Name: 암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 생체내 면역형광 국소화(IVIL) 기법을 사용하여 암 연구에서 치료 및 진단 항체의 생체내 분포를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 실시간으로 항체 분포를 시각화하여 항암 치료 효능 연구에 필수적인 정보를 제공합니다.

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우리는 토론 및 장비 사용을 위한 박사 앤드류 올슨 (스탠포드 신경 과학 현미경 검사법 서비스)에게 감사합니다. 유르겐 케이 윌만 박사님의 멘토링에 감사드립니다. 본 연구는 NIH R21EB022214 교부금(KEW), NIH R25CA118681 교육 보조금(KEW), NIH K99EB023279(KEW)에 의해 지원되었다. 스탠포드 신경 과학 현미경 검사법은 NIH NS069375에 의해 지원되었습니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 스탠포드 대학의 실험실 동물 관리에 기관 관리 패널에 의해 승인되었습니다 (APLAC).
1. 유방암 발달의 형질전환 마우스 모형
<ol><li>진행하기 전에 촉진 또는 캘리퍼스 측정을 통해 적절한 종양 성장을 위해 원하는 암 모델로부터 마우스를 관찰하십시오. 참고: 여기에서, 유방암 발달의 형질전환 뮤린 모델 (FVB/N-Tg (MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT)가 사용되었다. 이 동물은 각 유방선20에있는 나이의 6 그리고 12 주 사이에서 침략적인 유방 암종을 자발적으로 개발합니다. 일반적인 유방 땀샘은 이식 유전자 음성, 연령 일치 된 흰자말에서 대조군으로 사용되었습니다.</li>
</ol>2. 특정 및 비특이적 항체 에이전트의 정맥 주사
<ol><li>토끼 항마우스 B7-H3 및 토끼 IgG 이소타입 대조군 항체를 탈염 컬럼(예를 들어, PD-10)에 정화하여 제조자 지침에 따라 방부제 및 저장 완충제를 제거한다. 참고: 일부 항체는 단백질-A 아가로즈 비드 기반 프로토콜21을통해 추가적인 정제가 필요할 수 있다.</li>
	<li>개별 미세 원심 분리튜브에서 각 항체 컨쥬게이트의 33 μg의 알리쿼트 투여량. 참고: 투여된 제제의 투여량은 적용에 따라 달라질 수 있으며 항체 컨쥬게이트가 일상적으로 사용되는 투여량과 일치한다. 동물의 안전을 위해 부피가 100 μL 이상인 경우 항체 용액의 농도가 필요합니다.</li>
	<li>조직 수집 전에 원하는 시점에서, 여기서 96 시간, 2% 이소플루란이 2 L/min에서 산소로 흐르는 종양 베어링 동물을 마취시키고, 37°C 가열된 단계에 놓는다. 수술 전에 적절한 수준의 마취에 도달했는지 확인하기 위해 발가락 을 꼬집십시오.</li>
	<li>항체 용액의 꼬리 정맥 접종을 준비하려면 알코올 닦음으로 세 번 닦아 동물의 꼬리를 소독하십시오. 약 30s의 열 패드로 따뜻하게하여 꼬리 정맥을 넓히십시오. 열 패드를 제거 한 후 알코올 닦아 다시 한 번 꼬리를 닦으십시오.</li>
	<li>27G 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 나비 바늘을 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 삽입하고 수술 용 테이프로 삽입 된 바늘로 꼬리를 조심스럽게 고정시다. 참고: 카테터로의 눈에 보이는 혈액 역류는 꼬리 정맥 내바늘의 적절한 위치를 나타냅니다.</li>
	<li>25 μL의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 카테터를 세척 한 다음 인슐린 주사기를 사용하여 카테터에 항체 용액을 주입하십시오. 멸균 PBS 25 μL로 카테터를 다시 한 번 씻어내십시오.</li>
	<li>꼬리에서 바늘을 제거하고 출혈을 막기 위해 압력을 가하십시오.</li>
	<li>마취를 끄고 고통의 징후가 완전히 깨어날 때까지 동물을 관찰하십시오.</li>
</ol>3. 표적 종양 조직의 수집 및 준비
<ol><li>원하는 시점에서, 허용 가능한 제도적 절차에 따라 동물을 인도적으로 안락사시키고, 여기서, 챔버 변위 유속10-30% 부피/분의 압축 가스 탱크로부터 100%CO2를 점진적으로 흡입하였다. 참고: IVIL 기술의 일부 응용은 자유롭게 순환하는 항체19,22를제거하기 위해 PBS와 심장 관류에 의한 안락사를 요구한다.</li>
	<li>호흡기 및 심장 운동 중단, 발가락 꼬집기 반응 의 부족 및 점막의 회색을 통해 인도적 안락사를 확인한 후, 수술가위와 집게를 사용하여 종양 조직을 다음과 같이 절제하십시오.<ol>
<li>마우스를 척추 위치에 놓고 꼬리에 가장 가까운 유방 땀샘 세트 (5th)사이에피부의 바깥 층만 잡고 집게로 수술 가위로 작은 절개를합니다.</li>
		<li>닫힌 가위를 잘라내고 팁을 천천히 열어 피부를 기본 복벽 막에서 조심스럽게 분리하여 그대로 유지합니다.</li>
		<li>복부까지 수직 절개를하고 피부를 내부 막에서 계속 분리하십시오. 3rd와 4유방 땀샘 사이에, 유방 땀샘의 피부 후퇴와 시각화를 허용하기 위해 복부를 가로 질러 수평 으로 잘라냅니다. 참고 : 유방 종양과 땀샘은 피부 아래에 표면적으로 위치합니다.</li>
		<li>포셉으로 각 종양 또는 정상적인 동맥을 잡고 수술 용 가위를 사용하여 부착 된 피부를 조심스럽게 다듬습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>절제된 조직을 일회용 기본 금형에 넣고, 미리 라벨을 부착하고 최적의 절삭 온도(OCT) 매질로 채우고 드라이 아이스에 배치하여 금형을 빠르게 동결시킴을 느낍니다. 오프 타겟 전달을 연구하기 위해, 관심있는 다른 조직이나 장기를 절제하십시오(예: 간 또는 폐). 참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지하려면 냉동 조직 블록을 -80°C에서 계속 할 준비가 될 때까지 보관하십시오.</li>
	<li>저온 극저온을 사용하여 10 μm 두께의 단면 냉동 조직 블록을 사용하여 미리 표지된 접착 유리 슬라이드에 인접한 섹션을 놓습니다. 참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지하려면 슬라이드를 -80°C에서 계속 할 준비가 될 때까지 저장합니다.</li>
</ol>4. 엑 생체 염색 프로토콜
참고: 형광 현미경 이미지 간의 정량적 비교를 위해 모든 슬라이드는 동일한 준비된 솔루션으로 동시에 염색됩니다.
<ol><li>OCT를 제거하기 위해 실온 PBS로 냉동 조직 슬라이드를 5 분 동안 헹구십시오.</li>
	<li>염색 중에 필요한 용액의 부피를 줄이기 위해 소수성 장벽 펜으로 조직 섹션을 분류합니다. 참고: 슬라이드에서 조직을 제거하거나 영향을받는 조직 부분에 적절한 염색을 방지 할 수 있으므로 펜이 조직 샘플을 통해 실행되지 않도록주의하십시오. 조직 섹션이 언제든지 탈수되지 않도록하십시오.</li>
	<li>조직 섹션을 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 5 분 동안 고정하십시오.</li>
	<li>PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구십시오.</li>
	<li>15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤 - X 100으로 조직 절편을 투과시.</li>
	<li>PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구십시오.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 PBS(블로킹 용액)에서 3% w/v 소 혈청 알부민(BSA) 및 5% v/v 염소 세럼으로 조직을 차단합니다. 참고: 차단 용액 혈청을 이차 항체 숙주 동물과 일치시다.</li>
	<li>PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구십시오.</li>
	<li>원하는 대로 기록 유지 1 차 항체, 아마도 일반적인 핵 (예를 들어, DAPI), 혈관 (예를 들어, CD31) 또는 세포질 마커 (예를 들어, 액틴)를 가진 절편을 배양한다. 여기서, 랫트 항-마우스 CD31(혈관 마커)을 1:100 희석에서 슬라이드 트레이상에서 탈수로부터 보호된 4°C에서 하룻밤 동안 차단 용액에서 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 참고: 1차 항체 또는 항체 컨쥬게이트를 추가로 추가하지 마십시오. 생체 내에서 조직에 주입및 축적되도록 허용된 컨쥬게이트는 1차 항체로서 작용한다.</li>
	<li>PBS에서 5분 동안 3회 씩 슬라이드를 헹구고 매번 PBS를 변경합니다.</li>
	<li>1 차적인 항체를 표지하기 위하여 이차 항체를 가진 배양 슬라이드. 이 응용 프로그램의 경우, 알렉사플루오르-546 공액 염소 항토끼 항체(제조업체의 지침에 따라 최적화된 1:200 희석)와 AlexaFluor-488 염소 항체를 이용한 CD31(1:200)을 사용하여 항-B7-H3 항체를 시각화합니다. 희석, 제조업체의 지침에 따라 최적화) 차단 솔루션, 슬라이드 트레이에 빛과 탈수로부터 보호, 실온에서 1 시간 동안. 참고: 이차 항체는 동일한 숙주 동물로부터 그러나 각각의 1차 항체의 숙주 종에 이차 항체의 친화도와 일치한다. 슬라이드는 이 시점부터 빛으로부터 보호됩니다.</li>
	<li>PBS에서 5분 동안 3회 씩 슬라이드를 헹구고 매번 PBS를 변경합니다.</li>
	<li>마운팅 매체를 티슈 슬라이스 중앙에 한 방울 떨어뜨리고 기포가 갇히지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.</li>
	<li>뚜껑의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하고 건조시도록 하십시오. 참고: 이 시점에서 최대 1주일 동안 프로토콜을 일시 중지하려면 계속 할 준비가 될 때까지 -20 °C에서 슬라이드를 저장합니다.</li>
</ol>5. 공초점 현미경 이미징 및 정량적 이미지 분석
참고: 공초점 현미경 및 이미징 파라미터를 준비하는 것은 사용되는 공초점 시스템에 따라 달라집니다. 여기서 사용된 현미경은 상업적으로 구입하였다(예를 들어, 자이스 LSM 510 메타 시스템) 관련 수집 소프트웨어(예를 들어, Zen 2009)를 사용하였다. 그러나, 이 단계의 다수는 어떤 공초점 현미경든지에 적용되고 기본적인 공초점 현미경 지식을 가정할 것입니다.
<ol><li>시스템을 켜고 워밍업한 후 원하는 목표를 선택합니다. 여기서 20x(숫자 조리개 = 0.8) 목표가 사용되었습니다.</li>
	<li>가장 밝은 신호에 대한 최적화를 설정할 수 있도록 포지티브 컨트롤 슬라이드를 아래로 덮어 놓습니다. 빨간색 채널에서 이미징을 하고 라이브 이미징 모드에서 샘플에 시스템을 집중시음합니다.</li>
	<li>사용되는 각 레이저 채널에 대해 다음과 같이 레이저 강도, 마스터 게인 및 핀홀 크기를 최적화합니다.<ol>
<li>이미징을 위해 연속 모드로 전환합니다.</li>
		<li>조회 테이블(LUT) 히스토그램을 모니터링하면서 레이저 강도(레이저 전력을 제어하는) 및 게인(마스터)(광증배관의 전압을 제어하는) 슬라이드 바를 최적화합니다. 픽셀을 포화하지 않고 히스토그램의 동적 범위가 채워지도록 이 두 설정을 조정합니다. 참고 : 레이저 강도가 너무 높으면 광 표백이 발생합니다. 게인(마스터)이 너무 높으면 이미지가 시원해집니다. 이상적으로, 게인 (마스터)는 범위의 중간에있을 것입니다.</li>
		<li>핀홀을 가장 높은 해상도와 가장 얇은 z 슬라이스를 제공하는 통풍이 잘되는 장치(AU)로 설정합니다.</li>
		<li>디지털 오프셋 바를 밀어 LUT 히스토그램의 노이즈 플로어를 최소화하여 진정한 검은색 배경을 만드십시오. 참고: 현미경 설정이 각 레이저 채널과 목표에 최적화되면, 슬라이드 간의 정량적 비교를 허용하기 위해 이미징 세션 전체와 모든 슬라이드의 이미징을 위해 현미경 을 일정하게 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>수집 모드 탭에서 평균화에서 원하는 숫자 및 비트 깊이를선택합니다. 최적의 픽셀 크기를 설정하려면 최적 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>스냅 수집 버튼을 사용하여 고품질 이미지를 수집합니다. 여기서, 임의의 시야는 종양 내에서 선택되었지만, 다른 관심 분야는 다른 적용(혈관, 종양 마진, 침투 깊이 등)을 신청할 수 있다.</li>
	<li>오프라인 처리 및 정량화를 위해 공초점 소프트웨어(여기 ".lsm")에서 사용하는 형식으로 이미지 파일을 저장합니다. 참고: 모든 슬라이드가 동일한 세션 중에 이미지화되지 않은 경우 설정을 저장하고 이후 방문 시 다시 로드할 수 있지만 사진 표백으로 인해 동일한 슬라이드를 다시 이미징하는 것은 권장되지 않습니다.</li>
	<li>정량형 형광 강도 측정을 수행합니다. 피지 열기 (피지는 그냥 ImageJ 소프트웨어)19,23 상태 표시줄에 드래그 하 여 .lsm 이미지 파일을 로드 합니다.</li>
	<li>색상 채널 데이터를 분할합니다. 이미지 > 스택 > 분할 채널로이동합니다.</li>
	<li>필요에 따라 형광 이미지를 전처리, 즉, 배경 신호를 빼거나(프로세스 > 배경을 빼기)필터링 방법을 통해 노이즈를 감소.</li>
	<li>신호 강도에 임계값을 설정하여 기준 단백질(혈관, 핵, 세포 얼룩)에 해당하는 색상 채널을 분할합니다(이미지> adjust > 임계값). 참고: 수동 임계값은 이미지 분석에 주관성을 도입하므로 자동 임계값 알고리즘을 사용하거나 이미지 히스토그램을 참조하면 이미지 분석 결과가 편향되지 않습니다.</li>
	<li>이 임계값을 사용하여 이진마스크(Process > 이진 > 마스크로 변환)를만듭니다.</li>
	<li>마스크 내의 ROI를 측정하고 레이블을 지정합니다(분석> 입자 분석 > 관리자에 추가 확인 > OK).</li>
	<li>관심 있는 항체에 해당하는 컬러 채널에 ROI를 적용합니다(채널 이미지 클릭, 분석 > 도구 > ROI 관리자 > 측정). 이렇게 하면 마스크 ROI를 항체 이미지에 적용하고 결과 창에서 레이블 섹션에 대한 이미지 측정을 제공합니다. 결과 창저장(파일 > 저장).</li>
	<li>여기서 설명된 평균 형광 강도와 같은 관심의 원하는 통계를계산한다(24).</li>
	<li>슬라이드 집합 내에서 각 이미지와 동일하게 모든 처리 단계를 수행합니다. 큰 이미지 일괄 처리23에대해 자동으로 이 작업을 수행하는 매크로를 만듭니다.</li>
	<li>정량적 측정 후에만 이미지 디스플레이의 경우 정성적 이미지 조정을 적용하여 모든 슬라이드에서 동일한 레벨로 최소, 최대, 밝기 및 대비를 조정하여 바이오 배포 패턴의 시각화를 최적화합니다(이미지> adjust > 밝기/대비)를</li>
	<li>이미지 유형(이미지 > Type > RGB 색상)을변환하고 프리젠 테이션 및 출판물에 사용하기 위해 .tiff(파일 > 저장 로 > Tiff...)와 같은 무손실 이미지 유형으로 파일을 저장합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 메서드에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며 성공적인 구현을 위해 잠재적인 수정이 필요합니다. 첫째, 항체/항체 컨쥬게이트 정맥 주사의 투여량 및 타이밍은 특정 용도에 맞게 조정되어야 한다. 일반적으로, 투여량은 항체 컨쥬게이트가 전형적으로 사용되는 방법, 즉 치료용 항체 또는 항체 기반 조영제의 매칭 투여량과 일치하는 방식과 일치하는 것을 사용되어야 한다. 또한 표적 조직의 수집 시기를 신중하게 고려해야합니다. 항체 및 항체 접합체는 표준 약물 및 조영제보다 더 긴 순환 시간을 갖지만, 이들은 매우 가변적이며 원하는 적용을 위해 최적화되어야하지만 적어도 24 시간 의 순환 시간 27을 허용하는 것이 좋습니다. . 둘째, 표적 조직 수집 동안, 혈액풀(19)으로부터자유롭게 순환하는 항체를 제거하기 위해 심장 내 관류 기술을 구현할 필요가 있다. B7-H3-ICG의 종양 분포를 살펴보면, 충분히 긴 순환 시간(96h) 및 에이전트의 혈관 외 국소...

단클론 항체(mAb)는 B 세포에 의해 분비되는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 큰 당단백질(약 150 kDa)이며, 면역계에서 1차 적인 기능을 가지고 있는 것은 생물학적 기능을 식별하고 억제하거나, 또는 파괴, 세균 또는 바이러스 성 병원체, 암 세포에 비정상적인 단백질 발현을 인식할 수 있습니다1. 항체는 생물 의학2에서매우 유망한 도구를 만드는 펨토몰 농도까지 그들의 특정 에피토프에 매우 높은 친화력을 가질 수 있습니다. 밀스타인과 쾰러 (1984 년 노벨상 수상)에 의해 하이브리드 도마 기술의 개발과 함께, mAbs의 생산이 가능하게되었다3. 이후, 인간 mAb는 파지 디스플레이 기술 또는 형질전환 마우스 균주를 이용하여 생성되었고, 그들의 새로운 연구 도구 및 치료제로서의 사용에혁명을일으켰다4,5.
암은 전 세계적으로 건강 문제이며 예방, 탐지 및 치료에 대한 새로운 접근법의 필요성을 만드는 주요 사망 원인6. 현재까지, mAbs는 종양 발생에 있는 유전자 그리고 그들의 단백질의 역할의 구출을 허용하고 암 biomarkers에 대하여 지시될 때, 환자 계층화를 위한 종양 탐지 그리고 특성화를 가능하게 할 수 있습니다. 암 치료의 경우, 이중특이적 mAbs, 항체-약물 접합체 및 더 작은 항체 단편이 치료제로서 개발되고 있으며, 표적 약물 전달을 위한 치료 효능을 향상시키기 위해7. 추가적으로, 항체는 형광 유도 수술, 광음향 (PA) 화상 진찰, 초음파 (미국) 분자 화상 진찰 및 임상으로 이용된 양전자 방출과 같은 분자 화상 진찰 양식에 대한 조영제의 biomarker 표적화를 위해 봉사합니다 단층 촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)8. 마지막으로, 항체는 또한 표적 치료에 대한 환자의 계층화 및 반응 모니터링을 가능하게 하는 라노스틱 제제로서 사용될 수있다 9. 따라서, 새로운 mAb는 암 탐지, 진단 및 처리에 있는 중요한 역할을 하기 시작됩니다.
신규하고 고도로 구체적인 mAb의 개발 및 생산에 있어 중요한 발전에도 불구하고 종양 환경의 복잡성으로 인해 진단 및 치료 응용 분야는 비효율적일 수 있습니다. 항체 상호작용은 에피토프의 종류에 의존한다,즉,선형 또는형태(10)인지. 항원의 인식 이외에, 항체는 항원을 발현하는 표적 세포에 도달하기 위하여 혈관 벽, 기저 막 및 종양 기질과 같은 자연적인 방벽을 극복할 필요가 있습니다. 항체는 가변 단편 항원 결합(Fab) 도메인을 통해서뿐만 아니라 상수 결정성 단편(Fc)을 통해조직과 상호작용하여 오프사이트상호작용(11)을더욱 유도한다. 표적화는 또한 종양 혈관화 및림프계(12,13)에서종양 벌크 및 이질성을 통하여 종양 마커의 이질적인 발현에 의해 복잡해진다. 또한, 종양 미세 환경은 종양 세포를 지원하는 암 관련 섬유 아세포, 항 종양 면역 반응을 억제하는 종양 면역 세포, 산소 및 영양소의 수송을 지원하는 종양 내피로 구성됩니다. 항체 기반 치료제 또는 진단의 침투, 분배 및 가용성을 방해합니다. 전반적으로, 이러한 고려 사항은 치료 또는 진단 효능을 제한하고, 치료 반응을 감소시키고, 종양 저항성을 초래할 수 있다.
따라서, 효율적인 항체 기반 치료법 및 진단의 개발을 위해, 종양 미세환경 내의 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 현재, 전임상 연구에서, 종양 연구 모델에서마커 발현은 종양섹션(14)의면역형광(IF) 염색에 의해 생체내 생체내를 분석한다. 표준 IF 염색은 동물에게서 분리된 ex vivo 종양 조직 조각에 이차 형광표지된 항체에 의해 그 때 강조되는 1 차적인 마커 특정 항체로 실행됩니다. 이 기술은 조직 고정시의 마커의 정적 위치를 강조하고 항체 기반 치료제 또는 진단이 생리적 조건에서 어떻게 분배하거나 상호 작용할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. PET, SPECT, 미국 및 PA에 의한 분자 이미징은 살아있는 전임상 모델8,15에서항체 접합조제 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 이미징 양식은 비침습적이기 때문에, 종방향 연구를 수행할 수 있으며, 시간에 민감한 데이터는 그룹당 최소한의 동물로 수집될 수 있다. 그러나, 이러한 비침습적 분자 이미징 접근법은 충분히 민감하지 않으며 세포 수준에서 항체 분포의 국소화를 위한 충분한 분해능이 없다. 부가적으로, 1차 항체의 물리적 및 생물학적 특성은조영제(16)의컨쥬게이션에 의해 크게 변화될 수 있다.
항체 기반 치료제 및 진단이 종양 환경 내에서 상호 작용하는 방법을 고려하여 생체 내 생리학적 및 병리학적 조건을 취하고 고해상도 세포 및 심지어 하위 세포 분포를 얻기 위해 비 공액 항체의 프로파일, 우리는 항원 특이적 항체가 생체 내에서 정맥 주사되는 생체 내 면역 형광 국소화 (IVIL)로 간주되는 IF 접근법을 제안합니다. 항체 기지를 둔 치료 또는 진단은, 1 차적인 항체로 작용하고, 기능성 혈관에서 순환하고 고도로 정확한 살아있는 종양 환경에서 그것의 표적 단백질에 묶습니다. 생체 내 표지된 종양을 1차 항체와 분리한 후, 이차 항체는 축적되고 유지된 항체 접합체를 국소화하는 데 사용된다. 이 접근법은 형광 표지된 항체17을주입하는 이전에 기술된 IF 진학 접근법과 유사하다. 여기서, 비공액 항체의 사용은 항체 변형에 의해 유도된 생체 분포 특성의 잠재적 변화를 피한다. 더욱이, 형광 이차 항체의 생체 내 적용은 조직 수집 및 처리 동안 형광 신호의 가능한 손실을 방지하고 형광 신호 강도의 증폭을 제공한다. 당사의 라벨링 접근법은 항체 기반 약물 및 표적 제제의 생체 분포를 반영하며 새로운 진단 및 치료제 개발을 위한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
여기에서, 우리는 유방암 검출을 위한 분자 화상 진찰 접근을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 조사하는 이전 연구 결과에서 적용된 것과 같이 IVIL 방법의 2개의 응용을 기술합니다. 첫째, 형광 및 광음향 분자를 위한 항체 근적외선 염료 접합체(근적외선 형광 염료, 인도시아닌 그린, B7-H3-ICG)와 이소타입 제어제(Iso-ICG)의 생체 분포 이미징은18. 이 응용 프로그램의 메서드는 프로토콜에 설명되어 있습니다. 다음으로, 네크린-1에 대한 형태적으로 민감한 항체의 생체 분포 결과는, 통상적으로 기존의 IF 이미징으로 검출할 수 없으며, 초음파 분자 이미징과 함께 사용되며, 대표적인 결과19에제시된다. 이 프로토콜 논문의 끝에서, 독자는 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 채택 편안하게 느껴야한다.

<table><tbody><tr><td>Animal Model</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002374</td><td>Females, 4-6주 령</td></tr><tr><td>Animal Handling Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G Catheter</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td><td></td></tr><tr><td>를 주문하려면 전화주세요.알코올 물티슈</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246073</td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지 (4" x 4" 16 Ply)</td><td>Cardinal Health</td><td>2913</td><td></td></tr><tr><td>히트 램프</td><td>Morganville Scientific</td><td>&nbsp; HL0100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>수술 테이프</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base</td><td>Molds Fisher Scientific</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도(OCT) 중간</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>외과용 런던 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488 염소 항쥐 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-546 염소 항-토끼 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-594 염소 항-인간 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11014</td><td></td></tr><tr><td>인간 IgG 이소타입 제어</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97043</td><td></td></tr><tr><td>인간화 항-netrin-1 항체&nbsp;</td><td>Netris Pharma</td><td></td><td>contact@netrispharma.com</td></tr><tr><td>토끼 안티 마우스 CD276 (B7-H3)</td><td>Abcam</td><td>ab134161</td><td>EPNCIR122 클론</td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>MEC 13.3 클론</td></tr> <tr><td>< 강력 > 시약< / 강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>클리어 네일 </td><td></td><td></td> 폴란드어 <td>모든 지역 약국</td></tr><tr><td>Indocyanine Green - NHS</td><td>Intrace Medical</td><td>ICG-NHS 에스테르</td><td></td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TA-006-FM</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19135680</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>멸균 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Glass Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>탈염 컬럼</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544G</td><td></td></tr><tr><td>소수성 배리어 펜</td><td>Ted Pella</td><td>22311</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 염색 트레이</td><td>VWR</td><td>87000-136</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FIJI LOCI, UW-Madison.</td><td>버전 4.0</td><td>https://fiji.sc/</td></tr></tbody></table>

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

단일 클론 항체 (mAbs)는 암 검출, 진단 및 치료에 중요한 도구입니다. 그(것)들은 종양 발생에 있는 단백질의 역할을 해명하기 위하여 이용되고, 종양 탐지 및 특성화를 가능하게 하는 암 biomarkers에 지시될 수 있고, 면역 이펙터 세포를 활성화하기 위하여 mAbs 또는 항체 약 접합체로 암 치료에 사용될 수 있고, 억제하기 위하여 신호 경로, 또는 직접 특정 항원을 운반 하는 세포를 죽일. 신규하고 고도로 특이적인 mAbs의 개발 및 생산에 대한 임상적 진보에도 불구하고, 진단 및 치료 응용은 종양 미세 환경의 복잡성과 이질성에 의해 손상될 수 있다. 따라서, 효율적인 항체 기반 치료 및 진단의 개발을 위해, 살아있는 종양 미세 환경과 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 생체 내 면역형 광형 국소화 (IVIL)를 생체 내 생리및 병리학 적 조건에서 항체 기반 치료제 및 진단의 상호 작용을 연구하는 새로운 접근법으로 설명합니다. 이 기술에서, 치료 적 또는 진단 항원 특이적 항체는 정맥 내 생체 내에서 주입되고 분리된 종양에서 이차 항체를 가진 생체외 로 국소화된다. 따라서 IVIL은 항체 기반 약물 및 표적화제의 생체내 생체 분포를 반영한다. 2개의 IVIL 응용은 유방암의 분자 화상 진찰을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 평가하는 기술됩니다. 이 프로토콜은 미래 사용자가 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 적응 할 수 있습니다.

IVIL 방법은 B7-H3-ICG 및 Iso-ICG의 생체 내 생체 분포 및 조직 상호 작용을 검사하기 위해 여기에서 사용되었으며, 살아있는 동물에 정맥 주사 후, 96 시간 동안 표적 조직과 상호 작용한 다음 조직이 일단 조직에 상호 작용하도록 함으로써 에이전트를 허용하였다. 수확, 생체 내 면역 염색 동안 1 차 항체로서 작용한다. 상기 IVIL 방법은 또한 B7-H3 마커에 대한 조직의 표준 생체 내 IF 염색과 비교되었다. 일반적인 뮤린 유방 땀샘은 B7-H3 마커를 발현하지 않으며, 생체 내에서 확인되었으며, 표준 IF 염색을 하고, 다른 수동 메커니즘을 통해 항체를 축적하지 않으며, 따라서 B7-H3-ICG 또는 Iso-ICG의 축적이 검출되지 않았으며, 대표적인 음수 결과(그림 1,맨 위 행). 그러나, 뮤린 유방 종양은 혈관 구조와 상피 둘 다에서 B7-H3를 표현합니까 (...

생체 내 면역형광 국소화(IVIL) 방법은 생체내 종양 표적화 및 ex vivo 면역염색의 조합을 사용하여 살아있는 유기체에서 종양학적 목적을 위해 항체 및 항체 접합체의 생체 분포를 검사하는데 사용될 수 있다. 방법.

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

생체 내 면역형광국화 또는 IVIL을 위한 이 프로토콜은 암 연구, 검출 및 치료를 위한 진단 및 치료 항체 또는 항체 기반 제제의 생체 내 생체 분포를 평가한다. 항원의 세포 발현이 밝혀진 종래의 면역형성 염색과는 대조적으로, IVIL 방법은 살아있는 동물에서 항체 및 항체 기반 제제가 어떻게 분배되는지 해명한다. 이 비디오는 IVIL 메서드의 전반적인 워크플로우를 이해하는 데 도움이 됩니다.그것은 다른 응용 프로그램 및 항체에 대한 프로토콜의 성공적인 재생산을위한 중요한 세부 사항을 보여줍니다. 진행하기 전에 심Pation 또는 캘리퍼 측정을 통해 적절한 종양 성장을 원하는 암 모델에서 마우스를 관찰한다. 토끼 안티 마우스 B7-H3 및 토끼 IgG 등형 제어 항체를 탈염 컬럼에 정화하여 제조업체 지침에 따라 방부제 및 저장 버퍼를 제거합니다.개별 미세 원심 분리기 튜브에서 각 항체 컨쥬게이트의 33 마이크로그램의 Aliquot 투여량. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 마취에 따라 항체 용액의 꼬리 정맥 접종을 준비한다. 알코올 닦아세면 동물의 꼬리를 소독합니다.약 30초 동안 열패드로 따뜻하게 하여 꼬리 정맥을 팽창시다. 전체 동물을 가열하지 마십시오. 27 게이지 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 나비 바늘을 삽입합니다.카테터에 혈액 역류를 시각화하여 바늘이 제대로 배치되어 솔루션이 꼬리에 포획되는 것과 동물을 완전히 입력할 수 있도록 합니다. 수술 용 테이프를 사용하여 삽입 된 바늘로 꼬리를 조심스럽게 수정합니다. 카테터를 멸균 인산염 완충식식염 25마이크로리터로 씻어내면 됩니다.그런 다음, 인슐린 주사기를 사용하여 카테터에 항체 용액을 주입한다. 멸균 PBS의 25 마이크로 리터와 카테터를 다시 한번 플러시. 꼬리에서 바늘을 제거하고, 출혈을 중지 압력을 적용합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스의 인도적인 안락사를 수행하고 마우스를 supine 위치에 놓습니다. 종양 조직을 절제하기 위하여 외과 가위와 집게를 사용하십시오. 집게를 사용하여 꼬리에 가장 가까운 유방 땀샘 세트 사이의 피부 외부 층만 파악하고 수술 가위로 작은 절개를합니다.닫힌 가위를 절단에 넣고 팁을 천천히 열어 피부를 기본 복벽 막과 조심스럽게 분리하여 그대로 유지합니다. 복부를 수직으로 절개하여 피부를 내부 막과 분리하십시오. 세 번째와 네 번째 유방 땀샘 사이에, 피부의 후퇴와 유방 땀샘의 시각화를 허용하기 위해 복부를 가로 질러 수평 컷을합니다.각 종양 이나 일반 동맥을 집게로 잡고 외과 가위를 사용하여 부착 된 피부를 조심스럽게 다듬습니다. 절제된 조직을 미리 표지되고 최적의 절삭 온도가 포함되는 조직 일회용 염기 몰드에 놓습니다. 드라이 아이스에 배치하여 금형을 신속하게 동결합니다.오프 타겟 전달을 연구하기 위해 다른 조직이나 관심 기관을 소비합니다. 저온기를 사용하여 10미크론 두께로 단면 고정 된 조직 블록을 만들고 인접한 섹션을 미리 표지된 접착 유리 슬라이드에 놓습니다. 냉동 티슈 슬라이드를 실온 PBS로 5분간 헹구어 내장 매체를 제거합니다.염색 하는 동안 필요한 솔루션의 볼륨을 줄이기 위해 소수성 장벽 펜조직 섹션을 마마로테. 4%의 파라포름알데히드 용액으로 조직 섹션을 5분간 수정합니다. PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구고, PBS에서 0.5%의 트리톤 X-100을 15분 동안 과미로 분류합니다.5분 동안 PBS에서 슬라이드를 다시 헹구십시오. 볼륨 소 세럼 알부민당 3%의 중량과 실온에서 1시간 동안 부피 염소 세럼당 5%의 부피를 함유한 PBS로 조직을 차단합니다. PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구고, 일반적인 핵, 혈관 또는 세포질 마커와 같은 기록 보관 1차 항체로 섹션을 배양한다.여기서, 쥐 안티 마우스 CD31은 차단 용액에서 일대일 100 희석에 사용된다. 1차 항체가 있는 슬라이드는 밤새 섭씨 4도에 남아 있으며 슬라이드 트레이의 탈수로부터 보호됩니다. 인큐베이션에 따라 PBS에서 슬라이드를 세 번 5분간 헹구십시오.매번 PBS를 변경합니다. 1 차 항체를 표지하기 위해 이차 항체로 슬라이드를 배양합니다. 이 적용을 위해 알렉사 플루오(546)를 이용한 항B7-H3 항체를 시각화하고, 차단용에서 알렉사 플루어 488 염소 항쥐 이차 항체로 CD31을 시각화한다.슬라이드 트레이의 조명과 탈수로부터 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 보호합니다. 이전과 같이 PBS에서 슬라이드를 헹구고, 티슈 슬라이스의 중앙에 장착 매체의 한 방울을 적용합니다. 조심스럽게 기포의 함정을 피하기 위해 커버 슬립을 배치합니다.뚜껑 가장자리를 명확한 매니큐어로 밀봉하고 건조시키십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 공초점 현미경 이미징 및 정량적 이미지 분석을 진행합니다. 대표적인 공초점 현미경 사진은 정상 또는 암종 조직을 포함하는 뮤린 유방 땀샘에서 특정 B7-H3 항체-ICG 컨쥬게이트 및 비특이적 동위원소 대조군 항체-ICG 컨쥬게이트 국소화를 비교하는 것을 보여준다.이소-ICG 또는 B7-H3-ICG로 정맥 주사하고 CD31로 대응하는 동물의 정상적인 명골 모샘은 항체 컨쥬게이트의 염색을 보이지 않는다. 정상 조직은 표준 전 생체 면역 형광 염색에 의해 B7-H3의 발현이 없는 것으로 나타났다. 침습성 유방 종양에서 B7-H3-ICG는 생체 내첫 접촉 지점인 혈관에 강하게 결합한 다음 혈관에서 이질적으로 종양 상피를 염색할 수 있습니다.ISO-ICG는 종양 조직 내의 비특이적 축적을 보여줍니다. 표준 전 생체 내 피세포 에 B7-H3 마커의 균일 한 발현을 나타낸다. 대표적인 공초점 현미경사진은 악성암과 정상 유방땀샘에서 넷린-1 발현 또는 등류형 대조현을 검출하는 생체 내 면역형국화 방법을 보여준다.생체 내 면역플루오에시언국화는 MMTV-PyMT 종양에서 넷린-1에 대한 상피 신호를 확인하지만 정상적인 유방 땀샘에서는 확인되지 않습니다. 더욱이, 유 방 종양의 내피 세포에 강한 넷린-1 신호가 있다, 공동화 된 황색 신호에 의해 표시. 신호는 일반적인 유방 선지에서 상당히 약합니다.IVIL 방법은 항체 투여량, 조직 수집 타이밍 및 이차 항체 희석의 관점에서 최적화되어야 성공적인 구현을 위해 최적화되어야 합니다. IVIL은 조직 처리를 필요로 하는 표준 면역 형광 얼룩을 사용하여 검출될 수 없는 형성 전형의 표적을 허용합니다. 또한 종양 을 낳는 마우스의 건강한 장기는 치료 항체의 오프 타겟 전달을 평가하기 위해 수집 될 수 있습니다.암 연구 및 관리에서 항체 기반 치료제 및 조영제의 사용이 증가함에 따라 IVIL 방법은 제약 연구 및 개발에 매우 적용 가능합니다. 암 치료, 분자 이미징, 염증 및 기타 분야의 연구원은 IVIL 방법이 유용한 정보를 제공한다는 것을 발견 할 수 있습니다.

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공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

이 비디오는 마우스 종양 이종 이식 모델에서 종양 특이적 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 기술을 보여줍니다. 종양 형성을 위해 암세포를 마우스에 피하 주입하면 종양 특이적 수용체에 결합하는 형광 표지된 항체를 주입하여 이미징을 통해 항체 국소화를 생체 내에서 평가할 수 있습니다.

종양 특이적 항체의 In vivo 국소화를 평가하는 기법

이 동영상은 유방암의 쥐 모델에서 종양 표적 항체의 생체 내 분포를 연구하기 위한 IVIL(in vivo immunofluorescence localization) 기술을 보여줍니다. 마우스에 종양 특이적 항체를 정맥 주사하면 종양을 외과적으로 분리하고 종양 조직 내 항체의 국소화를 생체 외 면역 염색을 통해 확인합니다.

항체 생체내 분포를 연구하기 위한 In Vivo Immunofluorescence 국소화 방법

이 비디오는 마우스 종양 이종 이식 모델에서 생체 내 항체 국소화를 위한 형광 이미징 방법을 보여줍니다. 그것은 피부 아래에 고체 이종 이식편을 생성하기 위해 마우스에 종양 세포를 주입하는 것을 포함합니다. 후속 형광 항체 주입은 종양 이종이식 세포 내에서 향상된 형광 신호를 통해 특정 국소화를 확인합니다.

마우스 종양 이종이식 모델에서 항체 국소화를 위한 In vivo Fluorescence Imaging

이 비디오는 마우스 모델에서 종양의 생체 내 이미징을 위한 방사성 면역접합체와 관련된 기술을 보여줍니다. 방사성 면역접합체를 주입하면 접합체의 항체는 암세포의 특정 막 항원에 결합합니다. 접합체의 방사성 추적자는 주변 전자와 상호 작용하여 에너지를 생성하는 양전자를 방출하며, 이는 양전자 방출 단층 촬영(PET) 스캐너에 의해 감지되어 종양의 이미지를 생성합니다.

방사선 표지된 항체를 사용하여 쥐 모델에서 종양을 감지하는 In Vivo PET 이미징 기술

이 비디오는 마우스 모델에서 종양으로의 이중특이성 항체 유도 T 세포 이동을 추적하는 방법을 보여줍니다. 루시페라아제(Luciferase)에 의해 형질도입된 effector T 세포를 피하 종양 세포 이종이식편을 통해 마우스에 주입합니다. 그런 다음 이중특이성 항체를 도입하여 T 세포와 종양 세포에 결합합니다. T 세포의 국소화는 생물 발광 이미징을 사용하여 추적되며, 신호의 크기는 T 세포가 종양으로 침투하는 정도를 나타냅니다.

종양에 대한 이중특이성 항체 유도 T 세포 이동을 추적하는 In Vivo 기술

이 프로토콜은 형광단 표지 나노체 및 기존 항체를 사용하여 마우스에서 생체 내 근적외선 형광 이종 이식 이미징 실험의 생체 외 검증을 수행하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

나노 바디 및 항체 기반의 검증<em&gt; 생체</em마우스에서&gt; 종양 이종 이식 NIRF 이미징 실험 사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 유동 세포 계측법 및 현미경

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

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우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

배우세요 생체내 면역형광 국소화(IVIL) 기법을 사용하여 암 연구에서 치료 및 진단 항체의 생체내 분포를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 실시간으로 항체 분포를 시각화하여 항암 치료 효능 연구에 필수적인 정보를 제공합니다.

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

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