Name: 초저입력 캐리어-CAGE를 사용한 전사 시작 사이트 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 학습하세요 SLIC-CAGE를 사용하여 10나노그램의 RNA로 전사 시작 사이트를 고해상도 매핑하는 방법을. 이 기술은 취약한 세포 유형과 조직 생검의 프로모터 분석에 필수적입니다.

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이 작품은 웰컴 트러스트 보조금에 의해 지원되었다 (106954) B. L. 및 의료 연구위원회에 수여 (MRC) 핵심 자금 (MC-A652-5QA10). N. C.는 EMBO 장기 펠로우십(EMBO ALTF 1279-2016)의 지원을 받았습니다. E. P. 의학 연구 위원회 영국에 의해 지원 되었다; B. L. 의료 연구 위원회 영국에 의해 지원 되었다 (MC UP 1102/1).

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<li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoPARE%3A+parallel+analysis+of+RNA+5%27+ends+from+low-input+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li>
</ol>

분해성 담체 RNA/DNA에 대한 특허가 작성되었습니다.

성공적인 SLIC-CAGE 라이브러리 준비의 경우, 시료 흡착으로 인한 시료 손실을 방지하기 위해 낮은 결합 팁과 튜브를 사용하는 것이 중요합니다. 상급물의 검색과 관련된 모든 단계에서 전체 샘플 볼륨을 복구하는 것이 좋습니다. 프로토콜에 여러 단계가 있기 때문에 연속 샘플 손실은 실패한 라이브러리로 이어질 수 있습니다.
CAGE(nAnT-iCAGE)가 일상적으로 수행되지 않은 경우, 동일한 총 RNA 샘플의 다른 입력 량(10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng)으로 SLIC-CAGE를 테스트하고 총 RNA 5 μg를 사용하여 제조된 nAnT-iCAGE 라이브러리와 비교하는 것이 가장 좋습니다. nAnT-iCAGE 라이브러리가 실패하는 경우(샘플당 얻은 DNA 라이브러리의 0.5-1 ng 미만), SLIC-CAGE는 작동하지 않을 수 있으며 샘플 손실을 최소화해야 합니다.
상한 되지 않은 RNA 또는 rRNA가 없는 고품질 라이브러리를 보장하는 중요한 단계는 섹션 7에 설명된 캡 트래핑입니다. 스트렙타비딘 비드는 세척 버퍼에 완전히 다시 매달려 있고 세척 버퍼가 다음 세척 단계 또는 cDNA 용출을 계속하기 전에 제거되는 것이 매우 중요합니다.
캐리어 성능 저하의 첫 번째 라운드 후 qPCR의 결과가 adaptor_f1 및 carrier_f1 프라이머의 사용 간에 차이가 없는 경우 프로토콜을 계속 사용하는 것이 좋습니다. 캐리어 저하의 두 번째 라운드 후, Ct 값의 차이가 5 보다 작은 경우, 캐리어 저하의 세 번째 라운드를 권장 합니다. 우리는 필요한 저하의 세 번째 라운드를 발견 한 적이 없다, 그리고 발생하는 경우, 호밍 endonuclease 주식을 교체하는 것이 좋습니다.
얻어진 라이브러리의 최종 양이 시퀀싱을 위해 충분하지 않은 경우 PCR 증폭의 추가 라운드가 프로토콜에 추가될 수 있다. PCR 증폭은 크기 선택에서 피할 수 없는 샘플 손실을 고려하여 시퀀싱에 충분한 재료를 산출하는 데 필요한 최소한의 증폭 주기로 설정할 수 있습니다. SPRI 자기 비드를 사용하여 정화 또는 크기 선택은 모든 작은 (&200 bp) 조각이 제거 될 때까지 수행되어야합니다 (필요한 경우, 샘플 비율에 0.6 :1 구슬을 사용), 라이브러리는 Picogreen을 사용하여 정량화되어야한다.
라이브러리는 단일 엔드 또는 페어링 된 엔드 모드에서 시퀀스할 수 있습니다. 페어링된 말단 시퀀싱을 사용하여 전사체 이소폼에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 또한, 역전사가 랜덤 프라이머(TCT-N 6,N6 임의 의 hexamer인)를 사용하여 수행됨에 따라, 서열화된 3'-말단으로부터의 정보는 PCR 중복을 붕괴시키는 고유 분자 식별자(UMI)로서 사용될 수 있다. 적당한 수의 PCR 증폭 주기가 사용됨에 따라(최대 18), UMI의 사용은 이전에 불필요한 것으로 밝혀졌다.
프로토콜의 핵심은 nAnT-iCAGE11에의존하기 때문에 SLIC-CAGE는 8개의 바코드를 사용합니다. 따라서 8개 이상의 샘플을 다중화하는 것은 현재 지원되지 않습니다. 또한 SLIC-CAGE와 nAnT-iCAGE는 AMPure XP 비드를 사용하여 크기 제외를 통해 링커와 PCR 아티팩트를 제거하도록 설계되었기 때문에 200bp 미만의 RNA를 캡처하는 데 적합하지 않습니다.
SLIC-CAGE는 전체 RNA 물질의 나노그램을 사용하여 전사 개시 부위를 매핑하는 유일한 편견없는 저입력 단일 뉴클레오티드 분해 방법이다. 대안적인 방법은 캡 트래핑 대신에 역전사의 템플릿 스위칭 활성을 바코드 캡핑 RNA(예를 들어, NanoCAGE15 및 NanoPARE16)에의존한다. 템플릿 스위칭으로 인해 이러한 메서드는 TSS 검출에서 시퀀스 별 편향을 나타내며, 거짓 양성 TSS의 수가 증가하고 실제 TSS9,10의수가 감소합니다.

유전자 발현(CAGE)의 캡 분석은 RNA 폴리머라제 II 전사 개시 부위(TSSs)의 단일 뉴클레오티드 분해능 게놈 전체 매핑에 사용되는 방법1. 정량적 특성으로 인해 5'엔드 중심 식 프로파일링도 가능합니다. TSSs를 둘러싼 영역(대략 40 bp 상류 및 다운스트림)은 핵심 프로모터이며 RNA 폴리머라제 II및 일반 전사 인자 결합이 결합되는 물리적 위치를 나타낸다(이전에 검토된 2,3). TSS의 정확한 위치에 대한 정보는 코어 프로모터 발견 및 프로모터 역학 모니터링에 사용될 수 있습니다. 또한, 액티브 인핸서가 양방향 전사의 서명을 나타내기 때문에, CAGE 데이터는 또한 인핸서 역학4의 증강 발견 및 모니터링에 사용될 수 있다. CAGE 방법론은 최근 인코드 5, modENCODE6및 FANTOM 프로젝트7과 같은 중요한 연구 프로젝트에서광범위한 응용 프로그램 및 사용으로 인해 인기가 높아졌습니다. 또한, TSS 정보는 또한 질병 특이적 TSS가 진단 목적으로 사용될 수 있기 때문에 건강하고 병이 있는 조직을 구별하는 데 중요한 것으로 입증되고있다8.
TSS 매핑을 위한 여러 가지 방법(CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, 올리고 캡핑)을 사용할 수 있지만, 우리와 다른 사람들은 최근 CAGE가 거짓 긍정 수가 가장 적은 진정한 TSS를 캡처하는 가장 편견없는 방법임을 보여주었습니다9 , 10. 최근 CAGE 프로토콜, nAnT-iCAGE11은제한 효소를 사용하여 짧은 태그로 조각을 절단하는 것을 피하고 PCR 증폭을 사용하지 않기 때문에 TSS 프로파일링을위한 가장 편견없는 프로토콜입니다. nAnT-iCAGE 프로토콜의 한계는 다량의 시작 물질(예를 들어, 각 샘플에 대해 총 RNA의 5 μg)에 대한 요구사항이다. 구체적인 생물학적으로 관련된 질문에 대답하기 위해, 그러한 다량의 시작 물질(예를 들어, FACS 분류 세포 또는 초기 배아 단계)을 얻는 것은 종종 불가능하다. 마지막으로, nAnT-iCAGE가 성공하면 각 샘플에서 DNA 라이브러리 물질의 1-2 ng만 사용할 수 있어 달성 가능한 시퀀싱 깊이를 제한합니다.
총 RNA의 나노그램만을 사용하여 TSS 프로파일링을 가능하게 하기 위해, 우리는 최근에 초저 입력 캐리어-CAGE 10(SLIC-CAGE, 그림1)을 개발했습니다. SLIC-CAGE는 높은 복잡성 라이브러리를 얻기 위해 총 RNA의 10ng만 필요로 합니다. 당사의 프로토콜은 총 5 μg의 RNA 물질을 달성하기 위해 관심 있는 RNA에 추가된 신중하게 설계된 합성 RNA 담체에 의존합니다. 합성 담체는 초과균질 분자에 의해 야기될 수 있는 잠재적인 편견을 피하기 위하여 길이 분포에 있는 표적 DNA 라이브러리를 모방합니다. 담체의 서열은 대장균 류실-tRNA 합성 유전자의 서열에 기초한다(표 1)는 두 가지 이유로. 첫째, 최종 라이브러리에 있는 운반체의 남은 것은, 순서가 있더라도, 진핵 게놈에 지도되지 않을 것입니다. 둘째, 대장균은 중증 종이므로, 하우스키핑 유전자는 SLIC-CAGE에 적합한 온도 범위에 최적화되어 있습니다. 담체 서열은 또한 운반체 RNA 분자로부터 유래된 DNA의 특이적 분해를 허용하기 위해 호밍 엔도뉴클로스 인식 부위와 함께 내장된다. 호밍 엔도뉴클레아제 인식 사이트가 길기 때문에 대상, 샘플 유래 라이브러리는 그대로 유지됩니다(I-CeuI = 27 bp; I-SceI = 18 bp) 및 진핵 게놈에서 통계적으로 발견될 가능성이 낮다. 캐리어의 특정 분해 및 크기 배제에 의한 단편의 제거 후, 대상 라이브러리는 PCR 증폭 및 차세대 시퀀싱에 대한 준비된다. 시작 RNA 양 (1-100 ng)에 따라, 13-18 PCR 증폭 주기 사이 요구 될 것으로 예상 된다. 각 샘플당 DNA의 최종 양은 5-50 ng 사이, 매우 깊은 시퀀싱을 위한 충분한 물자를 산출합니다. 총 RNA의 단지 1-2 ng를 사용하는 경우에, 진정한 TSS는 검출될 수 있습니다; 그러나 라이브러리의 복잡성은 낮을 것으로 예상됩니다. 마지막으로 SLIC-CAGE는 nAnT-iCAGE 프로토콜11을기반으로 하므로 시퀀싱 전에 최대 8개의 샘플을 다중화할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-프로판올, Bioultra, 분자 생물학용, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59304-100ML-F</td><td>는 RNAclean XP 정제에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>3' 링커</td><td></td><td></td>염<td>기서열은 Murata et al. 2014 및 이 원고의 보충 표 1에 설명되어 있습니다. 3'링커를 생산하기 위한 가닥의 어닐링은 이 프로토콜의 보충 자료에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>5' 링커</td><td></td><td></td>: <td>염기서열은 Murata et al. 2014 및 이 원고의 보충 표 1에 설명되어 있습니다. 5' 링커를 생성하기 위한 가닥의 어닐링은 이 프로토콜의 보충 자료에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>DNA 정제</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>케이지 단계에서 RNA 및 RNA:cDNA 하이브리드의 정제.</td></tr><tr><td>Axygen 0.2 mL 폴리프로필렌 PCR 튜브 스트립 및 돔형 캡 스트립</td><td>Axygen(Corning을 통해 구매 가능)</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td>또는 8-튜브 PCR 스트립(물 및 혼합물에만 사용).</td></tr><tr><td>Axygen 1 x 8 스트립 돔형 PCR 캡</td><td>Axygen(Corning을 통해 구매 가능)</td><td>PCR 플레이트용</td> <td>PCR-02CP-C</td> 캡.</tr><tr><td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen(Corning을 통해 구매 가능)</td><td>MCT-150-L-C</td><td>효소 혼합물 또는 시료 농축에 사용되는 저결합 1.5 mL 튜브.</td></tr><tr><td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td><td>Axygen(Corning을 통해 사용 가능)</td><td>PCR-96-C</td><td>저결합 PCR 플레이트는 프로토콜의 모든 단계에 사용해야 합니다. 샘플의 가시성을 높이기 위해 플레이트를 2 x 8 웰로 절단해야 합니다.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer(또는 Tapestation): RNA nano 및 HS DNA 키트</td><td>Agilent</td><td></td><td>RNA의 품질을 결정하기 위해 효율적인 크기 선택 및 라이브러리의 최종 품질을 결정합니다(Tapestation도 사용할 수 있음)</td></tr><tr><td>비오틴(Long Arm) Hydrazide</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-1100</td><td>비오틴화/태깅</td></tr><tr><td>Cutsmart buffer</td><td>NEB</td><td></td><td>제한 효소 완충액</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0259S</td><td>두 번째 가닥 합성</td></tr><tr><td>DNA 결찰 키트, Mighty Mix</td><td>Takara</td><td>6023</td><td>5' 및 3'-링커 결찰</td></tr><tr><td>dNTP 믹스에 사용(각 10mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td>캐리어 템플릿(또는 PCR에 적합한 모든 dNTP) 생산용 dNTP 믹스</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>65305</td><td>캡 트래핑. 다른 비드는 사용된 버퍼로 최적화되어 있으므로 사용하지 마십시오.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>1.5mL 튜브용 마그네틱 스탠드 - Streptavidin 비드 준비에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DynaMag-96 사이드 스커트 자석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027</td><td>PCR 플레이트(96웰 플레이트)용 마그네틱 스탠드 - 2 x 8 웰을 담기 위해 절단 플레이트와 함께 사용됩니다.</td></tr><tr><td>에탄올, BioUltra, 분자 생물학, &ge; 99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51976-500ML-F</td><td>AMPure 세척에 사용됩니다. 모든 분자 생물학에 적합한 에탄올을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>엑소뉴클레아제 I (E. coli)</td><td>NEB</td><td>M0293S</td><td>잔여 프라이머 분해</td></tr><tr><td>겔 로딩 염료, 보라색(6x), SDS 없음</td><td>NEB</td><td>B7025S</td><td>아가로스 젤 로딩 염료</td></tr><tr><td>HiScribe T7 고수율 RNA 합성 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td>캐리어 체외 전사용 키트</td></tr><tr><td>수평 전기영동 장치</td><td></td><td></td><td>아가로스 겔에서 캐리어 DNA 템플릿 정제</td></tr><tr><td>I-CEU</td><td>NEB</td><td>R0699S</td><td>캐리어 분해에 사용되는 Homing 엔도뉴클레아제.</td></tr><tr><td>SceI</td><td>NEB</td><td>R0694S</td><td>캐리어 분해에 사용되는 Homing 엔도뉴클레아제.</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td><td>Kapa Biosystems (Roche 제공)</td><td>KK2601</td><td>PCR 믹스 타겟 라이브러리 증폭</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST qPCR 키트(범용)</td><td>2x Kapa Biosystems(Roche 제공)</td>분해 <td>효율 및 필요한 PCR 증폭 주기 횟수 평가를 위한</td> <td>KK4600</td> qPCR 믹스</tr><tr><td>마이크로피펫 및 다채널 마이크로피펫(0.1-10 &micro; L, 1-20 &마이크로; L, 20-200 &마이크로; L)</td><td>Gilson</td><td></td> 바인딩<td>이 낮은 Sorenson 팁과 함께 Gilson을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 마이크로피펫은 호환되지 않을 수 있습니다. 다른 브랜드의 낮은 결합 팁은 품질이 동일하지 않을 수 있으며 샘플 손실을 증가시킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td></td><td></td><td>최종 라이브러리의 Picogreen 농도 측정을 위한 것입니다. 마이크로플레이트는 소량 측정을 허용하고 시료 낭비를 줄이는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td>또는 모든 뉴클레아제(DNase 및 RNase) 자유수</td></tr><tr><td>PCR thermal cycler</td><td></td><td></td><td>배양 단계 및 PCR 증폭</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td>담체 템플릿(또는 모든 고충실도 중합효소) 증폭을 위한 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>아가로스 겔에서 캐리어 PCR 템플릿의 정제.</td></tr><tr><td>PCR 증폭 cyle 수 및 캐리어 분해 정도를 결정하는</td> <td>qPCR 기계</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P11495</td><td>최종 라이브러리 농도를 측정하는 데 사용 - Qubit보다 더 정확하고 재현성이 높기 때문에 권장됩니다.</td></tr><tr><td>퀵로드 퍼플, 100 bp DNA 래더</td>, <td>NEB</td><td>N0551S,</td><td>DNA 래더</td></tr>, <tr><td>퀵-로드 퍼플, 1 kb 플러스 DNA 래더</td>, <td>NEB</td><td>N0550S</td><td>DNA 래더</td></tr>, <tr><td>리보뉴클레아제 H</td><td>Takara</td><td>2150A</td><td>, 캡 트래핑 후 RNA 분해.</td></tr><tr><td>RNase ONE Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4261</td><td>cDNA에 의해 보호되지 않는 단일 가닥 RNA의 분해.</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>시험관 내 전사 후 캐리어 DNA 템플릿 제거.</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>시험관 내 전사 또는 캡핑에서 캐리어 RNA 정리용</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse 무료</td><td>VWR</td><td>AAJ63669-AK</td><td>또는 모든 뉴클레아제(DNase 및 RNase) 무료 용액</td></tr><tr><td>아세트산나트륨, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse 무료</td><td></td><td></td><td>또는 모든 뉴클레아제(DNase 및 RNase) 무료 용액</td></tr><tr><td>소듐 periodate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td>주변 디올의 산화</td></tr><tr><td>Sorenson 낮은 바인딩 에어로졸 장벽 팁, MicroReach 가드, 볼륨 범위 10 &mu; L, Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICH를 통해 사용 가능)</td><td>Z719390-960EA</td><td>저결합 팁 - 시료 손실을 최소화하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 권장됩니다.</td></tr><tr><td>Sorenson 낮은 바인딩 에어로졸 장벽 팁, MultiGuard, 볼륨 범위 1,000 &mu; L , Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICH를 통해 사용 가능)</td><td>Z719463-1000EA</td><td>저결합 팁 - 시료 손실을 최소화하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 권장됩니다.</td></tr><tr><td>Sorenson 낮은 바인딩 에어로졸 장벽 팁, MultiGuard, 볼륨 범위 20 &mu; L , Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICH를 통해 사용 가능)</td><td>Z719412-960EA</td><td>저결합 팁 - 시료 손실을 최소화하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>Sorenson 낮은 바인딩 에어로졸 장벽 팁, MultiGuard, 볼륨 범위 200 &mu; L , Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICH를 통해 사용 가능)</td><td>Z719447-960EA</td><td>낮은 바인딩 팁 - 샘플 손실을 최소화하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 권장됩니다.</td></tr><tr><td>SpeedVac 진공 농축기</td><td></td><td></td> 부피<td>를 줄이기 위해 다양한 단계에서 시료 농축</td></tr><tr><td>SuperScript III 역전사효소</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td>역전사에 사용(1차 CAGE 단계)</td></tr><tr><td>트레할로스/소르비톨 용액</td><td></td><td></td><td>준비는 Murata et al. 2014에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1 M aq.soln, pH 8.5</td><td></td><td></td><td>1 M 용액, DNase 및 RNase free</td></tr><tr><td>tRNA (20 mg/mL)</td><td></td><td></td> <td>tRNA 용액. 준비는 Murata et al. 2014에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>UltraPure 저 융점 아가로스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16520050</td><td>또는 적합한 순수 저용융 아가로스.</td></tr><tr><td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td><td>Applied Biosystems (ThermoFisher Scientific 제공)</td><td>78390500UN</td><td></td></tr><tr><td>USER Enzyme</td><td>NEB</td><td>M5505S</td><td>3'linker's upper strand의 분해, Uracil Specific Excision 시약/효소</td></tr><tr><td>Vaccinia Capping System</td><td>NEB</td><td>M2080S</td><td>운반체 분자의 체외 캡핑을 위한 효소 키트</td></tr><tr><td>Wash buffer A</td><td></td><td></td><td>캡 트래핑 워시. 준비는 Murata et al. 2014에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>세척 버퍼 B</td><td></td><td></td><td>캡 트래핑 세척. 준비는 Murata et al. 2014에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>세척 버퍼 C</td><td></td><td></td><td>캡 트래핑 세척. 준비는 Murata et al. 2014에 설명되어 있습니다.</td></tr></tbody></table>

초저입력 캐리어-cage를 사용한 전사 시작 사이트 매핑

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

유전자 발현(CAGE)의 캡 분석은 RNA 폴리머라제 II 전사 개시 부위(TSSs)의 단일 뉴클레오티드 분해능 검출에 사용되는 방법이다. TSS의 정확한 검출은 핵심 프로모터의 식별 및 발견을 향상시킵니다. 또한, 활성 인핸서는 양방향 전사 개시의 서명을 통해 검출 될 수있다. 여기서 설명된 초저 입력 반송파-CAGE(SLIC-CAGE)를 수행하기 위한 프로토콜이 있다. 이러한 CAGE 프로토콜의 SLIC 적응은 관심 있는 샘플에 추가되는 시험관 내 전사 RNA 담체 혼합물을 사용하여 RNA 양을 인위적으로 증가시킴으로써 RNA 손실을 최소화하여 총 나노그램 양에서 라이브러리 준비를 가능하게 합니다. RNA (즉, 수천 개의 세포). 캐리어는 예상된 DNA 라이브러리 단편 길이 분포를 모방하여 균질한 담체의 풍부에 의해 야기될 수 있는 편견을 제거합니다. 프로토콜의 마지막 단계에서, 반송파는 호밍 엔도누클리스를 통해 분해를 통해 제거되고 표적 라이브러리는 증폭된다. 표적 샘플 라이브러리는 호밍 엔도뉴클로스 인식 사이트가 길기 때문에(18~27bp 사이) 진핵 게놈에서 존재할 확률이 매우 낮기 때문에 분해로부터 보호됩니다. 최종 결과는 차세대 염기서열 분석이 준비된 DNA 라이브러리입니다. 시퀀싱까지 프로토콜의 모든 단계는 6일 이내에 완료할 수 있습니다. 캐리어 준비는 하루 종일 작동해야합니다. 그러나, 대량으로 제조될 수 있고 -80°C에서 냉동 보관할 수 있다. 일단 서열화되면, 판독은 게놈 전체 의 단일 뉴클레오티드 분해능 TSSs를 얻기 위하여 가공될 수 있습니다. TSSs는 유전자 규칙에 대한 통찰력을 제공하는 코어 프로모터 또는 증강인자 발견을 위해 사용될 수 있습니다. 프로모터에 집계되면 데이터는 5'중심 식 프로파일링에도 사용할 수 있습니다.

본 보고서는 시작 총 RNA 물질의 나노그램으로부터 시퀀싱 준비 라이브러리를 얻기 위한 전체SLIC-CAGE 프로토콜을 설명한다(도 1). 합성 RNA 담체 혼합물을 얻기 위해, 먼저, PCR 담체 템플릿을 제조하고 정제하여 PCR 측 제품을 제거해야 한다(도2A). 각 PCR 템플릿(총 10개)은 공통 정방향이지만 상이한역프라이머(표 2)를 사용하여 생성되지만, 합성 RNA 담체의 크기 가변성을 가능하게 하는 PCR 템플릿의 상이한 길이로 이어진다. 일단 정제되면, PCR 템플릿은 담체 분자의 시험관 내 전사에 사용된다. 템플릿이 겔 정제되는 경우 단일 RNA 담체 생성물이 예상된다(도 2B의대표적인 겔 분석 참조). 캐리어의 제조는 필요에 따라 업스케일링될 수 있고, 제조될 때, 향후 사용을 위해 -80°C에서 혼합 및 냉동될 수 있다.
PCR 증폭의 16-18 사이클과 결합된 권장 최소량의 샘플 총 RNA(10ng)를 사용하여 높은 복잡성SLIC-CAGE 라이브러리를 달성할 수 있습니다. 최종 라이브러리를 증폭하는 데 필요한 PCR 사이클의 수는 사용된 총 입력 RNA의 양에 따라 크게 좌우됩니다(예상 사이클 수는 표4에 제시되어 있음).
첫 번째 분해 후 qPCR 결과(17단계)에서 adaptor_f1 또는 carrier_f1 프라이머를 사용하여 얻은 Ct 값 간의 예상 차이는 1-2이며, adaptor_f1로 얻은 Ct 값은 carrier_f1보다 낮습니다.
최종 라이브러리에서 단편 길이의 분포는 평균 단편 크기가 700-900 bp인 200-2,000 bp 사이입니다(바이오분석기 소프트웨어를 사용한 영역 분석에 기초, 도 4B,D). 그림 4A,C에제시된 바와 같이 짧은 조각은 크기 배제의 추가 라운드(단계 20-21)에 의해 제거되어야 합니다. 이러한 짧은 조각은 대상 라이브러리가 아닌 PCR 증폭 아티팩트입니다. 짧은 조각은 시퀀싱 흐름 셀에서 더 나은 클러스터를 가지며 시퀀싱 문제가 발생할 수 있습니다.
샘플당 얻어진 라이브러리 재료의 예상 량은 5-50 ng 사이입니다. 현저히 낮은 양은 프로토콜 동안의 샘플 손실을 나타낸다. 얻어진 낮은 수량이 시퀀싱에 충분하면(풀링된 라이브러리의 2-3ng가 필요함) 라이브러리는 더 낮은 복잡성일 수 있습니다(아래 참조).
시퀀싱 머신에 따라 유량 셀에 로드된 라이브러리의 양을 최적화해야 할 수 있습니다. Illumina HiSeq 2500을 사용하면 8-12pM SLIC-CAGE 라이브러리를 로드하면 평균 150-2억 개의 읽기가 제공되며 읽기의 80%는 품질 점수 Q30을 임계값으로 통과합니다.
얻어진 판독값은 기준 게놈에 매핑된 후 [50 bp 읽기의 경우, Bowtie212는 시드 서열당 0개의 불일치를 허용하는 기본 파라미터와 함께 사용될 수 있다(22 bp)]. 예상 매핑 효율성은 총 RNA 입력 량에 따라 달라지며 표5에 나와 있습니다. 고유하게 매핑된 판독값은 R 그래픽 및 통계 컴퓨팅환경(13)에 로드되고 CAGEr(생체 전도체 패키지14)를사용하여 처리될 수 있다. 패키지 비네팅은 따라하기 쉽고 매핑된 데이터의 워크플로우 및 처리를 자세히 설명합니다. 라이브러리 복잡성의 쉬운 시각적 제어는 프로모터 폭의 분포이며, 저복잡성 라이브러리는 인위적으로 좁은 프로모터를 가질 것이다(그림5A,총 RNA의 1ng에서 파생된 SLIC-CAGE 라이브러리, 자세한 내용은 이전 참조) 10). 그러나, 심지어 낮은 복잡성 SLIC-CAGE 라이브러리는 낮은 / 중간 입력 TSS 매핑에 대한 대체 방법보다 더 큰 정밀도, 진정한 CTSS의 식별을 할 수 있습니다 (그림5B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> 그림 1: SLIC-CAGE 프로토콜의 단계입니다. 샘플 RNA는 총 RNA 물질의 5 μg를 달성하기 위해 RNA 담체 혼합물과 혼합된다. cDNA는 역전사를 통해 합성되고 캡은 나트륨 주위를 사용하여 산화됩니다. 산화는 비오틴 히드라지드를 사용하여 캡에 비오틴을 부착할 수 있게 합니다. 비오틴은 mRNA의 3′ 끝에 부착되다, 그것은 또한 나트륨 주기도 사용하여 산화로. mRNA에서 비오틴을 제거하기 위해:cDNA 하이브리드 불완전 합성 cDNA와 3′ mRNA의 끝에서, 샘플은 RNase I. mRNA의 끝에 도달 cDNA로 처리됩니다 다음 스트렙 타비딘 자기 구슬에 친화도 정제에 의해 선택된다 ( 캡 트래핑)을 참조하십시오. cDNA의 출시 후, 5′- 그리고 3′링커는 결찰. 담체로부터 유래된 라이브러리 분자는 I-SceI 및 I-CeuI 호밍 엔도뉴클레스를 사용하여 분해되고 단편은 SPRI 자기 비드를 사용하여 제거된다. 그런 다음 라이브러리가 PCR 증폭됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> 도 2: 대표적인 겔-체외 전사체 내 전사체 및 담체 PCR 템플릿의 겔 분석. (a) 겔 정제 전에 캐리어 PCR 템플릿: 제 1 웰은 1 kbp 마커를 포함하고, 그 다음에 캐리어 PCR 템플릿 1, 1-10. (B) 담체 체외 전사체: 제 1 웰은 1 kbp 마커를 포함하고, 그 다음에 담체 전사체 1-10을 함유한다. 담체 전사체는 로딩 전에 95°C에서 5분 동안 가열하여 변성하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> 그림 3: 1차 담체 분해 전에 SLIC-CAGE의 대표적인 DNA 품질(고감도 DNA 칩) 트레이스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> 그림 4: PCR 증폭 후 SLIC-CAGE 라이브러리의 대표적인 DNA 품질(고감도 DNA 칩) 트레이스. (A) 짧은 조각을 제거하기 위해 추가 크기 선택이 필요한 SLIC-CAGE 라이브러리입니다. (B) SLIC-CAGE 라이브러리는 0.6x SPRI 비드를 사용하여 크기 선택 후 샘플 비율을 사용합니다. (C) 짧은 조각의 제거를 위한 크기 선택이 필요한 낮은 출력 량의 SLIC-CAGE 라이브러리. (D) SLIC-CAGE 라이브러리는 0.6:1 SPRI 비드를 사용하여 크기 선택 후 낮은 출력량을 시료 비율로 사용한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> 그림 5: SLIC-CAGE 라이브러리의 유효성 검사. (a) SLIC-CAGE 라이브러리에서 태그 클러스터 인터퀀티들 폭의 분포는 S. 세레비시아 총 RNA의 1, 5, 또는 10 ng로부터 제조되고, S. 세레비시아 총 RNA의 5 μg로부터 제조된 nAnT-iCAGE 라이브러리에서 제조하였다. 1ng SLIC-CAGE 라이브러리에 있는 많은 양의 좁은 태그 클러스터는 낮은 복잡성을 나타냅니다. (B) S. 세레비시아 SLIC-CAGE 라이브러리의 CTSS 식별을 위한 ROC 곡선. 모든 S. 세레비시아 nAnT-iCAGE CTSS는 트루 세트로 사용되었습니다. (C) S. 세레비시아 나노케이지 라이브러리에서 CTSS 식별을 위한 ROC 곡선. 모든 S. 세레비시아 nAnT-iCAGE CTSS는 트루 세트로 사용되었습니다. ROC 곡선의 비교는 SLIC-CAGE가 CTSS 식별에서 나노케이지를 능가한다는 것을 보여줍니다. 어레이익스프레스 E-MTAB-6519의 데이터가 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 담체 합성 유전자의 서열. I-SceI 사이트는 보라색으로 대담하고 기울임꼴로 표시되며 I-CeuI 인식 사이트는 녹색입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>캐리어</td>
			<td colspan="2">역프라이머 5'-3'</td>
			<td>PCR 제품 길이 / bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034년</td>
		</tr>
<tr>
<td>2개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNCACTGGGCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTTTCGTTCGTTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNagTTGACCGCAGTTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNgTGAAGAATTTTTCCCCCCCCCC</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7명</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGCGTT카타AC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNN타타CGCGGTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNACCCCCGCCTTGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10개</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* 전달 프라이머는 모든 캐리어 템플릿에 대해 동일합니다. 밑줄은 T7 프로모터 서열이다. PCR_GN5_f1: 타타그액카타타GNNNNNCAGCGCGCTCTCTCtTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 캐리어 템플릿 증폭을 위한 프라이머. 전달 프라이머는 모든 캐리어 템플릿에 대해 동일합니다. 밑줄은 T7 프로모터 서열이다. PCR_GN5_f1: 타타치아그락카타타GNNNNNCAGCGCGCTCTCTCtA. 상이한 역프라이머를 사용하여, PCR 템플릿 및 따라서 다른 길이의 캐리어 RNA가 생성된다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>캐리어</td>
			<td>길이</td>
			<td>제한되지 않은/μg</td>
			<td>캡 /μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1개</td>
			<td>1034년</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2개</td>
			<td>966</td>
			<td>8.36</td>
			<td>0.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3개</td>
			<td>889</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4개</td>
			<td>821</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5개</td>
			<td>744</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6개</td>
			<td>676</td>
			<td>3.08</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7명</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8개</td>
			<td>531</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9개</td>
			<td>454</td>
			<td>2.64</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10개</td>
			<td>386</td>
			<td>2.2</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: RNA 담체 혼합. 캐리어 믹스 0.3-1 kbp의 총 49 μg: 언캡 = 44 μg, 캡핑 = 5 μg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>총 RNA 입력 /ng</td>
			<td>PCR 주기</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18세</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17세</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16세</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: 샘플 총 RNA 입력에 대한 의존성에서 예상되는 PCR 사이클 수입니다. 대략적인 사이클 수는 사카로미세세스 세레비시아, 드로소필라 멜라노가스터 및 근막 총 RNA를 사용하여 수행된 실험을 기반으로 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>총 RNA 입력/ng</td>
			<td>전체 매핑 %</td>
			<td>% 고유 매핑</td>
			<td>% 캐리어</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30개</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30개</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10개</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>표 5: 예상 매핑 효율 및 총 RNA 입력 량의 의존성. 대략적인 숫자는 사카로마이세스 세레비시아및 무스 근육 총 RNA를 사용하여 수행된 실험에 기초하여 제시되고 기초한다.

유전자 발현(CAGE)의 캡 분석은 단일 뉴클레오티드 분해능에서 RNA 폴리머라제 II 전사 시작 부위를 포착하기 위해 mRNA 5'ends의 게놈 전반의 정량적 매핑을 위한 방법이다. 이 작품은 나노그램 양의 총 RNA를 사용하여 고품질 라이브러리의 생성을 위한 낮은 입력(SLIC-CAGE) 프로토콜을 설명합니다.

초저입력 캐리어-CAGE를 사용한 전사 시작 사이트 매핑

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

이 방법은 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 낮은 양의 시작 물질을 사용하여 핵심 프로모터 및 증강 발견을 가능하게 하기 때문입니다. 이 기술의 주요 장점은 총 RNA의 10 나노그램만을 사용하여 RNA 폴리머라제 II 전사 시작 부위의 편견, 게놈 전체 단일 뉴클레오티드 분해능 매핑을 허용한다는 것입니다. CAGE는 진단 마커로 사용될 수 있는 질병 관련 전사 시작 사이트를 밝히는 데 매우 귀중한 것으로 입증되고 있습니다.SLIC-CAGE는 조직 생검과 같은 견본을 확장하기 위하여 이 발견을 확장합니다. SLIC-CAGE는 광범위한 모델 유기체로부터 초기 배아 발달 단계 또는 배아 조직을 포함한 연약한 세포 유형의 심층 및 고해상도 프로모터 분석에 이상적입니다. 이 프로토콜에는 여러 단계가 있기 때문에 튜브 간에 전송할 때 가능한 한 많은 재료를 검색하는 데 주의를 기울여 각 단계에서 샘플 손실을 최소화하는 것이 중요합니다.각 템플릿에 대한 PCR 믹스를 준비하여 시작합니다. 원고 방향에 따라 완충, dNTPs, 고유 포워드 프라이머, 템플릿 플라스미드와 합성 담체 유전자, 융합 폴리머라제를 결합합니다. 파이프팅으로 시약을 섞습니다.PCR 믹스의 마이크로리터 90개를 각 역프라이머의 10마이크로리터에 넣고 섞는다. 열순환 조건에 대한 원고를 참조하십시오. 관심있는 RNA에 역 전사 또는 RT를 수행합니다.역 전사 프라이머 의 1 마이크로 리터, RNA의 10 나노 그램, 그리고 4, 990 나노 그램의 캐리어 믹스의 총 부피 10 마이크로 리터를 결합합니다. 위아래로 파이프를 통해 섞는다. 혼합물을 섭씨 65도까지 5분간 가열한 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.원고 방향에 따라 RT 믹스를 준비하고 28 마이크로리터를 RNA 10 마이크로리터에 추가합니다. 균질성까지 피펫팅하여 튜브의 내용을 혼합합니다. 열순환기에서 RT를 실행합니다.역전사가 완료되면 DNase 및 RNase 가 없는 SPRI 마그네틱 구슬로 제품을 정화하십시오. 1.8대 1의 볼륨 비율로 RT 믹스에 구슬을 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 혼합물을 실온에 5분간 앉게 하십시오.그런 다음 구슬을 자기 스탠드에 놓고 5 분 동안 분리하십시오. 상체를 버리고 200 마이크로리터를 새로 준비한 70% 에탄올을 구슬에 넣습니다. 비드를 섞거나 마그네틱 스탠드에서 꺼내 서 자판에서 꺼내서 추가 한 후 즉시 에탄올을 제거하지 마십시오.튜브를 마그네틱 스탠드에 보관하고 P10 파이펫으로 남은 방울을 밀어에 의해 에탄올의 모든 흔적을 제거합니다. 즉시 42 마이크로리터의 물을 추가하고, 피펫을 60번 위아래로 엘루시료에 넣고 발포를 일으키지 않도록 주의하십시오. 뚜껑없이 5 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양 한 다음 자기 스탠드에 구슬을 분리합니다.그런 다음, 모든 슈퍼 네티얼을 검색하지만 비드 이월을 피하기 위해주의, 튜브의 새로운 세트로 상체를 전송합니다. RNase I 치료 후, 45 마이크로리터의 샘플과 105 마이크로리터의 준비된 스트렙타비딘 구슬을 혼합하고 30분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 인큐베이션 동안 10분마다 샘플을 파이펫하여 혼합합니다.그런 다음 마그네틱 스탠드에 구슬을 분리하고 상체를 제거합니다. 버퍼 A, B 및 C.를 버퍼 A로 세척하고 버퍼 A로 시작하여 150 마이크로리터의 버퍼로 구슬을 다시 페이스로 재보선합니다. 자기 스탠드에서 2~3분 간 분리한 다음 상체를 제거합니다.버퍼 B와 C를 섭씨 37도로 예열하고 세척 단계를 반복합니다. 모든 비 캡된 RNA를 제거하기 위해, 스트렙타비딘 구슬과 튜브 벽을 철저히 세척하고 다음 을 추가하기 전에 세척 버퍼를 완전히 제거하는 것이 중요합니다. cDNA를 방출하려면 1X RNase I의 35 마이크로리터에서 구슬을 다시 중단하고 5분 동안 섭씨 95도에서 배양합니다.잠복 후 즉시 2 분 동안 얼음에 구슬을 놓습니다. 마그네틱 스탠드에 구슬을 분리하고 상체를 새로운 튜브 세트로 옮기습니다. 1X RNase I 버퍼의 30 마이크로리터에서 구슬을 다시 한 다음 자기 스탠드에서 분리합니다.약 65 마이크로 리터의 총 볼륨에 대한 이전에 수집 된 상체와 상체를 결합합니다. qPCR을 수행하여 대상 라이브러리 증폭을 위한 PCR 주기 수를 결정합니다. 캐리어에서 DNA의 전체 라이브러리를 증폭하기 위한 qPCR 마스터 믹스를 준비한다.원고 방향에 따라 열순환 조건을 설정하고 준비된 샘플을 증폭시하십시오. SLIC-CAGE 프로토콜을 사용하면 시작 RNA 물질의 나노그램으로부터 시퀀싱 준비 라이브러리를 얻을 수 있습니다. 최종 라이브러리의 조각 길이는 200에서 2, 000 베이스 쌍 사이의 범위입니다.짧은 조각은 PCR 아티팩트이며 줄 아래로 시퀀싱 문제가 발생할 수 있습니다. 크기 선택의 추가 라운드를 수행하여 제거할 수 있습니다. NanoCAGE에 비해, SLIC-CAGE는 S.cerevisiae 총 RNA의 다양한 수량에 수행되는 두 기술의 특징 곡선을 작동 수신기에서 분명 전사 시작 사이트 식별에서 훨씬 더 나은 성능을 나타낸다.이 프로토콜을 수행하는 동안 샘플 손실이 복잡성이 낮은 라이브러리로 이어질 수 있음을 명심하는 것이 중요합니다. 이를 방지하기 위해 바인딩이 적은 파이펫 팁과 튜브를 사용해야 합니다. SLIC-CAGE없이, 다양한 세포 유형의 프로모터 분석은 지금까지 액세스 할 수 없습니다.이것은 모형 유기체의 넓은 범위에서 배아 발달 단계 또는 배아 조직의 분석을 포함합니다.

transcription-start-site-mapping-using-super-low-input-carrier-cage

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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