Name: 연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 배우세요 연쇄상 구균(Streptococcus mutans)에서 고분자량 막 단백질을 정화하는 방법을. PCR 외 효소 반응 없이 유전자 발현 제품을 효율적으로 분리하고, 다른 세균 종에도 적용 가능한 간편한 단백질 정화 기술을 익히세요.

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이 작품은 일본과학진흥회(JSPS)(교부금 번호 16K15860 및 19K10471~T.M., 17K12032~M.I., 18K0926~N.H.) 및 SECOM 과학기술재단(SECOM)(보조금 번호 2010.10.19.19.1.1.19)에 의해 지원되었습니다.

참고: gtfC 유전자의 전체 코딩 영역이 spcr로 대체되는 S. 뮤탄스 □gtfC의 생성은 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 완료되어야 한다. 5세대에대한 자세한 내용은 게시된 문서를 참조하십시오.
1. 프라이머 디자인
<ol><li>
S. 뮤탄스 그의gtfC의건설을위한 프라이머를 준비합니다. 참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머 시퀀스는 표 1에나와 있습니다. S. 뮤탄스-gtfC의 생성을 위한 2단계 융합 PCR 방법은 도 2에도시된 것이다.<ol>
<li>설계 프라이머(gtfC-reverse및 spcr-forward)그의 태그 코딩 서열의 부착에 대 한, gtfC 유전자와 spcr 사이 개입(그림 2A).<ol>
<li>GS 링커와 그의 태그 코딩 시퀀스를 gtfC-reverse및 spcr-forward프라이머에 포함하며, 5' 영역에서 24개의 베이스가 서로 보완됩니다. 참고 : GS 링커와 그의 태그의 아미노산 서열 (글리 글리 글리 - 글리 - 세르 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의) 유전자 번역을 통해 GTF-SI의 C 종점에 부착되어 있습니다.</li>
			<li>S. 뮤탄스 WT 게놈 >1 kb 다운스트림의 유전자와 spcr-reverse프라이머에서 gtfC-forward 프라이머를 타겟팅하여 spc r의 하류 측면 영역을 타겟팅하는 gtfC-forward프라이머를 설계합니다. S. 뮤탄스 □gtfC에서. gtfC의용융 온도8 (Tm)를설정 -앞으로 및 spcr-역 프라이머는 gtfC의용융 온도와 일치 -reverse 및 spcr- 포워드 프라이머를 각각.</li>
		</ol>
</li>
		<li>두 번째 PCR(그림2B)에대해 중첩된 프라이머(중첩 포워드 및 중첩 역방향)를 디자인합니다.</li>
		<li>변형제의 게놈 DNA에 특이적인 설계프라이머(gtfC-forward및 콜로니 리버스)(도2C;프라이머는 콜로니 PCR에 사용된다). 참고: 앰플리콘은 gtfC와 spcr사이의 경계를 가로질러. gtfC-포워드프라이머는 전진 프라이머로서 적용될 수 있다.</li>
		<li>설계 프라이머(위-전진 및 하향-반전)는 S. 뮤탄스-gtfC의 생성에 대한 최종 확인을 위한 것이다(도2C;프라이머에 의해 증폭된 PCR 생성물은 DNA 염기서열 분석에 사용된다).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. S. 뮤탄에서 유전체 DNA 추출
참고: 각 S. 뮤탄스 균주는 혐기성 조건 하에서 37°C에서 뇌 심장 주입(BHI) 배지에서 배양되어야 합니다. S. 뮤탄스 □gtfC 및 S. 뮤탄스 그의-gtfC의 돌연변이 균주는 100 μg/mL 스펙티노마이신으로 보충된 BHI에서 배양된다. 
<ol><li>줄무늬 S. 뮤탄s WT 및 S. 뮤탄스 □gtfC를 각각의 BHI 한천 플레이트에 별도로 상한다. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.</li>
	<li>살균 된 이쑤시개를사용하여 S. 뮤탄s WT 또는 S. 뮤탄의 단일 콜로니를 선택하고 BHI 국물의 1.5 mL로 접종하십시오. 37 °C에서 밤새 배양하십시오. 참고: 상기 콜로니는 제1 PCR에 대한 템플릿 DNA의 공급원으로 사용될 수 있다(단계 3.1).</li>
	<li>각 세균 배양액의 1 mL을 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮김. 15,000 x g에서1 분 동안 배양하는 원심 분리기.</li>
	<li>상급체를 제거하고 트리스-EDTA 버퍼(pH 8.0)의 1 mL을 추가하여 세포 펠릿을 다시 중단시된다.</li>
	<li>15,000 x g에서1 분 동안 현탁액을 원심 분리기. 상급체를 제거합니다. 트리스-EDTA 완충액(pH 8.0)의 50 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>95°C에서 5분 동안 블록 인큐베이터를 사용하여 현탁액을 가열합니다. 15,000 x g에서5 분 동안 현탁액을 원심 분리기.</li>
	<li>상급체를 새로운 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브로 옮김(상급체는 제1 PCR에 대한 템플릿 DNA로서 작용할 것이다).</li>
</ol>3. PCR 증폭
참고: 표 1, 표 2및 표 3은 각각 PCR 프라이머, 시약 및 증폭 주기를 요약한다.
<ol><li>PcR 템플릿으로서 S. 뮤탄의WT 및 S. 뮤탄스 □gtfC 게놈을 사용하여 제1 PCR을 수행한다. 1.1.1.2단계(도2A)에기재된 프라이머를 이용하여 gtfC 유전자및 그 항구 spcr의 하류 부분을 항재하는 영역을 증폭한다.</li>
	<li>전기 조는 각 PCR 제품에 1% 아가로즈 젤. 약 1,000 bp 및 2,000 bp의 원하는 DNA 단편을 절제합니다. 실리카 막 기반 겔 추출 방법을 사용하여 겔에서 단편을 정화합니다. 참고: PCR9,DNA 겔 전기동10,DNA정제(11)에 대한 기본 절차는 다른 곳에서 상세히 설명되어 있다.</li>
	<li>중첩된 전진 및 중첩 역방향 프라이머(그림2B)를사용하여 첫 번째 PCR(약 등가)의 제품을 PCR 템플릿으로 사용하여 두 번째 PCR을 수행합니다.</li>
	<li>아가로즈 겔 상에 PCR 혼합물의 1/10을 전기포르제. 약 3,000 bp의 적절한 앰플리온의 생성을 확인합니다.</li>
	<li>
나머지 PCR 제품을 침전시. 참고 : 두 번째 PCR에 의해 생성 된 비 특이적 앰플리콘도 상동 재조합을 방해하지 않기 때문에 PCR 제품의 정제가 필요하지 않습니다.<ol>
<li>PCR 혼합물에 뉴클레아제 없는 물을 넣고 총 부피를 100 μL로 가져온 다음 3M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) 및 절대 에탄올 2.5 부피 (250 μL)의 0.1 부피 (10 μL)를 가져옵니다. 혼합물을 실온(RT)에서 10분 동안 혼합하고 보관합니다.</li>
		<li>4 °C에서 15,000 x g에서 20 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상급제는 버리십시오. DNA 펠릿을 세척하기 위해 70 % 에탄올 1 mL을 추가하십시오.</li>
		<li>4 °C에서 15,000 x g에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상급제는 버리십시오. 10 μL의 뉴클레아제 없는 물로 DNA 펠릿을 공기 건조하고 용해시다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 변환
<ol><li>[5]앞서 간행물에 기재된 단계에 따라 제2 PCR 제품을 소개할 수 있는 유능한 S. mutans WT를 준비한다. 세포를 -80°C에 보관하십시오. 참고: 본 실험을 위해, 유능한 S. 뮤탄sWT 세포는 이미 -80°C에서 보존되어 S. 뮤탄스 □gtfC를생성한다.</li>
	<li>농축된 제2 PCR 생성물의 5 μL을 이전에 동결된 얼음 차가운 유능한 세포의 50 μL aliquot에 혼합한다. 혼합물을 전기 개화 큐벳에 추가합니다. 전기 천공 장치를 사용하여 셀에 단일 전기 펄스(1.8 kV, 2.5 ms, 600 Ω, 10 μF)를 부여합니다.</li>
	<li>BHI 국물의 500 μL에서 세포를 다시 중단하십시오. 즉시, 스펙티노마이신을 함유한 BHI 한천 플레이트에 현탁액의 10-100 μL을 퍼뜨리세요. 식민지가 충분히 자라날 때까지 37 °C에서 2-6 일 동안 접시를 배양하십시오.</li>
</ol>5. Genome 재조합 및 보관 확인
<ol><li>재조합을 위해 gtfC-forward 및 콜로니 리버스 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행합니다. 전기조 각 콜로니 PCR 제품을 아가로즈 겔 상에. 약 1,500 bp의 DNA 단편을 확인합니다.</li>
	<li>멸균 된 이쑤시개를 사용하여 양성 콜로니 중 하나를 선택하고 스펙티노마이신을 함유한 BHI 국물 2 mL에서 밤새 세포를 배양합니다.</li>
	<li>0.8 mL의 세균 배양을 멸균 50% 글리세롤 0.8 mL와 혼합하고 -80 °C 또는 -20 °C에서 스톡합니다.</li>
	<li>나머지 1 mL의 세포 현탁액을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 2.3-2.7 단계를 반복하여 세포로부터 게놈 DNA를 추출합니다.</li>
	<li>상향 및 하향-역방향 프라이머 및 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 PCR을 수행합니다. 3.2 단계를 반복하여 겔로부터 증폭된 DNA 생성물을 정제한다.</li>
	<li>DNA 염기서열 분석으로 정제된 앰플리코의 DNA 서열을 결정합니다. 참고: DNA 염기서열분석으로 S. 뮤탄스 의 생성을 확인하십시오.</li>
</ol>6. 폴리히스티딘 태그 GTF-SI의 정화
<ol><li>Streak S. mutans His-gtfC를 스펙티노마이신 함유 BHI 한천 플레이트에. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.</li>
	<li>BHI 국물의 3 mL에서 멸균 된 이쑤시개 및 하위 배양 세포를 사용하여 단일 콜로니를 선택합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.</li>
	<li>스펙토마이신 없이 BHI 국물 1L로 원추형 플라스크 2개를 준비합니다. BHI 국물의 1 L에 하룻밤 배양 현탁액의 1 mL을 접종. 37 °C에서 하룻밤 배양.</li>
	<li>황산 암모늄 침전으로 배양 상급단백질을 농축한다. 참고: 표적 단백질이 세포내인 경우 세포체에서 추출합니다. 황산 암모늄 강수량에 대한 기본 절차는다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다 12.<ol>
<li>4°C에서 10,000 x g에서 20분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리기. 배양부체를 3L 유리 비커로 회수한다.</li>
		<li>마그네틱 교반기를 사용하여 격렬한 교반으로 황산 암모늄 1,122 g을 상급 (80 % 포화)의 2 L에 추가하십시오. 침전물 4°C에서 4시간 이상 교반하여 형성되도록 한다. 참고 : 침전물 형성은 하룻밤 동안 계속 될 수 있습니다.</li>
		<li>4 °C에서 20 분 동안 15,000 x g에서 황산 암모늄 침전 액을 원심 분리기. 상급자.</li>
		<li>주걱으로 침전을 수집하고 200 mL 유리 비커로 전송합니다. 결합 완충액의 35 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단 (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8.0).</li>
		<li>회생된 셀룰로오스 투석 튜브를 사용하여 결합 완충액의 2,500 mL에 대하여 현탁액을 투석, 4°C에서 교반하였다. 2 시간 후에 투석 용액을 교체하고 밤새 투석을 계속하십시오.</li>
		<li>투석 용액을 다시 교체하십시오. 추가 2 시간 투석을 계속하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>투석액을 20,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 흡입 여과 장비를 사용하여 멤브레인 필터를 통해 상류물을 필터링합니다. 여과액을 75cm2 플라스크로 옮김.</li>
	<li>폴리히스티딘 태그가 있는 GTF-SI를 고정화 된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 여과 된 현탁액으로부터 분별하십시오.
	<ol>
<li>Ni 충전 IMAC 수지 슬러리 2 mL(약 1 mL의 수지)를 실리콘 튜브에 장착된 크로마토그래피 컬럼으로 옮니다. 중력 흐름에 의해 저장 솔루션을 제거합니다. 주의 사항: 수지가 IMAC 전체에서 마르지 않도록 하십시오.</li>
		<li>3 mL의 증류수를 컬럼에 추가하여 수지세척합니다. 수지의 평형을 위해 바인딩 버퍼의 5 mL를 추가합니다.</li>
		<li>호프만 핀치 수탉으로 흐름을 차단합니다. 슬러리를 만들기 위해 6.5 단계에서 여과 된 현탁액 5 mL을 추가하십시오.</li>
		<li>모든 슬러리를 나머지 여과된 현탁액에 추가합니다. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 부드럽게 돌이십시오.</li>
		<li>혼합물을 열에 다시 로드합니다. 중력 흐름에 의해 현탁액을 제거합니다. IMAC 수지의 결합 버퍼 20 mL로 세척하십시오. 참고: 후속 IMAC 전체에서 호프만 핀치 콕으로 유량을 약 2mL/min으로 조정합니다.</li>
		<li>용출 완충제의 20 mL로 재조합 GTF-SI를 용출 완충한다(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8.0). 참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 용리수체는 4°C에서 보관해야 한다. IMAC 수지재사용이 가능합니다. IMAC 수지의 지침을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>용출 완충액을 저장 버퍼(50 mM 인산 완충제, pH 6.5)로 교체하고 원심 초여과 유닛을 사용하여 재조합 GTF-SI 용액을 약 1 mL에 농축한다. 재조합 GTF-SI 용액을 4°C에 저장합니다. 참고: 폴리히스티딘 태그가 있는 GTF-SI 정제를 SDS-PAGE13 및 서부블로팅(14)을 사용하여 고추냉이 과옥시다제-공액항 폴리히스티딘 모노클로날 항체를 채용하여 확인한다. CHAPS 추가 (최종 농도, 0.1%) 용리제는 표적 단백질에 따라 단위에 대한 비특이적 흡착을 피하기 위해 요구될 수 있다.</li>
</ol>7. 재조합 GTF-SI에 의한 기능 복원
<ol><li>각 S. 뮤탄의변형을 BHI 한천 플레이트에 개별적으로 연속한다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>살균 된 이쑤시개를 사용하여 단일 식민지를 집어 BHI 국물 2 mL로 접종하십시오. 37 °C에서 하룻밤 배양.</li>
	<li>유리 시험관에서 항생제 없이 1% 자당을 함유하는 BHI 국물 2 mL을접종하기 위해 S. 뮤탄의 하룻밤 배양물 20 μL을 사용한다. GTF-SI 또는 이에 상응하는 부피를 S. 뮤탄스 □gtfC 배양에 추가하고, 하룻밤 동안 기울어진 위치에 놓인 튜브로 세포를 배양한다. 참고: 멸균 주사기 필터로 GTF-SI 용액을 살균하고 사용 전에 비신코닌산 단백질 분석법15를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.</li>
	<li>10s. 서스펜션을 10s. Decant에 대한 와류 믹서로 배양 현탁액을 교반한다. 충분한 양의 증류수로 시험관을 씻으십시오.</li>
	<li>0.25 % 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB)의 1 mL로 튜브 벽에 생물 막을 얼룩.</li>
	<li>염색 용액을 1분 후에 데낸트. 충분한 양의 증류수로 시험관을 세척한다. 시험관을 공기 건조시.</li>
</ol>

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</ol>

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프라이머의 설계는 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. gtfC-reverse 및 spcr-forward프라이머의 시퀀스는 gtfC의 3′ 끝 영역과 spcr의5′ 끝 영역의 시퀀스에 따라 자동으로 결정되었습니다. 각 프라이머에는 GS 링커와 5' 영역에서 His-tag 코딩 시퀀스를 인코딩하는 24개의 보완 베이스가 포함되어 있습니다. 상류 측면 영역에 위치한 네이티브 조절 시퀀스의 중단은 3′ 끝에 His-tag 코딩 시퀀스를 추가하여 피할 수 있다. DNA 스톱 코돈은 gtfC-리버스프라이머로부터 제거하고 spcr-forward프라이머에 첨가해야 한다. 더욱이, gtfC-forward및 spcr-reverse는 S. 뮤탄스 WT 게놈에서 상동 재조합의 대상 영역의 약 1kb 상류 및 하류의 측면 영역을 ...

유전자의 기능의 분석은 일반적으로 관심있는 유전자가 중단된 균주에 야생 형 긴장의 표현형 특성의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 균주가 생성되면, 유전자 제품의 외인성 추가는 기능적 복원을 허용한다.
후속 복원 검사에 필요한 정제된 유전자 제품을 얻는 가장 일반적인 방법은 대장균1에서이종 발현을 수행하는 것이다. 그러나, 막 단백질 또는 고분자 질량 단백질의 발현은 종종 이 시스템을 사용하여 어렵다1. 이러한 경우에, 표적 단백질은 일반적으로 유전자 생성물의 손실로 이끌어 낼 수 있는 단계의 복잡한 시리즈를 통해 단백질을 기본적으로 종합하는 세포에서 단리됩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 파괴 방법2,PCR 기반 DNA 접합 방법3(지정 2단계 융합 PCR) 및 유전적 용 전기 천공에 따른 유전자 생성물 정제를 위한 간단한 절차가 개발되었습니다. 연쇄상 구균 뮤탄의변환 . 유전자 생성물의 C-말단에 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 첨가하면 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 그 정제가 용이합니다.
그의 태그 발현 긴장을 격리하기 위하여는, 관심 있는 유전자의 전체 게놈 DNA (이 그의 꼬리표 발현 유전자 중단한 긴장에서)는 항생 저항하는 마커 유전자로 대체됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 유전자 중단 균주를 생성하는 것과 거의 동일한 그의 태그 발현 균주를 생성하는 절차4,5. 따라서, 유전자 파괴 및 유전자 생성물 분리를 위한 방법은 기능분석을 위한 직렬 실험으로서 수행되어야 한다.
본 작에서, 폴리히스티딘 코딩 서열은 gtfC(GenBank 궤적 태그 SMU_1005) 유전자의 3′ 말단에 부착되고, 글루코실트랜스퍼라제-SI(GTF-SI)를 S. 뮤탄스6에인코딩한다. 이어서, 연쇄상 구균 종에서 발현 연구가 수행되었다. 대장균에 의한 이종 gtfC 발현을 달성하는 것은 어렵고, 이는 GTF-SI의 높은 분자량 때문에 가능성이 높다. 이 균주는 S. mutans 그의- gtfC라는 이름입니다. 야생형 S. 뮤탄스(S. 뮤탄스 WT)의 gtfC 및 스펙티노마이신 내성 유전자 카세트(spcr)7로 의 조직을 묘사한 개략적 그림과 그 유도체가 그림 1. GTF-SI는 카리오제닉 치과 용 생물막6의개발에 기여하는 분비 단백질입니다. 자당의 존재 하에, 부착 생물막은 WT S. 뮤탄스 균주에서 매끄러운 유리 표면에서 관찰되지만 S. 뮤탄스 gtfC-중단 균주(S. mutans ΔgtfC)2,5 . 생물막 형성은 재조합GTF-SI의 외인성 첨가 시 S. 뮤탄스 Δ gtfC에서 회복된다. 변형, S. 뮤탄스 그의-gtfC,다음 재조합 GTF-SI를 생산하는 데사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>아가로스 젤 전기영동용</td></tr><tr><td>Anaeropack Mitsubishi</td><td>Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>혐기성 배양 시스템</td></tr><tr><td>Anti-His-Tag 단클론 항체</td><td>MBL</td><td>D291-7</td><td>HRP-conjugated</td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>단백질 농도 측정</td></tr><tr><td>뇌 심장 주입 국물</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>박테리아 배양 배지</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>생물막 염색용</td></tr><tr><td>원심 한외 여과 장치</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>버퍼 교체 및 단백질 농도</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>IMAC</td></tr><tr><td>투석 멤브레인 클램프</td><td>Fisher 브랜드</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>As One</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>고충실도 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>DNA 염기서열분석</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL 기질</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>웨스턴 블로팅용</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td> <td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Tris-EDTA 완충액</td></tr><tr><td>준비 전기천공법 큐벳</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>0.2 cm 갭</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>EtBr 용액</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>아가로 젤 전기 영동</td></tr><tr><td>젤 밴드 커터</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>젤 추출 키트</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>아가로스 젤에서 DNA 추출</td></tr><tr><td>이미저</td><td>GE 헬스케어</td><td>29083461</td><td>SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅용</td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>결합 완충액 및 용출 완충액 준비</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Nippon Medical & 화학 기기</td><td>EZ-022</td><td>온도 설정: 4 > C</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Nippon Medical & 화학 기기</td><td>LH-100-RDS</td><td>온도 설정: 37 > C</td></tr><tr><td>멤브레인 필터</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 &micro; m 직경</td></tr><tr><td>미세 원심 분리기</td><td>Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>결합 완충액 및 용출 완충액</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot의 준비; 2H2O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>결합 완충액 및 용출 완충액의 제조</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>결합 완충액 및 용출 완충액</td></tr><tr><td>(NH4)의 제조 2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>황산암모늄 석출</td></tr><tr><td>Ni-charged 수지</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>IMAC의 경우</td></tr><tr><td>PCR 프라이머</td><td>Eurofins Genomics</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>주문 단백질 표준</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>용제 여과 장치</td><td>1</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>스펙티노마이신</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>항생제;100 &mu에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0.22 &micro; m 직경</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916; 실험실의 gtfC</td><td>Stock 변형률.</td><td></td><td>gtfC spcr</em</td></tr><tr><td>> Streptococus mutans UA159</td>로 대체실험실<td>의 주식 균주.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, 야생형 균주</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>생물막 개발용</td></tr><tr><td>TAE (50 &times; )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>아가 로즈 젤 전기 영동</td></tr><tr><td>열 순환기</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M, pH 8.0)</td> <td>Wako</td><td>314-90065</td><td>Tris-EDTA 완충 준비</td></tr></tbody></table>

연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

유전자의 기능의 해명이 전형적으로 관심의 유전자가 중단된 야생 형 긴장 및 긴장의 표현형 형질의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 다음 기능의 손실은 이후에 중단된 유전자의 산물의 외인성 첨가에 의해 회복된다. 이것은 유전자의 기능을 결정하는 것을 돕습니다. 앞서 설명한 방법은 gtfC 유전자-중단된 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것을 포함한다. 여기서, 유전자 파괴 에 이어 새로 생성된 S. 뮤탄스 균주로부터 gtfC 유전자 생성물을 정제하기 위한 까다로운 방법이 기술된다. 그것은 관심있는 유전자의 3′끝에서 폴리히스티딘 코딩 서열을 첨가하는 것을 포함하며, 이는 고정 된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유전자 생성물의 간단한 정제를 허용합니다. 이 방법의 유전자 변형에는 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않습니다. 유전자 중단 후 외인성 첨가에 의한 유전자 생성물의 복원은 유전자 기능을 결정하는 효율적인 방법이며, 이는 또한 다른 종에 적용될 수 있다.

도 3은 제1 PCR(도3A)및 제2 PCR(도3B)으로부터의각 앰플리컨의 크기를 나타낸다. 각 앰플리곤의 크기는 표 1에설명된 바와 같이 예측된 크기와 일치합니다. 도 4A는 S. 뮤탄스 콜로니가 두 번째 PCR 제품으로 변형되고 스펙토마이신을 함유하는 BHI 한천 플레이트상에 도금된 것을 나타낸다. 콜로니 PCR 제품은 아가로즈겔(도 4B)에서실행하였다. 각 앰플리톤은 표 1에기재된 바와 같이 예측된 크기였다. 그림 5는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 이미지를 보여줍니다....

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

이 방법은 E.Coli에서 표현하기 어려운 유전자 제품이 어떻게 정화되는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 PCR 이외의 효소 반응이 없는 담체이며 단백질 정화를 위한 일반적인 응용을 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 연쇄상 구균 뮤탄의 단백질 정제에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 다른 미생물 종에 감사 될 수있다.이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 졸업생인 야마시타 마사미코 박사가 될 것입니다. 프리머 설계 및 연쇄상 구균 뮤탄에서 유전체 DNA 추출 후, 야생 형 연쇄상 구균 뮤탄및 GFC는 PCR 템플릿으로 연쇄상 구균 뮤탄게놈을 방해하여 첫 번째 PCR을 수행합니다. gtfC 유전자의 하류 부분을 수용하는 지역과 준비된 gtfC-forward 및 역 프라이머 및 spc r-forward 및 역 프라이머를 사용하여 스펙티노마이신 저항 유전자를 수용하는 영역을 증폭시한다.이어서, 각 PCR 제품은 1%아가로즈 젤에. 젤 밴드커터를 사용하여 젤에서 약 1, 000개의 베이스 쌍및 2, 000개의 베이스 쌍을 마이크로센트심분리기 튜브로 소비합니다. 각 튜브에 용광화 버퍼 500 마이크로리터를 추가하고 젤 슬라이스를 용해시키기 위해 섭씨 56도에서 10 분 동안 배양하십시오.실리카 멤브레인 기반 젤 추출 방법을 사용하여 조각을 정화합니다. 중첩 된 방향 및 중첩 된 역 프라이머가있는 첫 번째 PCR 의 제품을 PCR 템플릿으로 사용하여 두 번째 PCR을 수행합니다. 전기 전도에 의해 두 번째 PCR 제품을 확인할 수 없는 경우 중첩 된 프라이머의 쌍을 설계해야합니다.아가로즈 젤상PCR 혼합물의 5개의 마이크로리터. 에디듐 브로마이드 겔 염색 영상에 의해 약 3, 000염기 쌍의 적절한 앰플리톤의 생성을 확인하고 원고에 따라 진행한다. 지금, 이전에 냉동 얼음 감기, 유능한 야생 형 연쇄상 구균 뮤탄 세포의 50 마이크로 리터 알로쿼트에 농축 된 제 2 PCR 제품의 5 마이크로 리터를 혼합.혼합물을 전기 기공 큐벳에 넣고 큐벳을 전기 기공 장치의 큐벳 챔버에 놓습니다. 세포에 2.5 밀리초 동안 1.8 킬로볼트, 600 옴 및 10 마이크로패라드의 단일 전기 펄스를 제공합니다. 500 마이크로리터의 뇌 심장 주입 국물을 큐벳에 넣습니다.즉시 10~100마이크로리터의 서스펜션을 스펙트럼마이신을 함유한 뇌심장 주입 오거 플레이트에 즉시 퍼집니다. 식민지가 충분히 성장 할 때까지 섭씨 37도에서 2 ~ 6 일 동안 접시를 배양하십시오. 원고에 따르면 연쇄상 구균 뮤탄의 생성 후 폴리히스티딘 코딩 서열은 4섭씨에서 10, 000배에서 20분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리하여 스펙티노마이신없이 변형및 야간 접종을 통합하였다.문화 상체를 3리터 유리 비커로 옮기습니다. 배양상에서 단백질을 농축하려면 2리터 상체를 자기 교반기위에 놓고 격렬한 교반을 시작합니다. 1, 122 그램의 황산암모늄을 추가하고 침전이 4 시간 동안 또는 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 활발한 교반으로 형성되도록합니다. 다음.심모늄 황산염 침전용액을 섭씨 4도에서 20분 동안 000배, 000배에서 원심분리합니다. 상체를 장식합니다. 주걱으로 침전물을 모아 200밀리리터 유리 비커로 옮기습니다.결합 버퍼의 35 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이어서, 현탁액의 약 25밀리리터를 재생셀룰로오스 투석 튜브로 옮기다. 투석 튜브를 교반 결합 버퍼의 2.5 리터에 넣고 섭씨 4도의 교반에 놓아 서스펜션을 투석합니다.투석 용액을 2시간 후에 교체하고 밤새 투석을 계속합니다. 다음으로 투석된 서스펜션을 튜브에서 원심분리기로 옮기고, 4°C에서 10분 동안 20, 000배 의 원심분리기에 튜브를 배치합니다. 단면 여과 장비를 사용하면 0.2 마이크로미터 멤브레인 필터 위에 상체를 부어 필터링합니다.여과물을 75밀리리터 플라스크로 옮기세요. 여과 된 서스펜션에서 폴리히스티딘 태그 gtfSI를 분수하려면 먼저 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 준비합니다. 원고에 따라 수지를 보정한 후 호프만 핀치 수탉을 닫습니다.필터된 서스펜션 5밀리리터를 컬럼에 추가하여 슬러리를 만듭니다. 그런 다음, 나머지 여과 된 서스펜션에 모든 슬러리를 전송하고 4 섭씨에서 30 분 동안 부드럽게 혼합물을 소용돌이. 혼합물을 다시 열에 로드합니다.호프만 핀치 수탉을 열어 중력 흐름에 의해 서스펜션을 제거합니다. IMAC 수지와 결합 버퍼 20 밀리리터를 세척한 다음, 용출 버퍼의 20 밀리리터를 재조합 gtfSI를 얻습니다. 그 후, 용액을 원심 울트라 여과 튜브에 넣고 용액을 1~5분 동안 2, 000배 g에서 원심분리하여 용액을 농축한다.여과 용기를 비우고 튜브에 15 밀리리터의 저장 버퍼를 추가합니다. 샘플을 다시 원심 분리하고 프로세스를 두 번 추가로 반복합니다. 재조합 gtfSI 솔루션은 마침내 약 1 밀리리터에 농축됩니다.농축액을 미세원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에 보관하십시오. 나머지 기능 복원 프로토콜을 계속 합니다. 본 프로토콜에서, 아가로즈 겔 전기포진은 제1 PCR 및 제2 PCR로부터의 각 앰플리턴의 크기가 예측된 크기에 대응하는 것을 나타낸다.연쇄상 구균 뮤탄식민지는 두 번째 PCR 제품으로 변형되었고 스펙트럼을 포함하는 뇌 심장 주입 오거 플레이트에 도금되었습니다. 아가로즈 젤에서 실행되는 콜로니 PCR 제품은 각 앰플리턴이 예측 된 크기의 것을 보여줍니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피로 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 단일 대역으로 관찰되었다.항 폴리히스티딘 항체를 사용하여 수행된 서양 블롯은 관찰된 밴드가 160킬로달톤의 폴리히스티딘 태그 단백질임을 확인했습니다. 자당 유래 생물막 형성 능력은 1%의 자당이 있는 튜브 벽에 부착된 생물막을 형성한 연쇄상 구균 뮤탄과 연쇄상 구균 뮤탄스 His-gtfC로만 볼 수 있었다. 이것은 연쇄상 구균 mutans 델타 gtfC에서 관찰되지 않았습니다.그러나, 재조합 gtfSI의 25 마이크로그램을 첨가하여 연쇄상 구균 돌연변이 델타 gtfC에서 부착된 생물막 형성 능력을 회복시켰습니다. 이 방법의 성공은 두 번째 PCR 증폭에 따라 달라지므로 두 번째 PCR 제품은 전기 전구에 의해 확인되어야합니다. 이미, 이 방법에 의해 얻어진 히스티딘 형 단백질은 단백질 단백질 상호 작용과 같은 기능성 산에 소집되고 있다.개발 후, 이 기술은 유전자 중단과 함께 미생물학 분야의 연구원들이 유전자 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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