Name: 마우스 혈액에서 혈소판의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 배우세요 마우스 혈액에서 혈소판을 정제하는 방법을 iohexol 그래디언트 원심분리를 통해. 정제된 혈소판은 활성화 및 기능 분석에 활용되어 혈소판 생물학 연구에 필수적인 기술을 제공합니다.

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이 작품은 신시내티 아동 연구 재단의 신생 기금 및 M.N.에 신시내티 파일럿 번역 보조금의 대학에 의해 지원 되었다 우리는 그들의 서비스에 대 한 신시내티 어린이 병원 연구 흐름 세포 분석 코어 감사 하 고 싶습니다.

마우스 혈액 수집은 적절 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 수행 해야 합니다.
참고: 혈소판 정제 프로토콜은 도 1의 흐름도에 기재 되어 있다.
1. 피의 수집
<ol><li>항 응고 제와 0.4 mM의 폴 리 프로필 렌 튜브에 3.2%의 7.2 구 연산 나트륨 µ l)을 첨가 합니다.</li>
	<li>
레트로-궤도 출혈을 사용 하 여 C57BL/6 마우스에서 혈액의 약 200 µ L를 수집 합니다. 참고: 혈액은 연령과 성별에 관계 없이 모든 종류의 마우스 스트레인에서 수집 될 수 있습니다.<ol>
<li>모든 유형의 챔버에 아이 소 루 레인 2 mL를 사용 하 여 마우스를 마 취 시킵니다. 참고: 마 취의 깊이는 증가 된 호흡과 운동 감소의 징후에 의해 검사 됩니다. 마우스는 마 취 챔버의 움직임에 반응 하거나 처리 되지 않아야 한다. 마우스가 이동 또는 처리에 반응 하는 경우, 그것은 마 취 챔버에 유지 하기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다.</li>
		<li>1.2.2 마우스 오른쪽 또는 왼쪽 눈 꺼 풀을 열고 눈의 혈관 총에 7.5 센티미터 (0.12 지름) 모 세관을 삽입 합니다.</li>
		<li>모 세관을 한 반 회전 시키면서 모 세관에 압력을가 하 여 혈관을 깨고 혈 류를 시작 합니다. 모 세관 작용으로 채울 수 있도록 수집 유리병 위에 동물을 거꾸로 잡아.</li>
		<li>적절 한 양의 혈액이 수집 되 면, 모 세관을 제거 하 고 30 초 동안가 제와 함께 눈 꺼 풀에 가벼운 압력을가 하 여 안구를 닫으십시오. 출혈이 멈추면 마우스를 케이지로 돌려 출혈을 모니터링 합니다.</li>
		<li>레트로-궤도 출혈 후 1-2 일 외상에 대 한 눈을 확인 합니다. 과정의 결과로 눈에 대 한 중요 한 외상의 징후를 보여주는 연구에서 마우스를 제거 하 고 안락사. 참고: 마우스는 혈액 수집 전에 적어도 2 주 동안 혈소판을 억제할 수 있는 어떤 종류의 치료를 받아야 한다. 혈액 샘플은 마우스 출혈의 1 시간 이내에 혈소판 정제를 위해 사용 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 혈소판 정제
참고: 혈소판 정제는 그들의 분해를 방지 하기 위해 실 온에서 수행 되어야 한다. 시 약 및 기구의 온도는 18 ~ 22 ° c 사이에 있는지 확인 하십시오. 혈소판 분해를 방지 하기 위해, 절차 동안 빠른 피 펫 팅과 활발 한 흔들림을 피해 야 한다.
<ol><li>600의 iohexol 그라데이션 배지 (12% iohexol 분말을 0.85%의 염화 나트륨, 5mm 트리 신, pH 7.2)에 추가 하 여 1.5 mL 튜브에 µ.</li>
	<li>200 µ L의 혈액 샘플을 넓은 보어 파이 펫 팁으로 그래디언트 매체의 상단에 있는 튜브의 측면 아래로 천천히 추가 하 여 혈액과 iohexol 매체가 혼합 되지 않도록 하십시오 (그림 2a).</li>
	<li>느린 가속과 감속을 가진 스윙 버켓로 터에서 20 분 동안 400 x g 의 튜브를 포함 한 시료를 원심 분리 합니다.</li>
	<li>혈소판이 풍부한 층의 대부분을 수집 하 고 RBC 및 WBC 층을 교란 하지 않고 넓은 보어 피 펫 팁을 사용 하 여 혈소판 불량 층 (총 300 400 µ L)의 작은 분 율을 채취 한다 (도 2b). 새 튜브에 혈소판 샘플을 전송 합니다. 참고: 혈소판 수가 적은 혈액 또는 혈액의 작은 양이 사용 되는 경우, 혈소판 풍부 층 및 혈소판 불량 층은 단일 층으로 서 볼 수 있다.</li>
	<li>혈소판 샘플에 1 mL의 PBS를 첨가 하 고, 반전 하 여 혼합 하 고, 800 x g 에서 원심 분리 하 여 진동 하는 버킷로 터에서 20°c에서 10 분간 섞어 줍니다. 용액을 완전히 버리고 200 µ L의 PBS를 추가 하 여 혈소판을 마일드 파이 펫 팅으로 소생 시킵니다. 참고: 이 단계는 선택 사항으로 서, 그 레이디언 트 매 질 및 혈장 단백질을 제거 하 고 트 롬 빈과 같은 작용 제에 대 한 혈소판의 민감도를 증가 시킨다. 원심 분리기는 서로 다른 프로그램을가지고 있기 때문에 원심 분리기의 사용 설명서를 읽으면 느린 가속도/감속을 결정할 수 있습니다.</li>
	<li>혈소판을 계산 하는 새로운 튜브에이 샘플의 30 µ L을 전송 합니다. 나머지 혈소판은 혈소판 활성화, 응집,과 립 방출 등과 같은 생화학 및 생리 적 분석에 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>RNA 또는 단백질 추출의 경우, 혈소판을 펠 렛에 10 분간 800 x g 의 시료로 원심 분리기. 펠 렛을 교란 하지 않고 상층 액을 완전히 버리십시오. 혈소판을 lyse에 RNA 또는 단백질 용 해 완충 제의 원하는 양을 추가 합니다.</li>
</ol>3. 혈소판 계산
<ol><li>자동 세포 분석기를 사용 하 여 희석 및 정제 된 혈소판 (PBS로 2 ~ 5 배 희석) 없이 전체 혈액 세포를 셉니다. 계산을 위해 30 ~ 50 µ L 샘플을 사용 합니다.</li>
	<li>샘플의 부피를 곱하여 혈소판의 총 수를 계산 합니다.</li>
	<li>정제 혈소판의 수율/회수의 백분율을 계산 한다.</li>
	<li>정제 된 혈소판 샘플에서 RBC 및 WBC (희석 50을 PBS로 100)를 혈 세포 계와 현미경으로 셉니다.</li>
</ol>4. 혈소판 활성화
<ol><li>튜브에서 1 ~ 200만 정제 혈소판을 염색 완충 액의 100 µ L에 추가 합니다 (PBS 2% 소 태아 혈 청, FBS).</li>
	<li>다 수의 샘플에 대해, 다음의 1 µ L (0.5 Mg/ml)의 항 체의 마스터 믹스를 만듭니다 Cy7 쥐 안티 마우스 TER 119, PE 쥐 안티 마우스 CD45, FITC 쥐 항 마우스 CD41 및 APC rat 마우스/인간 CD62P (P-selectin)는 RBC, WBC, 혈소판 및 활성화 된 혈소판, 각각. 세포를 염색 하기 위한 튜브에 마스터 믹스를 추가 합니다. 트 롬 빈을 추가 하지 마십시오.</li>
	<li>또 다른 관에서, µ의 염색 완충 액, 및 0.4 mM GPRP 펩 티 드의 최대 100의 순화 한 혈소판의 1에 200만를 추가 하십시오. 트 롬 빈을 추가 하 여 혈소판을 활성화 하 고 4.2 단계 다음에 세포를 얼룩. 참고: GPRP 혈소판 활성화를 통해 응집 또는 응고 형성을 방지 하기 위해 트 롬 빈을 추가 하기 전에 샘플에 추가 해야 합니다. 트 롬 빈 농도는 혈소판의 양호한 활성화를 얻기 위해 최적화 되어야 한다. 혈소판 활성화 후, 이벤트 카운트는 유 세포 분석에 의해 샘플을 획득 하는 동안 감소 된다.</li>
	<li>양성 대조 군으로 서 튜브 및 0.4 mM GPRP 펩 티 드에서 100 µ L 염색 완충 액까지 전 혈의 1 µ L을 첨가 한다. 혈소판을 활성화 하기 위해 트 롬 빈을 추가. 음성 대조 군으로, 염색 완충 액의 100 µ L까지 전 혈의 1 µ L을 추가 합니다. 트 롬 빈을 네거티브 컨트롤 샘플에 추가 하지 마십시오. 4.2 단계에 따라 세포를 얼룩.</li>
	<li>유 세포 분석이 소 타입 컨트롤의 경우, Cy7, pe, fitc 및 APC가 포함 된 5 개의 튜브에 라벨을 부착 합니다. 100 µ L의 염색 완충 액, 1 µ L의 혈액 및 각각의 항 체의 1 µ L을 표지 된 튜브에 추가 하 여 세포를 얼룩 지 게 한다.</li>
	<li>어두운 곳에서 실 온에서 30 분간 얼룩을 내는 샘플을 배양 한다.</li>
	<li>각 튜브에 1 mL의 염색 완충 액을 추가 하 여 시료를 세척 합니다. 실 온에서 5 분 동안 800 x g 에서 원심 분리기. 펠 릿을 분리 하지 않고 염색 완충 액을 조심 스럽게 버리십시오.</li>
	<li>각 튜브에 염색 버퍼의 300 µ L을 추가, 약간 혼합, FACS 튜브로 전송. 염색 된 샘플을 유 세포 측정기로 분석할 때까지 어둠 속에 보관 하십시오.</li>
</ol>5. 혈소판의 유 세포 분석기 분석
<ol><li>
새 실험을 생성 하 고 로그 포워드 분산을 생성 하 고 로그 사이드 분산형 도트 플롯과 Ter119 Cy7), CD45 PE, CD41 FITC 및 CD62P APC (활성 혈소판) 집단에 대해 선택한 게이팅 전략에 따라 게이트를 지정 합니다. FACS 디바 소프트웨어에서 실험.
	<ol>
<li>모집단 탭 아래에서 인구 계층 구조 표시 를 선택 하 여 인구 계층 구조를 엽니다. 게이팅 전략을 확인 하 고 게이트의 이름을 올바르게 변경 하 여 인구 계층 구조를 편집 합니다.</li>
		<li>통계 뷰 만들기를 선택 하 여 통계 보기를 엽니다. 통계 보기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 통계 보기 편집을 선택 하 여 사용자 기본 설정에 따라 통계 보기를 편집 합니다.</li>
		<li>인구에 해당 하는 상자를 두 번 클릭 하 여 레이아웃의 시각적 측면을 향상 시키는 각 게이트에 대 한 색상을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사이토 미터 창에서 매개 변수 탭을 클릭 하 고 매개 변수의 전압을 조정 하 여 플롯에 대 한 관심 인구를 시각화 합니다.</li>
	<li>음의 인구가 양성 인구와 구별 될 수 있도록 각 매개 변수에 대 한 전압을 조정 합니다. 보정 컨트롤에 대 한 샘플을 기록 하기 전에 단일 얼룩진 양수 컨트롤이 눈금에 있는지 확인 합니다 (양수 피크가 오른쪽에 너무 멀리 표시 되는지 확인). 참고: 포지티브 피크가 스케일 오프 인 경우, 전압을 조정 하 여 포지티브 모집단을 확인 해야 합니다.</li>
	<li>보정 컨트롤 (Cy7, pe, FITC 및 APC)에 대 한 단색 스테인드 셀을 기록 합니다.</li>
	<li>포지티브 제어 게이트가 올바르게 설정 되지 않은 경우 전압을 변경 하 여 조정 합니다.</li>
	<li>보정 설정 &Gt; 실험 >으로 이동 하 여 보상을 계산 합니다. 결과 창에 만 적용 을 선택 합니다.</li>
	<li>워크시트 창의 왼쪽 위에 있는 토글 단추를 클릭 하 여 전역 워크시트로 전환 합니다.</li>
	<li>포지티브 컨트롤 샘플을 로드 하 고 충분 한 셀을 확보 하 여 보상과 게이트를 조정 합니다.</li>
	<li>샘플을 다시 로드 하 고 각 플롯이 불 소 크롬 염색 항 체를 기반으로 예상 되는 세포 집단을 표시 하는지 확인 합니다. 획득 및 기록 10만 정제 혈소판에 대 한 전체 혈액 샘플 및 1만 이벤트에 대 한 이벤트. 수집이 완료 될 때까지 샘플을 하나씩 로드 합니다.</li>
	<li>적절 한 플롯과 게이트를 사용 하 여 소프트웨어를 사용 하 여 유 세포 분석기 데이터 분석 (그림 3)</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해관계의 충돌을 선언 하지 않습니다.

일반적으로, 혈소판은 혈액 세포, 세포 파편 및 생화학 적 및 생리 학적 분석 및 요구를 방해할 수 있는 혈장 단백질의 상당수를 포함 하는 혈소판 풍부 혈장을 생성 하는 저속 원심 분리에 의해 격리 됩니다 추가 정제21. 따라서, 주요 오염 물질 없이 순수한 혈소판을 얻을 수 있는 빠르고 간단한 방법을 사용 하는 것이 중요 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 저 속도 원심 분리와 그라데이션 배지를 사용 하 여 마우스 혈액에서 혈소판의 정제를 설명 한다. 이 프로토콜에 사용 되는 파라미터는 수율을 최대화 하 고 혈소판의 분해를 최소화 한다. 상기 구배 매 질 및 혈장 단백질은 혈소판의 민감도를 증가 시킬 수 있는 아 고 니스 트 또는 항 체를 수집 한 후 세척 단계를 포함 함으로써 제거 될 수 있다. 가장 중요 한 것은, 정제 된 혈소판은 휴지기 상태에 있지만, 트 롬 빈과 같은 작용 제의 존재 하에 활성화 될 수 있다. 우리는 트 롬 빈 활동이 다른 한 근원에서 변화 한다는 것을 발견 ...

혈소판은 혈관의 손상에 반응 하 여 혈액 응고의 개시 제로 서 기능 하는 혈액의 구성 요소입니다. 그들은 혈관 벽1을 연결 하기 위해 부상 부 위에 모여 있습니다. 혈소판은 thrombopoietin의 영향 하에 골의 거 핵 구 로부터 유래 된 세포질의 anucleate 단편 및 순환2로 진입 한다. 이들은 대 사적으로 활성인 것으로 간주 되며 혈소판 확산, 응집 및 지 혈 플러그 형성을 초래 하는 세포내 신호 전달 캐스케이드를 활성화 하 여 세포 외 환경을 감지할 수 있는1,3. 지 혈/혈전 증 및 상처 치유 외에4, 혈소판은 숙주 염증 반응, 혈관 신생 및 메타 스타 티 스3,6,7 에서 중요 한 역할을 한다 8.
혈소판은 혈액에서 그들의 생화학 적 및 생리 적 특성을 연구 하기 위하여 순화 됩니다, 다른 혈액 성분에서 자유로운 이어야 합니다. 적혈구 (RBC) 및 백혈구 (WBC)는 혈소판 보다 훨씬 더 많은 rna 및 단백질을 포함 하기 때문에10, 이러한 세포의 적은 수의 존재도 rna의 전사체 및 프로테오 믹 분석을 방해할 수 있습니다 및 혈소판에서 유래한 단백질. 우리는 정제 된 혈소판이 항 GPIIb/IIIa (존/A)와 같은 트 롬 빈 바인드 항 체와 함께 활성화 되 고 전 혈 혈소판 보다 더 효율적으로 항 P-selectin을 발견 했습니다.
혈소판이 깨지기 쉽기 때문에 샘플을 가능한 한 약간 치료 하는 것이 중요 합니다. 혈소판이 활성화 되 면, 그들은과 립 내용물을 방출 하 고 궁극적으로 저하. 따라서, 혈소판의 기능적 성질을 온전 하 게 유지 하기 위해, 분리 시에 혈소판을 유지 하는 것이 중요 하다. 여러 프로토콜은 다양 한 방법에 의해 인간, 개, 쥐 및 비 인간 영장류에서 혈소판의 분리를설명 했다. 일부 방법에는 원심 분리에의 한 혈소판 풍부 혈장 수집, 분리 칼럼에의 한 여과, RBC 및 WBC-특이 적 항 체가 자성 비드에 컨 쥬 게이 션 된 혈소판의 부정적인 선택 등 여러 단계가 필요 합니다. 시간이 많이 걸리고 혈소판과 그 내용물을 저하 시킬 수 있습니다.
포드 및 그의 동료는 iohexol 매체11을 사용 하 여 인간의 혈액에서 혈소판 정제를 설명 했다. 이 방법은 정제 중 혈액 샘플 및 배지와 유사한 양을 사용 한다. 인간은 혈액의 높은 볼륨을 양보 하기 때문에, 혈소판을 정화 하는 것이 상대적으로 쉽다.
Iohexol은 물에 자유롭게 용 해 되 고 핵 산, 단백질, 다 당 류 및 nucleoproteins13의 분별에 사용 되는 범용 밀도 구배 불활성 매 질 이다. 그것은 낮은 삼 투 압이 고 무 독성, 따라서 그것을 손상 되지 않은 살아있는 세포의 정제를 위한 이상적인 매체를 만들기11. 미 립 자형 매 질; 따라서, 기울기에서 세포의 분포는 혈액 세포종, 유 세포 계, 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 될 수 있다. 그것은 희석 후 세포 또는 세포 조각의 효소 또는 화학 반응의 대부분을 방해 하지 않습니다.
마우스는 많은 인간 질병에 대 한 중요 한 동물 모델의 역할을 한다15,16,17,18. 마우스 혈소판의 정제를 설명 하는 몇 가지 출판 문서가 있다19,20. 그러나, 마우스는 혈소판을 순화 하기 어렵게 만드는 혈액의 상대적으로 작은 양을 산출 합니다. 동일한 소량의 그라데이션 배지 및 혈액 샘플이 사용 되는 경우, 혈소판 층은 원심 분리 후에 RBC-WBC 층 으로부터 명확 하 게 분리 될 수 없다. 이 기사에서는 혈액 샘플 부피 및 저속 원심 분리에 비해 3 배 더 많은 iohexol 구배 배지를 가진 마우스 혈소판 정제의 빠르고 간단한 방법을 설명 했습니다. 우리는 또한 트 롬 빈으로 순화 한 혈소판을 활성화 하 고 유 세포 분석 및 현미경 검사 법으로 그들의 질을 조사 했습니다.

<table><tbody><tr><td>APC 쥐 안티 마우스 / 인간 CD62P (P-selectin)</td> <td>Thermoscientific</td><td>17-0626-82</td><td>혈소판 활성화 마커</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브 Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-222-166</td><td>원심 분리기 용 튜브</td></tr><tr><td>FACS DIVA 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td>비 카탈로그 항목</td><td>혈소판 및 전혈</td></tr><tr><td>FACS 튜브</td> 분석 <td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>튜브 흐름 cytomtery</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>staining buffer</td></tr><tr><td>FITC rat anti-mouse CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>Platelets marker</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>Non-catalog item</td><td>혈소판 및 전혈</td></tr><tr><td>분석 FlowJo 소프트웨어 FlowJo</td>, <td>Inc.</td><td>카탈로그 항목이 아닌 항목</td> 혈<td>소판 및 전혈 분석</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>혈소판 응고 형성 방지</td></tr><tr><td>헤마토크릿 모세관 Fisher</td><td>Scientific</td><td>22-362566</td><td>채혈 모세관</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific</td><td>카탈로그 제외 항목</td><td>혈액 세포 분석기</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>세포 계수 챔버</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>마우스 마취에 사용</td></tr><tr><td>현미경 (올림푸스 CKX41)</td><td>올림푸스</td><td>비 카탈로그 항목</td><td>세포 모니터링 및 계산</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>구배 매체</td></tr><tr><td>PE 쥐 안티 마우스 CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>WBC 마커</td></tr><tr><td>PE-Cy7 쥐 안티 마우스 TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>RBC 마커</td></tr><tr><td>피펫 팁 200 &마이크로; L, 광역</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-1A</td><td>혈액 및 혈소판 시료 이송</td></tr><tr><td>Pipet tips 1000 &micro; L, wide-bore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-2C</td><td>혈액 및 혈소판 시료 이송</td></tr><tr><td>인산염 강화 식염수(PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>세척 및 희석용 완충액</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>생리식염수</td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>항응고제</td></tr><tr><td>염색 완충액</td><td>사내</td><td>비카탈로그 품목</td> 세척 <td>및 희석 완충액</td></tr><tr><td>Steile water</td><td>사내</td><td>비카탈로그 품목</td><td>용매</td></tr><tr><td>테이블 상단 원심 분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>스윙 버킷 로터 원심 분리기</td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>효소 연구 Laboratoty</td><td>HT 1002a</td><td>혈소판 활성화 작용제</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>Nycodenz 매체용 버퍼</td></tr></tbody></table>

마우스 혈액에서 혈소판의 정제

Purification of Platelets from Mouse Blood

혈소판은 적혈구 (RBC), 백혈구 및 혈장 단백질이 없어야 하는 기능적 성질을 연구 하기 위해 전 혈에서 정제 됩니다. 우리는 여기에서 혈액 샘플 부피에 비해 3 배 더 많은 iohexol 그라데이션 배지를 사용 하 여 마우스 혈액에서 혈소판을 정제 하 고 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 의 스윙 버킷 회전자에서 원심 분리를 설명 한다. 정제 된 혈소판의 회수/수율은 18.2-38.5%이 고 정제 된 혈소판은 휴지기 상태에 있었고,이는 상당한 수의 RBC 및 WBC를 포함 하지 않았다. 트 롬 빈으로 처리 된 정제 된 혈소판은 그들의 생존 율을 나타내는 최대 93%의 활성화를 보였다. 우리는 순화 된 혈소판이 유 세포 측정 및 현미경 평가를 사용 하 여 충분히 순수한 것을 확인 했습니다. 이러한 혈소판은 유전자 발현, 활성화,과 립 방출, 응집 및 유착 분석에 사용 될 수 있다. 이 방법은 뿐만 아니라 다른 종의 혈액에서 혈소판의 정제를 위해 사용 될 수 있다.

혈소판 정제의 요약은 흐름도 (도 1)에 기재 되어 있다. 단계는 항 응고 제 존재 하에서의 레트로-궤도 출혈을 사용 하 여 마우스에서 혈액의 수집을 포함, iohexol 그라데이션 매체에 혈액 샘플의 추가, 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 에서 스윙 양동이로 터에서 원심 분리. 정제 된 혈소판의 품질은 임의의 오염 세포 및 활성화 된 혈소판을 검출 하기 위해 항 체로 염색 한 후 현미경 및 유 세포 분석기로 평가 되었다.
상기 iohexol 구배 배지와 혈액 샘플은 혈액이 중간에 서서히 첨가 되는 경우 튜브 내에 2 개의 별개의 층을 형성 하였다 (도 2a). 그러나이 단계에서 지연이 있는 경우, 대부분의 혈액 샘플은 배지로 확산 될 수 있으며 혈소판을 정화 하는 것이 어려울 수 있습니다. 넓은 보어 파이 펫 팁 혈소판의 무결성을 유지 하 고 ...

여기서, 마우스 혈액은 항 응고 제의 존재 하에 수집 되었다. 혈소판을 저속 원심 분리를 이용 하 여 iohexol 구배 배지로 정제 하였다. 혈소판은 그들이 가능한 경우 조사 하기 위해 트 롬 빈과 함께 활성화 되었다. 정제 된 혈소판의 품질은 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다.

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

혈소판은 생화학적 및 생리적 특성을 연구 할 때 혈액 세포와 단백질에서 자유로이어야합니다. 따라서, 우리는 마우스 혈액에서 혈소판을 정화하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기술은 요오헥솔 그라데이션 배지 및 저속 원심분리를 사용하여 혈소판을 정화하여 다른 혈액 성분으로부터 혈소판이 명확하게 분리될 수 있습니다.혈소판을 정화하려면 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 새로 수확한 전혈 200 마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브 의 측면 아래로 천천히 혼합하지 않고 600 마이크로리터의 요오헥솔 그라데이션 배지에 겹쳐 놓습니다. 혈소판을 분리하는 스윙 버킷 로터에서 원심분리 후, 새로운 와이드 보어 파이펫 팁을 사용하여 혈소판이 풍부한 층과 혈소판 가난한 층의 작은 부분을 백색 혈전 이나 적혈구 층을 심궁하지 않고 수집합니다. 혈소판 샘플을 새 튜브에 추가하고 혈소판에 PBS 1 밀리리터를 추가합니다.다른 원심 분리를 수행하기 전에 반전으로 혈소판을 혼합합니다. 그런 다음 온화한 파이펫팅으로 PBS의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 혈소판 활성화를 위해, 염색 완충제의 100 마이크로리터를 포함하는 새로운 관에 6개의 혈소판에 1-2 번 10을 전송합니다.0.4 밀리머 GPRP 펩타이드로 보충된 염색 완충제 100 마이크로리터를 함유한 다른 튜브에 1-2회 10회 10회 첨가한다. 혈소판을 활성화하기 위해 GPRP 펩타이드와 튜브에 혈소판을 추가하고 두 튜브모두에 관심있는 항체 칵테일을 추가합니다. 양성 대조군으로서, 0.4 밀리머 GPRP 펩티드를 함유한 튜브에 염색 완충제의 최대 100마이크로리터에 전혈의 마이크로리터 1개를 추가하고, 이러한 혈소판을 활성화하기 위해 혈전을 추가한다.부정적인 대조군으로서 염색 버퍼의 최대 100 마이크로 리터에 전혈 의 마이크로 리터 1 개를 추가하십시오. 그런 다음 항체 칵테일로 두 제어 튜브를 얼룩지게합니다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 후, 튜브 당 신선한 염색 버퍼의 1 밀리리터와 샘플을 씻어.신선한 염색 버퍼의 300 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음 세포 샘플을 빛으로부터 보호된 개별 유동 세포 분석 튜브로 옮기합니다. 혈소판을 유동 세포측정에 의해 분석하려면, 새로운 실험을 생성하고, 로개스믹 측 산란 점 플롯대 로개스믹 전방 산란을 생성한다.필요에 따라 전압을 조정한 후 보정 컨트롤에 대해 단일 색상 염색 셀을 기록합니다. 이제 양수 제어 샘플을 실행하여 보정 및 게이트를 조정할 수 있는 충분한 셀을 획득합니다. 그런 다음 각 혈액 샘플에 대해 100, 000 개의 이벤트를 획득하고 기록하고 적절한 플롯및 게이트를 사용하여 유동 세포 측정 데이터를 분석합니다.혈액이 배지에 천천히 첨가되면 요오헥솔 그라데이션 배지와 혈액 샘플은 튜브내의 두 개의 분리된 층을 형성합니다. 원심 분리 후, 상단, 짚 색 층은 플라즈마를 포함하지만 그대로 혈액 세포가 없습니다. 두 번째, 희끄무레, 혈소판이 풍부한 층은 혈소판의 대부분을 포함.세 번째, 투명 층은 혈소판 이 가난한 층이며 적혈구와 백혈구 펠릿 바로 위에 있습니다. 전혈은 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 뚜렷한 인구를 나타내며, 측면 산란점 플롯대 로그산구 앞으로 산란시한다. 정제 된 혈소판은, 그러나, 적혈구 또는 백혈구의 무시할 수 있는 수로 명백한 인구를 보여줍니다.전혈 샘플에는 정제 된 혈소판 샘플에서 거의 결석한 Ter119 양성 적혈구 및 CD45 양성 백혈구 인구가 포함되어 있습니다. 처리되지 않은 정제 혈소판은 그들의 휴식 상태를 확인하는 거의 어떤 활성화 마커를 표현하지 않는 반면, 정제된 혈소판처리된 혈소판은 전형적으로 71%P-selectin 발현을 나타낸다. 처리되지 않은 정제 혈소판 샘플의 현미경 평가는 혈소판 응집없음을 드러내지 않습니다.혈소판은 혈소판으로 활성화된 후, 강력한 응집력을 보여 주며, 입증된 대로 정화 후의 생존가능성을 더욱 확인한다. 혈액 샘플을 요헥솔 배지에 조심스럽게 겹쳐 놓고 혈소판을 수집할 때는 성공적인 혈소판 정화를 위해 적혈구및 백혈구 층을 수집하지 않도록 주의 깊게 흡인해야 한다. 이 방법은 다른 종으로부터의 혈소판 정화에도 사용될 수 있다.정제 된 혈소판은 유전자 발현, 활성화, 응집, 과립 방출 및 접착 연구에 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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거핵세포와 혈소판 형성의 분화를 위한 체외(In vitro) 방법

이 비디오에서는 쥐 전혈에서 혈소판을 정제하는 프로토콜과 혈소판 작용제인 트롬빈을 통한 후속 활성화에 대해 설명합니다. 유세포 분석으로 분석할 때, 정제된 휴면 혈소판은 세포 표면 마커 CD41의 발현을 기반으로 특성화되는 반면, 정제된 활성 혈소판은 표면 마커 CD41 및 CD62P를 모두 함께 발현합니다.

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프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

혈소판 대사는 특히 출혈 및 혈전성 질환에서 혈소판 과잉 및 저활동의 역할과 관련이 있기 때문에 관심이 있습니다. 혈장에서 혈소판을 분리하는 것은 일부 대사 분석에 필요합니다. 여기에 제시된 것은 세척된 혈소판에서 세포 내 대사 산물을 분리하는 방법입니다.

정량적 대사 플럭스 연구를 위한 세척된 인간 혈소판의 준비

배우세요 마우스 혈액에서 혈소판을 정제하는 방법을 iohexol 그래디언트 원심분리를 통해. 정제된 혈소판은 활성화 및 기능 분석에 활용되어 혈소판 생물학 연구에 필수적인 기술을 제공합니다.

마우스 혈액에서 혈소판의 정제

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