새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

면역 강수량은 표적 단백질을 분리하고 정화하는 매우 강력한 기술입니다. 매끄러운 조건에서, 단백질, 레귤레이터, 또는 기판은 공동 면역 전염될 수 있다. 그런 다음 새 상호 작용 네트워크가 검색될 수 있습니다.

면역 절전 단백질의 활성도 평가될 수 있다. 특히, 키나아제의 활성은 P32-ATP 라벨링에 의해 상이한 기판상에서 시험될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 질병에 관여하는 키나아제표적억제제의 활성을 평가할 수 있다.

그(것)들은 새로운 약을 개발하기 위하여 지도 화합물을 구성할 수 있습니다. 이 방법은 포유동물에서 효모 또는 박테리아로 확장될 수 있다. 이 기술은 그렇게 어렵지 않습니다.

핵심 점:감지된 상호작용이 특정한지 확인하기 위해 음의 제어를 하고, 상호 작용과 활동을 유지하기 위해 리시스 조건을 신중하게 선택하십시오. 작은 세부 사항과 제스처는이 기술의 성공을 보장하는 데 중요하며, 문서의 재료와 방법에 설명되지 않습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 Fabienne Godin이 될 것입니다.

세포가 생물 안전 캐비닛 내의 세포 배양실에서 제조된 후, 10밀리리터 파이펫을 사용하여 플레이트에서 미디어를 제거하고 표백제로 전용 폐병에 버려십시오. 그런 다음 10 밀리리터의 신선한 보충 DMEM을 추가하고 접시를 섭씨 37도에서 인큐베이터에 다시 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에 트랜스펙트 혼합물을 준비하려면 pH 7.5에 10 밀리머트리스 염산염용 10밀리미터 의 마이크로리터 450마이크로리터를 추가하고, 1밀리머 EDTA와 2.5개의 어금니 칼슘 염화물 용액50마이크로리터를 보충합니다.

반전으로 섞으세요. 튜브에, 혈장 DNA의 10 마이크로 그램에 대응하는 볼륨을 추가, DNA 미디프 키트에 의해 증폭, 이 키트의 용출 버퍼로 희석, 누구의 농도가 결정되었다. 튜브를 반전하여 혼합합니다.

그런 다음, 소용돌이 믹서에 부드러운 동요와 함께, 천천히 추가 500 BES 완충 식염수 2X 농축물의 마이크로 리터, 튜브에 드롭하여 드롭. DNA와 칼슘 인산염 사이의 복잡한 형성을 방해하지 않도록 매우 신중하게 움직입니다. 실온에서 최소 15분 또는 최대 45분 동안 배양합니다.

이제 플레이트를 인큐베이터에서 안전 캐비닛으로 트랜스펙트로 옮기게 합니다. 준비된 DNA 복합체를 플레이트 표면 의 모든 세포에 떨어뜨려 놓습니다. 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 24~72시간 동안 배양합니다.

단백질 분해를 방지하기 위해, 각 전염판에 대한 용해 버퍼 4밀리리터를 고려하여 얼음에 용해 완충액을 준비한다. 인큐베이터에서 감염된 세포로 접시를 가져 가라. 미디어를 제거하고 전용 표백제 폐기물 병에 폐기하십시오.

세포를 세척하려면, 감염된 세포를 분리하지 않도록, 드롭 드롭드롭 플레이트의 측면에 차가운 PBS의 세 밀리리터를 추가합니다. 그리고 부드럽게 표면 전체에 버퍼를 확산 플레이트를 소용돌이. 접시를 기울여 PBS를 제거하고 폐기병에 넣습니다.

세탁을 한 번 더 반복합니다. 접시를 얼음 위에 놓습니다. 결국, 신중하게 PBS의 나머지 부분을 제거합니다.

다음으로, 감염된 세척 된 세포에 차가운 리시스 버퍼 500 마이크로 리터를 추가합니다. 접시 의 표면에 걸쳐 확산. 얼음에 10 분 동안 배양.

때때로 다시 버퍼를 플레이트 표면 전체에 퍼버링합니다. 그 후, 세포 주걱을 사용하여 표면에서 세포를 긁어 내고 미세 원심 분리기 튜브에서 수집하십시오. 원심분리기는 10분, G000회, 섭씨 4도에서 10분 간 분리됩니다.

새로운 미세 원심 분리기 튜브로 상체 리자슈를 수집하고 다른 새로운 미세 원심 분리기 튜브에이 분획의 50 마이크로 리터 알리쿼트를 수집합니다. 이 알리쿼트(aliquot)는 전염된 단백질이 잘 표현되었는지 확인하기 위해 사용될 것이다. 쓰레기통에 펠릿을 버리십시오.

먼저, 적절한 항체와 결합된 아가로즈 구슬의 스톡 용액을 부드럽게 재중단한다. 200 마이크로리터 팁의 끝을 잘라 1 ~ 2 밀리미터 개구부를 만듭니다. 팁을 마이크로파이프에 부착하고 용액의 40 마이크로리터를 그려 비즈가 팁에 들어갈 수 있도록 합니다.

구슬을 여러 번 피펫하여 팁을 포화하여 올바른 구슬을 확보하고 구슬을 미세 원심분리기 튜브로 옮춥시다. TNET 버퍼 500마이크로리터를 넣고 반전으로 혼합하고 원심분리기를 1, 000배 G, 섭씨 4도에서 2분간 섞습니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 TNET 버퍼 500 마이크로리터를 추가합니다.

섭씨 4도에서 회전 휠에 1시간 이상 배양합니다. 그런 다음, 원심 분리튜브는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 튜브를 세척하고, 역향 및 원심분리를 통해 500마이크로리터의 용액으로 구슬을 두 번 씻는다. 세척 후, 이전에 수집된 총 분수를 튜브로 옮기고 2~4시간 동안 섭씨 4도에서 회전휠에 배양한다.

지금, 원심분리기 는 1, 000 배 G 및 섭씨 4도에서 2 분 동안 면역 침전구구슬을 포함하는 관을 원심분리합니다. 역과 원심분리를 통해 500 마이크로리터의 용해 버퍼로 구슬을 5회 세척합니다. 구슬을 씻을 때, 슈퍼 나탄을 제거하는 동안 구슬에서 너무 가까이 가지 않도록주의하십시오.

그렇지 않으면 구슬이 흡인되고 실험이 끝나면 더 이상 구슬이 남지 않습니다. 용출의 경우 첫 번째 원심 분리기는 1, 000 배 G 및 섭씨 4도에서 2 분 동안 사용할 수 있습니다. 1 밀리리터 마이크로파이프를 사용하여 상체를 조심스럽게 제거하십시오.

그런 다음, 시멘트 바늘이 장착 된 해밀턴 주사기와 함께, 구슬의 포부를 피하기 위해 상체의 마지막 방울을 제거합니다. 다음으로 4X Laemmli 버퍼의 마이크로리터 40을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 눌러 균질화하십시오.

실온에서 5분간 배양하세요. 그런 다음 원심 분리기는 10, 000 배 G 및 실온에서 5 분 동안. 해밀턴 주사기를 사용하면 상피 용액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.

영하 80도에 보관하십시오. HEK-293 세포는 LIMK 2-1 또는 LIMK 2의 태그형 등소 형태 중 하나로 도형이 없는 LIMK 2-1로 전염되었다. LIMK 2-1은 다른 조건에서 잘 표현됩니다.

항 LIMK 2-1 항체는 LIMK 2a 및 LIMK 2b 이소형을 인식하지 못하며, 세포가 LIMK2 소형 간섭 RNA로 감염될 때 신호가 감소함에 따라, 작은 간섭 RNA를 제어하는 것에 비해 특이적이다. 다양한 인간 세포주에서 LIMK 2-1은 HEK-293 및 HeLa에서 발현되는 것으로 나타났지만 C6에서는 발현되지 않았습니다. 공존성전성 실험은 상류 키나아제 ROCK과의 LIMK2-1의 상호작용을 평가하기 위해 사용되었다. 전감염된 벡터에 의해 인코딩된 각각의 상이한 단백질은 잘 표현되었다.

LIMK2의 3가지 등소형태와 larp6은 효율적으로 면역절전을 했다. 용액에서, ROCK은 LIMK2의 3개의 동형과 면역성 전염되는 것을 검출하고, 그러나 larp6와 는 아닙니다. 그런 다음 감지된 상호 작용이 구체적입니다.

공존성전성 LIMK 2-1은 감마 P32 ATP 라벨링을 통해 키나아제 활성을 테스트하였다. LIMK 2-1은 코필린을 인광하지 않았지만, 마이엘린 기본 단백질 또는 MBP를 인포량증으로 했다. LIMK 2-1은 이 시험에서 효율적으로 면역절전을 한다.

상호 작용이 특정되어 있는지 확인하기 위해 면역 침전을 수행하면서 부정적인 제어를 갖는 것이 중요합니다. 리시스 버퍼의 구성은 상호 작용 및 활동을 보존하기 위해 신중하게 설정해야 합니다. 면역 침전시, 키나아제 활성은 상이한 기판을 계산하도록 평가될 수 있다.

돌연변이는 쉽게 소개될 수 있고 특정 잔류물의 역할을 해명할 수 있습니다. 기능적 연구는 또한 새로운 강조된 상호 작용의 생리적 역할을 이해하기 위하여 수행될 수 있습니다. 세포는 생물 안전 캐비닛 내의 전용 배양실에서 배양되어야 합니다.

P32 ATP는 신중하게 처리해야 합니다. 방사선으로부터 보호하기 위한 방패, 가이거 카운터, 특정 폐기물 수거, 개인 유방 및 손가락 배지를 사용하여 방사성 노출을 감지하고 팁을 필터링합니다.