 첨가된 도금 배지를 각각의 웰 및 플레이트 500 μL의 도금 배지에 분산하여 각 웰에 도금 배지에 분산하였다.</li>
	<li>그 후 플레이트를 37°C및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이터로 되돌린후.</li>
	<li>도금 후 현미경 4시간 하에서 순응도를 검사합니다.</li>
	<li>두 플레이트에 세포의 적절한 순응도가 있는 경우, 각 우물의 배지를 500 μL의 신선한 유지 보수 배지로 교체하고 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>이러한 뉴런을 30일 동안 저밀도로 성장시켜 유지 매체를 주당 2회 변경하여 배양하였다.</li>
	<li>동일한 유지 보수 배지에서 고밀도 도금 뉴런으로부터 얻어진 신경구를 초저 부착 판으로 이송하여 배양한다.</li>
	<li>뉴런과 신경구를 중요한 마커로 면역으로 염색하여 특성화합니다. 면역 세포 화학의 경우, 먼저 플레이트 자체에서 30 분 동안 4 % 포름 알데히드를 사용하여 세포 / 신경 구를 수정 한 다음 0.1 % 비 이온 성 세제로 세포를 10 분 동안 투과시하십시오.</li>
	<li>인산완충식염수(PBS)에서 뉴런(anti-Tuj1, GFAP, O4, 타우) 및 신경구(anti-Nestin, GFAP, Tuj1)에 대한 1차 항체를 1:300 농도에서 첨가하고 4°C16에서밤새 배양한다. 참고: Tuj1(클래스 III β-tubulin) 및 타우는 1차 뉴런에 대한 양성 마커이며, GFAP(신경교섬유 산성 단백질) 및 O4(올리고엔드로시테 마커)는 1차 뉴런에 대한 음성 마커(17,18)이다. 신경구의 경우, Tuj1, GFAP 및 네스테틴은 모두19,20의 양성 마커역할을 한다.</li>
	<li>다음날, PBS로 세포를 한두 번 세척하고 2 시간 동안 RT에서 1:600 농도에서 PBS에 적절한 이차 항체를 추가하십시오. 참고: 항마우스 또는 항-토끼 이차 항체는 첨가된 1차 항체의 숙주 종에 따라 선택된다. 이차 항체는 형광 현미경 검사법 목적에 적합한 형광 유도체에 공액되어야한다는 것을 명심해야합니다.</li>
	<li>한 두 번 PBS로 세포를 다시 씻으십시오.<ol>
<li>Hoechst 33258 (탈이온수에서 1 mg / mL 스톡 솔루션)으로 세포의 핵 염색을 수행하십시오. 스톡 솔루션에서 PBS에서 0.1% Hoechst 솔루션을 준비하고 셀에 추가합니다.</li>
		<li>세포를 0.1 % Hoechst 용액으로 30 분 동안 배양 한 다음 PBS로 다시 씻으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이드에 20 μL PBS(또는 장착 매체)를 추가하고 염색된 셀이 포함된 커버슬립을 PBS를 포함하는 슬라이드 영역에 천천히 장착합니다. 디부틸프탈레이트 폴리스티렌 자일렌(DPX)으로 커버슬립의 여백을 밀봉합니다.</li>
	<li>10x 및 40x 배율로 현미경으로 고정 된 세포의 이미징을 수행합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 1차 뉴런의 세포 도금 밀도를 변경함으로써, 2개의 가변 뉴런 플랫폼이 수득되는 방법을 설명한다. 이것은 간단한 방법이지만 원하는 결과를 얻으려면 각 단계를 세심하게 수행해야합니다. 다른 이전 방법 중 장기 기본 신경 문화 또는 신경 구 배양 보고. 대부분의 기본 신경 문화 프로토콜에 대 한 해 마 뉴런의 배양을 포함 했다 3-5 주, 하지만 대부분 실패, 뉴런 죽고 연결의 손실로 인해 멀리 시들어. 프로토콜의 또 다른 장점은 신경 세포가 신경 교인 피더 층에 대한 필요없이 배양 될 수 있다는 것입니다, 따라서 뉴런의 순도를 유지.
그러나 원하는 결과를 얻으려면 몇 가지 중요한 단계를 신중하게 따라야 합니다. 첫째, 전체 멸균 상태를 유지하는 것은 절대적으로 필요하다. 시작하기 전에 70 %의 알코올로 모든 슬래브, 악기 및 수술 도구를 미리 청소할뿐만 아니라 층상 후드에서 대부분의 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 박테리아와 곰팡이에 의한 오염으로 인...

뇌는 신경 세포와 비 신경 세포의 복잡 한 회로. 수년 동안 과학자들은 이 복잡한 기계에 대한 통찰력을 얻기 위해 노력해 왔습니다. 이렇게 하기 위하여는, 신경 과학자는 처음에 조사를 위한 각종 변형된 신경 기지를 둔 세포주에 의지했습니다. 그러나, 이러한 클론 세포주무능력은 강한 시냅스 연결과 적절한 축산 또는 모수석을 형성하는 데 1차뉴런 배양에 대한 과학적 관심을 1,2로이동시켰다. 1 차적인 신경 문화의 가장 흥미로운 양상은 살아있는 신경세포를 관찰하고 조작할 수 있는 기회를 만든다는 것입니다3. 또한, 그것은 신경 조직에 비해 덜 복잡 한, 기능 및 다양 한 신경 단백질의 전송을 공부 하기 위한 이상적인 후보. 최근, 현미경 검사법, 유전체학 및 프로테오믹스 분야의 여러 발전은 신경 과학자들이 신경 문화를 악용할 수 있는 새로운 기회를 창출했습니다4.
1 차적인 문화는 신경 발달의 뒤에 분자 기계장치를 탐구하고, 각종 신경 신호 통로를 분석하고, 시냅스의 더 일관된 이해를 개발하는 신경과학자를 허용했습니다. 여러 가지 방법이 1차 뉴런으로부터의 배양을 보고했지만(대부분 해마기원5,6,7),뉴런의 장기 배양을 가능하게 하는 화학적으로 정의된 배지를 가진 통합 프로토콜은 여전히 필요합니다. 그러나, 저밀도에서 도금된 뉴런은 인접 한 뉴런 및 신경교 세포에 의해 제공되는 영양 지지부 8의 부족으로 인해 장기적으로 생존하지 못하는 가장 자주 관찰된다. 일부 방법은 심지어 신경교 세포를 가진 1 차적인 신경세포의 공동 배양제안했습니다, 여기서 신경교세포는 피더 층 9로 이용됩니다. 그러나, 신경교 세포는 때때로 신경 성장10을재정의하는 그들의 자라난 때문에 많은 문제를 제기합니다. 따라서, 위의 문제를 고려, 간단 하 고 더 비용 효율적인 기본 신경 문화 프로토콜 필요, 조사에 대 한 신경 생물학자와 신경 화학자 모두에 의해 사용할 수 있는.
1 차적인 신경 문화는 본질적으로 2D 문화의 한 형태이고 두뇌의 가소성, 공간 무결성, 또는 이질성을 나타내지 않습니다. 이것은 신경구11,12에게불린 더 믿을 수 있는 3D 모형을 위한 필요를 초래했습니다. 신경구는 신경 과학자에게 새로운 플랫폼을 제시, 실제에 가까운 유사, 생체 내 뇌13. 신경구는 신경 줄기 세포 (NSC), 신경 전구 세포 (NPC), 뉴런 및 성상 세포가 풍부한 세포의 비 부착 3D 클러스터입니다. 그들은 신경 줄기 세포와 신경 전구 세포의 격리에 대 한 훌륭한 소스, 다양 한 신경 및 비 신경 계보로 분화를 공부 하는 데 사용할 수 있는. 다시, 이전에 보고된 프로토콜을 사용하여 생성된 신경구 배양 내의 가변성은 통합된신경구 배양 프로토콜(14)의 제형에 장벽을 제시한다.
이 원고는 혼합 된 피질 및 해마 배양으로부터 세포 도금 밀도를 번갈아 가며 2D 및 3D 플랫폼을 모두 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 그것은 이내 7 일 자유 부동 신경구는 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리된 고밀도 도금 뉴런에서 얻어진다는 것을 관찰됩니다, 이는 추가 문화에 따라, 방사형 신경교와 같은 확장을 통해 다리와 상호 연결을 형성합니다. 유사하게, 저밀도 도금 뉴런에서, 최대 30일 동안 유지될 수 있는 1차 뉴런 배양은 일주일에 두 번 유지 배지를 변경함으로써 수득된다.

<table><tbody><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Abcam</td><td>AB7260</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Abcam</td><td>AB92391</td><td></td></tr><tr><td>Anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tau</td><td>Abcam</td><td>AB76128</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1</td><td>Millipore</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serum Free Supplement&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>세포 카운터</td><td>생명 기술</td><td>Countess II FL</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose&nbsp;</td><td>SDFCL</td><td>38450-K05</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX83 모델</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>GtXMs IgG Fluor</td><td>Millipore</td><td>AP1814</td><td></td></tr><tr><td>GtXMs IgG(H+L)</td><td>Millipore</td><td>AP124C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SRL</td><td>16826</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Calbiochem</td><td>382061</td><td></td></tr><tr><td>말 세럼&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>RM10674</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Rankem</td><td>H0100</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>BioBase</td><td>BBS-V1800</td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle' 얼과 함께' s BSS&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2279</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Dewinter</td><td>Victory 모델</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 그릇 (24 웰 플레이트, 셀 여과기, 그리고 낮은 접착 플레이트)</td><td>BD 팔콘</td><td>353047, 352350 및 3471</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 페트리디쉬</td><td>Himedia</td><td>PW001</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Millipore</td><td>A.003.E</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 모노베이직&nbsp;</td><td>Merck</td><td>MI6M562401</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Qualigem</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성&nbsp;</td><td>Merck</td><td>MI6M562328</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicrosope</td><td>Dewinter</td><td>Zoomstar 모델</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SRL</td><td>2020130</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0.25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

e14-e16 스프라그 dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

1 차적인 신경 문화는 신경 과학의 필드에 있는 필수적인 기술입니다. 두뇌에 더 깊은 기계론적 통찰력을 얻으려면, 각종 신경생물학 연구 결과를 위해 이용될 수 있는 강력한 시험관내 모형이 필수적입니다. 비록 기본 신경 문화 (즉, 장기 해 마 문화) 모델 과학자를 제공 했습니다., 그것은 아직 완전히 뇌 네트워크의 복잡성을 대표 하지 않습니다. 이러한 한계의 여파로, 새로운 모델은 신경 구를 사용하여 등장했다, 이는 뇌 조직에 가까운 유사성을 곰. 본 프로토콜은 배아일 14-16 스프라그 다울리 래트의 배아로부터 분리된 혼합 된 피질 및 해마 뉴런의 높고 낮은 밀도의 도금을 기술한다. 이것은 추가 연구를 수행하기 위하여 2개의 독립적인 적인 단자로 신경구 및 장기 1 차적인 신경 문화의 생성을 허용합니다. 이 과정은 매우 간단 하 고 비용 효율적인, 그것은 여러 단계를 최소화 하 고 시약 이전에 신경 문화에 대 한 필수적인 것으로 간주. 이것은 달성 가능한 결과로 수행 될 수 있고 신경 과학과 관련된 다양한 연구에 더 많이 사용될 수있는 최소한의 요구 사항을 가진 강력한 프로토콜입니다.

이 프로토콜에서는, 2개의 다른 신경 검열 단자에서 가변 세포 도금 밀도가 얻어지는 간단한 전략이 해명되었습니다. 도 1A,B는 각각 고밀도 및 저밀도 도금 세포에서 뉴런을 도금한 후 4시간 후에 세포의 순응도를 나타낸다. 도1에 도시된 바와 같이 뉴런의 적절한 순응도를 관찰함에 따라, 도금 배지는 각각의 웰에서 유지 보수 배지로 대체되었고, 이에 따라 37°C에서 인큐베이터로 복귀하였다. 비교적 더 많은 세포 순도가 고밀도 도금 뉴런에서 관찰되었다. 도금의 24시간 후, 고밀도 및 저밀도 도금 뉴런모두 도 2A,B에서 차동 간섭 대비(DIC) 이미지에서관찰된 바와 같이 정교한 뉴런 확장 및 시냅스 상호 연결을 보였다.
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여기에 제시된 것은 고밀도 도금 뉴런으로부터 신경 전구 세포에서 농축된 신경구의 자발적인 생성을 위한 프로토콜이다. 동일한 실험 동안, 뉴런은 낮은 밀도에서 도금 될 때, 프로토콜은 또한 장기간된 기본 쥐 신경 배양 결과.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 신경 치료 리드의 효과를 연구하기위한 견고하고 저렴한 플랫폼을 제공하기 위해 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리 된 혼합 1 차 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구체의 발달을 입증하는 것입니다. 아시다시피, 뇌는 많은 수의 지원 세포와 관련된 뉴런의 복잡한 네트워크입니다. 뇌 기능을 이해 하려면, 종종 연구의 대부분은 시험 관 실험에서 다시 시작, 시판 되 고 사용할 수 있는 신경 계보 파생 된 세포주를 포함.그러나, 이 세포주는 genotypic 및 phenotypic 변이로 손해를 입는 세포주를 변형합니다. 이 문제를 해결 하기 위해, 기본 신경 문화는 적합 한 접근. 여기에서, 우리는 1 차적인 신경세포를 배양하기 위하여 간단하고 비용 효과적인 프로토콜을 설명하고 각종 신경 치료단을 위한 강력한 검열 플랫폼을 구축했습니다.이 프로토콜의 주요 장점은 세포 도금 밀도를 조절하는 것만으로저밀도가 장기간 1차 신경 배양으로 이어지고 고밀도가 자발적인 신경구를 생성하는 두 개의 대조적인 뉴런 배양 플랫폼을 선보일 수 있다는 것입니다. 24웰 플레이트 두 개를 가져 가라. 하나는 고밀도, 저밀도 도금용.멸균 유리 커버립 12mm를 24웰 플레이트에 옮기. 전체 커버슬립의 표면을 완전히 덮는 방식으로 각 웰에 300 마이크로리터의 PDL 용액을 붓습니다. 탈온화 된 물에 0.1 mg / mL의 농도로 PDL 용액을 준비합니다.알루미늄 호일로 플레이트를 감싸서 건조를 방지하고 하룻밤 동안 CO2 인큐베이터에 보관하십시오. 다음 날, 도금 전에 PDL 솔루션을 흡인합니다. 멸균물로 2~3회 제대로 씻으시다.그런 다음 도금 매체를 추가하고 도금 될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다. E14-E16 시간 임신 한 Sprague-Dawley 쥐를 희생하고 멸균 집게와 무딘 끝 가위를 사용하여 복부 부위의 V 자형 컷을 만듭니다. 모든 태아를 제거하고 조심스럽게 차가운 HBSS 용액으로 페트리 플레이트에 놓습니다.배아 주머니에서 배아를 꺼내 서 신선한, 차가운 HBSS에서 별도 페트리 접시에 그들을 정중 하 게 세척. 멸균 가위의 도움으로 머리를 참수. 차가운 HBSS로 멸균 90mm 페트리 플레이트에 머리를 옮춥춥시다.스테레오 현미경의 밑에, 멸균 톱니모양의 집게로 주아웃 부위에서 머리를 잡고, 피부와 두개골을 잘라서 뇌를 꺼낸다. 뇌간을 잡고 반구와 중뇌에서 모든 수막을 제거합니다. 해마와 피질이 들어 있는 버섯 캡을 닮은 그대로 반구를 조심스럽게 제거하십시오.10mL의 해리 미디어를 포함하는 15mL 원심관에서 피질과 그대로 해마를 포함하는 반구를 수집합니다. 수집된 조직이 정착하고 해리 매체를 흡인하여 배지의 5~10%를 그대로 둡시합니다. 다시, 그것에 신선한 해리 매체의 10 mL을 추가하고 두 번이 단계를 반복합니다.4.5mL의 해리 매체와 트립신-EDTA 용액의 0.5mL를 추가합니다. 소화가 진행될 수 있도록 섭씨 37도에서 인큐베이터에 보관하십시오. 배지를 흡기하고 10mL의 해리 매체및 도금 매체로 연속적으로 세척한다.도금 매체의 2.5mL에서 다시 중단하십시오. 90mm 멸균 접시를 접시의 반전 커버 위에 보관하고 90mm 멸균 접시에 붓습니다. 1000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 접시의 모퉁이 베이스에 소화된 조직을 적티드하여 최소 볼륨을 차지합니다.70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 얻어진 세포 현탁액을 통과하여 조직의 덩어리를 제외합니다. trypan 블루 염료 제외를 사용하여 실행 가능한 세포의 밀도를 결정하고 자동화 된 세포 카운터에서 셀 수를 계산합니다. 고밀도 도금용 mL당 5세포의 전력으로 1.5~10을 플레이트로 플레이트할 수 있도록, 30mL의 도금을 함유한 2개의 별도 튜브에서 저밀도 도금에 대해 mL당 20, 000세포를 희석한다.이전에 첨가된 도금 매체및 플레이트 500 마이크로리터를 각각 웰에 도금 매체에 분산시흡시한다. 그 후, 4 시간 동안 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 도금 후 4 시간, 현미경에서 준수세포를 검사.4시간 동안 도금 후, 고밀도 플레이트와 저밀도 플레이트 모두에서 뉴런은 플레이트를 잘 준수합니다. 각 우물의 배지를 신선한 유지 보수 매체의 500 마이크로리터로 교체하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 인큐베이션합니다. 우리는 고밀도 및 저밀도에서 도금이러한 뉴런을 문화해야합니다.저밀도 도금 뉴런은 장기간 배양에 사용할 수 있지만, 최대 30일, 일주일에 두 번 유지 보수 매체를 변경하여 고밀도 도금 뉴런이 신경구를 자발적으로 생성하기 시작하며, 이는 초저부착 플레이트에서 유지한 지 하루 만에 나온 것입니다. 도금 24시간 후, 고밀도 및 저밀도 도금 뉴런 모두 건강한 형태를 나타내기 위해 관찰됩니다. 약 7일 동안 배양된 저밀도 도금 뉴런의 상 대비 이미지가 여기에 전시되어 있다.뉴런은 건강한 형태를 나타내며, 더 활발한 라우팅 및 상호 연결로 최대 30일까지 유지할 수 있습니다. 여기서 바 다이어그램은 MTT 분석에 의해 결정된 바와 같이 30일 간의 문화 후에도 저밀도 도금 뉴런의 약 90%의 생존력을 보여줍니다. 여기에서 1 차적인 뉴런은 Tuj 1, 분화한 뉴런의 마커, 및 타우, 신경 축축의 마커를 가진 면역 염색에 의해 특징지어졌습니다.뉴런의 순도는 성상세포에 대한 비신경 마커 GFAP및 올리고드로키테스에 대한 O4의 염색이 없는 것으로 확인된다. 모든 특성화 연구에서 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 여기서, 저밀도 종자 세포는 성상체 마커 GFAP 및 신경 마커 Tuj 1로 염색되어 최대 7일까지 배양의 순도를 확인하였다.이 프로토콜은 정량 분석을 통해 표시된 대로 성상세포에 대한 뉴런의 우대 성장을 지원하는 것으로 관찰된다. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 유사 하 게, 고밀도 씨드 세포에서, 성상 세포는 Tuj에 의해 GFAP와 뉴런으로 염색 되었습니다 1.여기서, 정량 분석에서, 약 17% 성상세포는 83% 뉴런에 비해 관찰됩니다. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 7 일 후, 고밀도 뉴런에서 자발적으로 형성 된 여러 신경 구가 관찰된다.문화의 약 8~10일, 고밀도 도금 뉴런에서 신경권은 방사형 신경교와 같은 확장으로 구성된 큰 투영과 다리를 형성하기 시작합니다. 검은 화살은 새로 형성된 두 개의 신경구 사이의 다리를 나타냅니다. 살아 있는 죽은 세포 분석은 15 일 동안 신경구에 수행되었습니다.조밀한 Calcein AM 염색에서, 절대적으로 더 프로디듐 요오드 얼룩, 문화에서 신경 구체의 거의 100 % 생존력을 나타냅니다. 여기서 선 그래프는 일 수의 통과와 신경 구의 크기의 확장을 나타냅니다. 신경권의 이 지나치게 얼룩진 심상은 NPC 마커 네스테인과 Tuj 1의 증가한 발현을 통해 신경 전구 세포의 풍부한 인구를 나타냅니다.여기에 신경구는 GFAP의 강한 발현에 의해 표시 된 성상세포의 높은 금액을 보여줍니다, 신경 마커 Tuj의 더 높은 발현과 함께 1. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 그래서 저는 단일 전략에서 2-D 와 3-D 라는 두 개의 플랫폼을 얻을 수 있다는 사실을 고려할 때 우리의 프로토콜이 매우 흥미롭고 흥미롭다고 생각합니다.그리고 이것은 다른 신경 치료 트랙을 선별하기위한 훌륭한 플랫폼이 될 것입니다. 그래서 모든 신경 과학자에게 정말 유용 할 것 같아요. 또 다른 중요한 측면은 우리가 선택하는 신경구가 신경 전구 세포, NPC가 매우 풍부하다는 것입니다.그리고 그들은 뉴런과 비 신경 혈통으로 그들을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 그래서, 정말, 사람들이이 비디오에서 도움을 복용하여이 기술을 마스터 할 수 있다면, 그것은 모든 사람에게 정말 유용 할 것입니다 생각합니다. 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오 프로토콜은 배아 일 14 마우스 뇌의 ganglionic eminences에서 신경 줄기 세포의 분리 및 확장에 대한 neurosphere 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

이 비디오는 1차 신경구의 생성과 분화를 보여줍니다. 제브라피시의 신경줄기세포는 성장인자(growth factor)가 존재할 때 자기재생능력을 가진 자유롭게 떠다니는 신경구체(neurosphere)로 증식하고, 나중에 신경교세포(glial cell)와 뉴런(neuron)으로 분화합니다.

Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells(제브라피시 신경 줄기세포에서 1차 신경구의 생성과 분화)

이 비디오는 신경구 형성 과정과 해마 조직으로부터의 확장 과정을 보여줍니다. 출생 후 생쥐의 신경줄기세포와 전구세포는 이랑 조직을 치열하게 하여 증식하여 1차 신경구를 형성한 다음 다시 파종하여 2차 신경구를 형성합니다.

Formation and Expansion of Neurospheres from a Hippocampal Tissue

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

다 자란 포유류의 척수에는 배양에서 분리 및 확장될 수 있는 신경줄기세포/전구세포(NSPC)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐와 인간 장기 이식 기증자로부터 성인 척수의 뇌실 주위 영역에서 생성된 NSPC의 수확, 분리, 배양 및 전달을 설명합니다.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

송곳니 뇌는 성인 신경 연구에 귀중한 모델입니다. 분리 및 기본 뇌 조직에서 성인 개 해마 신경 전구 세포 확장을위한 프로토콜은 여기에 표시됩니다.

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

우리는 뇌원내에서 신경 전구세포를 배양하고, 대초원의 성인 뇌의 자이루스를 배양하는 조건을 확립하고, 체외 연구의 보완적인 것으로, 사회적 행동과 관련된 기능성 플라스틱 변화의 일부가 될 수 있는 신경성 틈새 시장 간의 성 의존적 차이를 분석하였다.

성인 프레리 볼레스의 신경질성 틈새에서 파생된 신경구 의 문화

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

배우세요 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 해마 및 피질 뉴런을 이용한 신경구 생성 방법. 이 저비용 플랫폼은 신경치료제 선별 연구에 활용됩니다.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

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