초저입력 캐리어-CAGE를 사용한 전사 시작 사이트 매핑

이 방법은 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 낮은 양의 시작 물질을 사용하여 핵심 프로모터 및 증강 발견을 가능하게 하기 때문입니다. 이 기술의 주요 장점은 총 RNA의 10 나노그램만을 사용하여 RNA 폴리머라제 II 전사 시작 부위의 편견, 게놈 전체 단일 뉴클레오티드 분해능 매핑을 허용한다는 것입니다. CAGE는 진단 마커로 사용될 수 있는 질병 관련 전사 시작 사이트를 밝히는 데 매우 귀중한 것으로 입증되고 있습니다.

SLIC-CAGE는 조직 생검과 같은 견본을 확장하기 위하여 이 발견을 확장합니다. SLIC-CAGE는 광범위한 모델 유기체로부터 초기 배아 발달 단계 또는 배아 조직을 포함한 연약한 세포 유형의 심층 및 고해상도 프로모터 분석에 이상적입니다. 이 프로토콜에는 여러 단계가 있기 때문에 튜브 간에 전송할 때 가능한 한 많은 재료를 검색하는 데 주의를 기울여 각 단계에서 샘플 손실을 최소화하는 것이 중요합니다.

각 템플릿에 대한 PCR 믹스를 준비하여 시작합니다. 원고 방향에 따라 완충, dNTPs, 고유 포워드 프라이머, 템플릿 플라스미드와 합성 담체 유전자, 융합 폴리머라제를 결합합니다. 파이프팅으로 시약을 섞습니다.

PCR 믹스의 마이크로리터 90개를 각 역프라이머의 10마이크로리터에 넣고 섞는다. 열순환 조건에 대한 원고를 참조하십시오. 관심있는 RNA에 역 전사 또는 RT를 수행합니다.

역 전사 프라이머 의 1 마이크로 리터, RNA의 10 나노 그램, 그리고 4, 990 나노 그램의 캐리어 믹스의 총 부피 10 마이크로 리터를 결합합니다. 위아래로 파이프를 통해 섞는다. 혼합물을 섭씨 65도까지 5분간 가열한 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.

원고 방향에 따라 RT 믹스를 준비하고 28 마이크로리터를 RNA 10 마이크로리터에 추가합니다. 균질성까지 피펫팅하여 튜브의 내용을 혼합합니다. 열순환기에서 RT를 실행합니다.

역전사가 완료되면 DNase 및 RNase 가 없는 SPRI 마그네틱 구슬로 제품을 정화하십시오. 1.8대 1의 볼륨 비율로 RT 믹스에 구슬을 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 혼합물을 실온에 5분간 앉게 하십시오.

그런 다음 구슬을 자기 스탠드에 놓고 5 분 동안 분리하십시오. 상체를 버리고 200 마이크로리터를 새로 준비한 70% 에탄올을 구슬에 넣습니다. 비드를 섞거나 마그네틱 스탠드에서 꺼내 서 자판에서 꺼내서 추가 한 후 즉시 에탄올을 제거하지 마십시오.

튜브를 마그네틱 스탠드에 보관하고 P10 파이펫으로 남은 방울을 밀어에 의해 에탄올의 모든 흔적을 제거합니다. 즉시 42 마이크로리터의 물을 추가하고, 피펫을 60번 위아래로 엘루시료에 넣고 발포를 일으키지 않도록 주의하십시오. 뚜껑없이 5 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양 한 다음 자기 스탠드에 구슬을 분리합니다.

그런 다음, 모든 슈퍼 네티얼을 검색하지만 비드 이월을 피하기 위해주의, 튜브의 새로운 세트로 상체를 전송합니다. RNase I 치료 후, 45 마이크로리터의 샘플과 105 마이크로리터의 준비된 스트렙타비딘 구슬을 혼합하고 30분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 인큐베이션 동안 10분마다 샘플을 파이펫하여 혼합합니다.

그런 다음 마그네틱 스탠드에 구슬을 분리하고 상체를 제거합니다. 버퍼 A, B 및 C.를 버퍼 A로 세척하고 버퍼 A로 시작하여 150 마이크로리터의 버퍼로 구슬을 다시 페이스로 재보선합니다. 자기 스탠드에서 2~3분 간 분리한 다음 상체를 제거합니다.

버퍼 B와 C를 섭씨 37도로 예열하고 세척 단계를 반복합니다. 모든 비 캡된 RNA를 제거하기 위해, 스트렙타비딘 구슬과 튜브 벽을 철저히 세척하고 다음 을 추가하기 전에 세척 버퍼를 완전히 제거하는 것이 중요합니다. cDNA를 방출하려면 1X RNase I의 35 마이크로리터에서 구슬을 다시 중단하고 5분 동안 섭씨 95도에서 배양합니다.

잠복 후 즉시 2 분 동안 얼음에 구슬을 놓습니다. 마그네틱 스탠드에 구슬을 분리하고 상체를 새로운 튜브 세트로 옮기습니다. 1X RNase I 버퍼의 30 마이크로리터에서 구슬을 다시 한 다음 자기 스탠드에서 분리합니다.

약 65 마이크로 리터의 총 볼륨에 대한 이전에 수집 된 상체와 상체를 결합합니다. qPCR을 수행하여 대상 라이브러리 증폭을 위한 PCR 주기 수를 결정합니다. 캐리어에서 DNA의 전체 라이브러리를 증폭하기 위한 qPCR 마스터 믹스를 준비한다.

원고 방향에 따라 열순환 조건을 설정하고 준비된 샘플을 증폭시하십시오. SLIC-CAGE 프로토콜을 사용하면 시작 RNA 물질의 나노그램으로부터 시퀀싱 준비 라이브러리를 얻을 수 있습니다. 최종 라이브러리의 조각 길이는 200에서 2, 000 베이스 쌍 사이의 범위입니다.

짧은 조각은 PCR 아티팩트이며 줄 아래로 시퀀싱 문제가 발생할 수 있습니다. 크기 선택의 추가 라운드를 수행하여 제거할 수 있습니다. NanoCAGE에 비해, SLIC-CAGE는 S.cerevisiae 총 RNA의 다양한 수량에 수행되는 두 기술의 특징 곡선을 작동 수신기에서 분명 전사 시작 사이트 식별에서 훨씬 더 나은 성능을 나타낸다.

이 프로토콜을 수행하는 동안 샘플 손실이 복잡성이 낮은 라이브러리로 이어질 수 있음을 명심하는 것이 중요합니다. 이를 방지하기 위해 바인딩이 적은 파이펫 팁과 튜브를 사용해야 합니다. SLIC-CAGE없이, 다양한 세포 유형의 프로모터 분석은 지금까지 액세스 할 수 없습니다.

이것은 모형 유기체의 넓은 범위에서 배아 발달 단계 또는 배아 조직의 분석을 포함합니다.