Name: 형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 배우세요 형광 라이브 세포 현미경법을 이용하여 분열효모(Schizosaccharomyces pombe)의 유사분열과 감수분열 핵 역학을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 독성 고정제 없이 생리적 조건에서 단백질 동역학을 연구할 수 있게 합니다.

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저자들은 이 원고의 준비를 더욱 즐거운 노력으로 만들어 준 나탈리아 라 포르카데와 몬 라페르테에게 감사를 표하고 싶습니다. 그들의 통찰력, 실험 아이디어 및 도덕적 지원으로이 작품의 완성에 기여 한 Forsburg 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIGMS R35 GM118109에서 SLF로 지원되었습니다.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabatinos%2C+SA+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 470, Academic Press. 759-795 (2010).</li>
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<li>Optinav.info. Convolve ED. , Available from:
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<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
<li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895(2012).</li>
<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
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<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
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저자는 공개 할 것이 없다.

유사분열 및 만피증 중 살아있는 세포 이미징은 데이터 수집 중에 핵분열 효모 생리학을 실질적으로 방해하지 않고 핵 역학을 검사할 수 있는 기회를 제공합니다. 그러나, 세포가 환경 스트레스의 자유로운 원하는 밀도로 성장하기 위하여 주의를 기울여야 합니다; 그리고 만피증의 경우, 세포가 말단 분화 의 시간 동안 너무 일찍 또는 늦지 않도록 이미지화됩니다. 과잉 셀 룰 러 우 밀기, 기아, 그리고 부적 당한 성장 온도는 재현 할 수없는 관찰에 기여 하는 일반적인 요인. 또한, 균주 시공 중에 형광 태그가 표적 유전자의 기능을 방해하거나 전반적인 세포 적합성에 영향을 미치지 않는다는 것을 테스트하는 것이 중요합니다. 형광마커를 운반하는 균주의 표현형을 면밀히 검사하지 못하면 유사한 유전자형에 걸쳐 일관되지 않고 비교할 수 없는 결과를 초래할 수 있습니다.
현미경 아가로즈 패드는 조립이 간단하지만, 그들은 또한 귀중한 이미징 데이터를 얻기에 장애물을 제기 할 수 있습니다. 아가로즈 패드를 만드는 것은 세 개의 현미경 슬라이드를 서로 평행하게 배치하고, 중간 슬라이드에 용융 아가로스를 분배하고, 다른 슬라이드의 상단을 가로가는 슬라이드를 넣는 것만큼 간단합니다. 그러나, 내성, 상황별 아가로즈 패드를 제조하기 위해 폭 을 수정할 수 있는 슬라이드 메이커 장치를 조립하는 것이 유용하다. 패드 폭 유연성을 제공하는 간단한 슬라이드 메이커는 플랫폼 (파이펫 팁 홀더 또는 벤치), 두 개의 현미경 슬라이드 및 패드폭 조정 메커니즘 역할을하는 실험실 테이프로 구성됩니다 (그림 1A). 정확한 패드 두께는 이미징 시간 요구 사항, 아가로즈 브랜드, 온도, 커버 슬립 실란트, 증발 속도 등에 따라 달라집니다. 따라서, 데이터 수집 전에 이미징 시스템을 교정하여 기술적 재현성을 높이고 라이브 셀 이미징의 품질을향상시키는 것이 중요하다 1,2,3. 패드 표면, 강성 및 구성은 장시간 이미지 수집 중에 필수적입니다. 아가로즈는 배경 형광이 낮고 쉽게 성형 할 수 있으며 적절한 농도로 증발로 인한 구조적 변형을 견딜 수 있습니다. 또한 핵분열 효모 매체와 아가로즈를 결합해도 이미지 품질이 저하되지 않으며 여러 유사분열 및 감피증 주기를 연장관찰할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경 검사에 대한 기포를 피하는 것이 중요합니다. 아가로즈 패드 내부와 샘플 내에서 에어 포켓은 시간이 지남에 따라 확장되어 세포 이동을 일으키고 초점 평면을 방해합니다. 세포가 커버슬립 회전에 의해 효율적으로 확산되면 연구자들은 핵 융합에서 포출에 이르는 여러 세대의 유사분열 과정과 모방 사건을 따를 수 있습니다. 이미징 실험을 위한 올바른 패드를 만들고 선택하는 데는 시간이 걸리지만, 일단 달성되면 매우 유익한 현미경 관찰에 기여할 수 있습니다.
다른 방법의 경우와 마찬가지로, 살아있는 세포 현미경 검사법은 기술적 인 제한이 없습니다. 형광 태그가 붙은 단백질의 사용은 연구될 수 있는 무슨의 범위를 제한하는 실험에 경계를 소개합니다. 사진 표백 및 사진 독성은 장시간 이미지 수집의 전형적인 문제입니다. 그(것)들은 너무 오래 또는 너무 자주 짧은 파장에 세포를 노출시키지 않음으로써 중화될 수 있습니다. 핵분열 효모 라이브 세포 이미징에 사용되는 전형적인 형광 단백질인 GFP, CFP, YFP, mRFP 및 DsRed와 관련된 실험의 경우 일상적인 실험을 위해 5-15% 여기 광과 100-500ms 노출 시간을 사용하는 것이 일반적입니다. 그러나 이러한 매개 변수는 연구원의 특정 실험 요구 사항에 따라 변경됩니다. 또한, 60x 대물렌즈를 사용하여 0.5 μm 간격을 가진 9-13개의 섹션으로 구성된 z-stack은 핵분열 효모 세포의 두께를 해결하기에 충분하다. 더욱이, 형광 마커가 표적 단백질의 적당한 규칙 또는 기능을 방해하거나 가짜 표현형을 생성하지 않는다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 따라서, 다른 수단에 의해 관찰을 확증하기 위해 동일한 표적 유전자에 대해 상이한 형광 및 친화성 태그를 포함하는 균주를 구성하는 것이 바람직하다. 또한 실험 파라미터를 실험 전반에 걸쳐 재현할 수 있고 수집된 데이터가 다운스트림 분석1,3에적합하도록 하는 것은 연구자의 책임입니다. 어떤 기술도 형광 신호 검출시 선형성에 대한 신중한 관찰과 엄격한 검사를 통해 실험 시스템을 꼼꼼하게 검증하는 오랜 검증된 관행을 대체할 수 없습니다.
마지막으로, 원시 이미지를 수정하지 않는 형식으로 현미경 데이터를 분석하는 것이 중요합니다. Fiji는 원시 데이터 측정을 추적할 수 있는 우수한 문서화 도구를 제공하며 연구원이 단일 세션에서 다양한 셀 파라미터를 검사할 수 있도록 합니다. 이러한 기능뿐만 아니라 온라인 자습서 및 광범위한 문학 범위의 풍부한, 피지 측정을위한 중요한 도구, 분석, 유사분열과 편감에서 핵 분열 효모의 핵 역학을 설명하는 라이브 세포 이미징 데이터를 제시하기위한 중요한 도구.

살아있는 세포 현미경 검사법은 연구원이 핵분열 효모 세포를 죽이지 않고 핵 역학을 검토하고 치명적인 고정식 및 얼룩에 대한 필요성을 제거합니다. 막과 세포골격 외에도 염색체 복제, 재조합 및 분리와 같은 중요한 사건에 관여하는 형광 태그단백질의 안정성, 운동, 국소화 및 타이밍을 관찰할 수 있습니다. 움직임. 세포 생존력과 무독성 신호 검출을 유지함으로써 최소한의 생리적 침입이 있습니다. 제대로 수행 할 때,이 현미경 검사법은 확장 된 기술 적 취급 또는 가짜 화학 반응성에서 발생하는 혼란 효과를 줄일 수 있습니다. 또한, 실험 중, 연구원은 핵분열 효모 영양 및 스트레스 상태, 증식 효율성 및 부적절한 이미징 매개 변수 또는 비정상적인 세포 생리학을 나타내는 세포 사멸 상태의 관련 관찰을 할 수 있습니다1 ,2,3.
미토시스와 만이기스는 핵 및 세포 분열이 특징입니다. 유사분열과는 반대로, 부모 세포가 딸 세포를 초래함에 따라 유전 적 함량이 반으로 줄어듭니다4. 라이브 셀 이미징은 공간 적 관계 이외에 시간적 차원을 제공하기 때문에 많은 수의 셀을 실시간으로 검사 할 수 있습니다. 살아있는 세포 현미경 검사법은 히스톤5,응집체 소단위6,미세관7,centromeres8,키네토초레9,성분에 대한 형광 태그를 사용하여 핵 분열의 역학을 조사할 수 있게 했습니다. 스핀들 폴 바디(SPB)10,염색체 여객 복합체(CPC)11. 염색체 분리 장치 의 외부, 살아있는 세포 화상 진찰은 또한 필요한 단백질의 행동을 붙잡습니다, 그러나 염색체 분리에서 직접 관련시키지 않습니다. 이들 단백질의 기능은 미세소관12,13,14에복제, 염색체 재조합, 핵 운동 및 염색체 부착에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이 관측은 그 기능적인 분대가 생화확적인 또는 유전 검사에 순종하지 않은 세포 사건의 더 나은 이해에 기여했습니다. 현미경 기술의 새로운 발전으로, 가난한 해상도, 광 표백, 광독성 및 초점 안정성과 같은 한계가 감소하여 유사분열 및 모방 핵 역학의 실시간 관찰을 용이하게합니다1. 2,3. Meiosis는 타이밍에 세심한주의를 필요로하는 말단 분화 경로이기 때문에 특히 도전적입니다.
이 프로토콜의 목적은 유사분열 및 감피증에서 실시간 핵분열 효모 핵 역학을 검사하기 위한 비교적 간단한 방법을 제시하는 것이다. 이를 위해서는 환경 적 스트레스에 노출되지 않은 세포를 사용하고, 장기간 이미징을 견딜 수있는 아가로즈 패드를 준비하고, 단일 세포 역학의 시각화를 용이하게하는 밀도로 세포를 장착해야합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 핵 역학 (Hht1-mRFP 또는 Hht1-GFP), 염색체 분리 (Sad1-DsRed), 세포 골격 역학 (Atb2-mRFP), 전사에 대한 유용한 마커역할을하는 형광 태그 단백질을 운반하는 세포를 사용합니다. G1/S(Tos4-GFP)에서 활성화되고, 감피증(Rec8-GFP)의 응집력 안정성을 제공합니다. 이 방법은 또한 특정 세포 프로세스에 대한질문을 해결하기 위해 다른 조합으로 사용될 수 있는 추가핵 및 세포질 마커(표 I)를 소개한다. 또한, 기본 피지 도구는 연구원라이브 세포 이미지를 처리 하 고 데이터의 다른 종류를 분석 하는 데 도움이 기능. 이 접근법의 강도는 단백질 역학, 타이밍 및 안정성의 실시간 관찰을 사용하여 유사분열과 간편분열의 적절한 실행을 위해 필수적인 프로세스를 설명하는 데서 비롯됩니다.

<table><tbody><tr><td>60x 플랜 아포크로맷 대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer rotator</td><td>Stovall</td><td>US Patent #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20,</td> <td>Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Convolve 3D 소프트웨어 플러그인</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ CCD 카메라</td><td>Roper</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H20,END</td><td></td> <td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision 디콘볼루션 형광 현미경</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>회절 PSF 3D 소프트웨어 플러그인</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr>: <tr><td>에든버러 최소 매체(EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023; 1kg</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&middot; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>글루코스</td><td>시그마</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>열판</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Huygens 디콘볼루션 소프트웨어</td><td>SVI</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 디콘볼루션 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td>해당 사항</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>쉘 연구소</td> <td># 3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>반복 Deconvolve 3D 소프트웨어 플러그인</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>라놀린</td><td>시그마</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>류신</td><td>시그마</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>라이신</td><td>시그마</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>맥아 추출물 (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>분자 장치</td><td>해당</td><td></td></tr> 없음 <tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>몰리브딕산</td><td>시그마</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>니코틴산,</td> <td>시그마</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>판토텐산</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>폼베 글루타메이트 배지 (PMG)</td><td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 이미지 프로세싱 소프트웨어</td><td>GE 헬스케어</td><td>해당 사항</td><td></td></tr><tr><td>포자 형성 매체 분말</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 원심 분리기</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 플러스 보충제 (YES)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>J.T.베이커</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

살아있는 세포 화상 진찰은 살아있는 세포에 있는 세포 그리고 단백질 역학을 검토하기 위하여 이용된 현미경 검사법 기술입니다. 이 화상 진찰 방법은 유독하지 않으며, 일반적으로 세포 생리학을 방해하지 않으며, 최소한의 실험 처리를 요구합니다. 기술적인 간섭의 낮은 수준은 연구원이 유사분열의 다중 주기에 걸쳐 세포를 공부하고 처음부터 끝까지 만이기스를 관찰하는 것을 가능하게 합니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 적색 형광 단백질 (RFP)와 같은 형광 태그를 사용하여 연구원은 전사, DNA 복제, 응집력 및 분리와 같은 프로세스에 중요한 다양한 요인을 분석 할 수 있습니다. 피지(무료, 최적화된 ImageJ 버전)를 사용한 데이터 분석과 결합된 라이브 셀 이미징은 단백질 이동, 국소화, 안정성 및 타이밍뿐만 아니라 핵 역학 및 염색체 분리를 평가하는 다양한 방법을 제공합니다. 그러나 다른 현미경 검사법의 경우와 마찬가지로, 살아있는 세포 이미징은 고배율에서 해상도 전력에 제한을 두는 빛의 본질적 특성에 의해 제한되며, 고파장에서 광표백 또는 광독성에 민감합니다. 주파수. 그러나, 몇몇 주의를 기울여, 조사자는 유사분열과 meiotic 사건의 적당한 시각화를 허용하기 위하여 적당한 조건, 긴장 및 형광마커를 신중하게 선택해서 이 물리적인 한계를 우회할 수 있습니다.

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

살아있는 세포 현미경 검사는 연구원이 실시간으로 미토시스와 메이오시스에 있는 핵분열 효모 핵 역학을 연구할 수 있습니다. 이 방법의 강도는 독성 고정제와 얼룩에 대한 필요성을 제거하는 정상적인 생리 적 조건하에서 살아있는 세포에서 핵 프로세스를 연구에서 온다. 이 기술은 유전적 또는 생체 역학적 조작에 만전을 기하지 못할 수 있는 단백질 타이밍, 안정성 및 이동성과 관련된 질문을 다룹니다.이미징 전에 핵분열 효모 세포의 건강과 적합성에 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 항상 형태와 성장 특성을 검사하여 실험 전반에 걸쳐 결과의 일관성을 보장합니다. 이 프로토콜은 현미경 슬라이드를 올바르게 마스터할 때 장기간 된 라이브 세포 이미징의 일관성과 재현성을 향상시킬 수있는 비교적 간단한 방법을 보여줍니다.극저온 웨이크 업 플레이트에서 세포 물질을 집어 들기 시작하려면 YES 플레이트에 적시고 효모 유전자형에 따라 섭씨 25도 또는 섭씨 32도에서 배양하여 극저온 보존에서 핵분열 효모 균주를 깨우세요. 그런 다음 멸균 루프를 사용하여 각성 된 핵 분열 효모 균주에서 개별 식민지에서 세포를 선택하고 YES 액체 배지의 3 밀리리터를 포함하는 시험 관으로 접종하십시오. 튜브를 150~220rpm에 셰이커에 배치하여 밤새 섭씨 25도 또는 32도에서 늦은 로그 단계까지 0.7~1.0의 원하는 광학 밀도 판독값을 제공합니다.배양의 마이크로리터 10편을 현미경 슬라이드로 옮기다. 커버슬립을 착용하고 현미경으로 배치하여 적절한 세포 형태와 영양 상태를 확인합니다. 미토시스 또는 메이오시스 분석을 위한 현미경 슬라이드를 설치하려면 먼저 미토시스용 미토시스 또는 액체 포자화 매체에 대한 최소 배지 100 밀리리터와 보충제를 함유한 500 밀리리터 플라스크에 아가로즈 2그램을 추가합니다.아가로즈 용액을 전자레인지에 60%의 전력으로 10초 단위로 데우거나 비커를 섭씨 55도의 수조에 10분간 놓습니다. 효율적인 용융을 보장하기 위해 솔루션을 소용돌이. 파이펫 팁 홀더에 두 개의 현미경 슬라이드를 설정하여 상단 슬라이드가 양쪽 끝에 있는 두 개의 실험실 테이프 스택에 놓아 크로스 모양을 만드는 것을 지원합니다.두 슬라이드 사이의 거리를 2밀리미터 이상으로 조정하여 장기간 이미징을 위해 다음 단계에서 두꺼운 패드를 형성합니다. 실온에서 1분 동안 용융 아가로즈를 냉각한 후 상단 슬라이드를 제거하고 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 하단 슬라이드에 50~100마이크로리터를 분배하여 자리를 만듭니다. 아가로즈가 식히기 전에 상단 슬라이드를 위에 놓고 직경이 약 1및 1/2 ~ 2cm의 스프레드 패드를 생성합니다.최적의 라이브 셀 이미징은 후속 데이터 처리 단계에 매우 중요합니다. 용융 아가로즈의 공기 장식을 제거하고 4시간 이상 이미징 기간을 위한 얇은 패드를 만들어야 합니다. 미토틱 이벤트를 검사하려면 액체 EMM 또는 PMG 플러스 하룻밤 보충에서 스타터 배양에서 세포를 성장.배양물의 1밀리리터를 큐벳으로 옮기고, 595나노미터의 파장에서 분광계계를 측정한다. 세포 성장은 광학 밀도가 0.4에 도달하면 중간 로그 단계로 간주됩니다. 그런 다음 1 분 동안 1, 375 배 g에서 세포 현탁액의 원심 분리기 1 밀리리터.상체를 제거하고 최소 배지플러스 보충제로 셀 펠릿을 100 마이크로리터의 최종 부피에 재보아보세요. 이미지 meiotic 이벤트 최소한의 매체 플러스 하룻밤 보충에 스타터 배양에서 세포를 성장. 세포 성장은 595 나노미터의 광학 밀도가 0.7에서 1 사이일 때 후기 로그 단계로 간주됩니다.다음으로, 후기 로그 배양에서 각 메이트 타입 스트레인, H 네거티브 및 H 양성의 500 마이크로리터를 획득하고 결합하여 1밀리리터 셀 서스펜션을 만듭니다. 1 분 동안 1, 375 배 g에서 세포를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 액체 말토제 추출물의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 분리합니다.효율적인 영양소 제거를 위해 말토세 추출물을 3회 더 세척합니다. 마지막 말토세 추출물 세척 후 말토세 추출물의 1 밀리리터로 세포를 재연하고 9밀리리터의 말토세 추출물을 함유한 50밀리리터 플라스크로 혼합물을 옮겨낸다. 50~100rpm 사이의 최소 회전 속도로 섭씨 22~25도에서 12~16시간 동안 배양합니다.풍부한 자기 플로칭으로 인한 많은 둥근 핵분열 효모 덩어리의 출현은 효율적인 짝짓기임을 나타냅니다. 다음으로 짝짓기 배양과 원심분리기의 1밀리리터 샘플을 1분 동안 1, 375배 g로 채취하십시오. 750마이크로리터의 상류체를 제거하고 나머지 상수체의 세포를 다시 분리합니다.소용돌이는 덩어리를 방해하기 위해 5 초 동안 적극적으로. 2%아가로즈 패드에 미토틱 또는 메이오틱 셀 서스펜션의 20 마이크로리터를 분배합니다. 슬라이드를 반전시키고 2~3초 동안 보풀이 없는 종이 타월 위에 올려 놓고 여분의 매체를 제거합니다.슬라이드를 뒤집고 패드 상단에 유리 커버슬립을 부드럽게 놓아 기포를 생성하지 않도록 합니다. 세포 단층은 미토시스 세포 또는 메이오시스 세포에 대한 두 개의 전체 회전에 대한 검지 손가락으로 시계 방향으로 커버 슬립을 회전합니다. 세포 물질이 아가로즈 패드를 가로질러 분산되어 단일 세포 또는 아시의 더 나은 분리를 허용합니다.작은 나무 막대기의 도움으로 각 아가로즈 패드를 밀봉커버슬립의 가장자리를 따라 용융 탄화수소 실란트를 분배합니다. 아가로즈 패드가 밀봉되면 현미경 단계에 놓습니다. 온도 챔버를 켜고 원하는 온도로 설정합니다.젖은 종이 타월이있는 접시를 챔버에 놓고 현미경 시스템의 습도를 제어하십시오. 적절한 이미징 조건에서 10~15분 동안 평형화할 수 있습니다. 이렇게 하면 남은 기포가 사라지고 막판아가로스 가시가 발생할 수 있습니다.40X 목표를 사용하여 이미지에 적합한 보기 필드를 찾습니다. 데이터 수집을 시작하기 위해 60X 목표로 전환합니다. 현미경 기능을 제어하는 소프트웨어에서 관찰 중인 형광과 가장 잘 일치하는 현미경 필터 세트를 선택합니다.사용되는 형광에 맞게 흥분 파장을 조정하고, 일관된 신호를 생성하는 가장 낮은 흥분 력을 사용하고, 4~8시간의 노출 시간을 사용하여 허용 가능하면서도 정량화 가능하고 재현 가능한 이미징 데이터를 생성합니다. 매시간 최소 6회 획득 시간 포인트를 수집합니다. 이미지 컬렉션 소프트웨어에서 데이터를 수집하고 0.5 마이크로미터 간격이 있는 13개의 섹션으로 구성된 Z 스톡을 사용하는 하나 이상의 형광 채널을 선택합니다.피지 소프트웨어플러그인 메뉴에서 바이오 포맷 수입 기능을 선택하여 절제된 이미지를 업로드합니다. 가져오기 옵션 팝업 창에서 하이퍼스택, 기본 색상 모드를 선택하고 자동 배율을 확인하고 확인 버튼을 누릅니다. 표시된 창에 하단의 각 막대에서 옆으로 스크롤하여 형광 채널과 시간 프레임의 정확한 수가 있는지 확인합니다.데이터를 압축하지 않는 Tiff 파일로 저장합니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정 설정 옵션을 사용하여 다양한 매개 변수를 선택합니다. 예: 영역, 최소 최대 회색 값, 통합 밀도, 평균 회색 값, 중앙값, 스택 위치, 둘레 및 표시 레이블입니다.색상을 선택하고 채널 도구를 클릭합니다. 채널 팝업 창에서 강도 또는 영역이 측정되는 컬러 채널을 확인합니다. 이미지를 선택한 다음 32비트를 입력하고 클릭합니다.이미지 메뉴에서 조정 및 임계값 피쳐를 선택합니다. 어두운 배경 상자를 선택하고 기본 메서드를 선택하고 빨간색을 선택하여 관심 있는 신호를 오버레이합니다. 지팡이 도구를 사용하여 관심 있는 각 구조를 강조하고 키보드의 문자 T를 눌러 선택한 ROI를 팝업 ROI 관리자 창에 추가합니다.다음으로 지퍼된 ROI 폴더를 열어 ROI 관리자를 로드하고 왼쪽 패널의 각 ROI 식별자를 클릭합니다. 분석 메뉴에서 측정값을 선택하고 각 ROI 식별자에서 이 명령을 반복하여 이미지 스택의 모든 조각에 대한 관심 있는 개체를 정량화합니다. 결과를 통계 분석을 위한 CSV 파일로 저장합니다.이 연구에서 는 세포 영양소 제한 또는 과성장으로 인해 굶주린 경우, 그들은 과잉 vacuoles 및 감소 된 세포 크기를 보여줄 것 이다. 로개반스믹 세포는 활성 DNA 복제 및 세포 분열뿐만 아니라 범핵 Tos4-GFP 발현 및 Sad1-DsRed foci 분리를 보여줍니다. 세포가 질소의 충분히 굶주리지 않는 경우와 같이 짝짓기를 하지 못하면 메이오증에 들어가는 것을 방지할 수 있습니다.카요가미를 받는 핵분열 세포 한 쌍이 표시됩니다. 결합 세포 현탁액의 견고한 flocculation는 세포 대 세포 상호 작용을 증가시키고 따라서 성공적인 결합 및 효율적인 메이오틱 유도를 나타냅니다. Zygotic asci는 지그재그와 바나나 세포 모양을 포함하여 여러 형태를 취합니다.세포가 메타상에서 텔로상으로 전환함에 따라 미토시스에서, 첫 번째 변화는 메타단계에서 핵 크기의 수축을 수반하고, 두 번째 변화는 해부학 중에 핵 분할을 나타낸다. 미토세포와 일부 분리 역학을 공유하는 것 외에도, 메이오틱 세포는 상형 재조합 중 핵 진동을 나타내고 해부학 II.It 끝에 핵세포의 추가 감소는 실험 파라미터를 실험 전반에 걸쳐 재현할 수 있고, 수집된 데이터가 다운스트림 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위한 연구자의 책임입니다. 살아있는 세포 화상 진찰은 조사자가 미토시스와 meiosis에 있는 핵 분열의 역학을 면밀히 검토할 수 있었습니다.형광 태그와 현미경 기능이 개선됨에 따라 관찰 할 수있는 프로세스의 수와 유형이 증가 할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

우리는 핵분열 효모 성 수명 주기의 장기 현미경을 위한 재현 가능한 기본 방법을 제공합니다. 설명된 사소한 조정과 함께 제시된 프로토콜은 생식 과정의 여러 단계에 대한 연구의 초점을 맞출 수 있도록 합니다.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

분열 효모는, 분열의 pombe는 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템, 세포 분열의 마지막 단계입니다. 여기에서 우리는 라이브 분열 효모 세포에서 다른 cytokinetic 이벤트를 분석하기 위해 현미경 방법을 설명합니다.

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

의 선택, microinjection, 그리고 영상은 형광을 통해 F - 굴지 찬란 - 라벨 (FSM) 현미경을 작은 반점을 찍다.

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

배우세요 형광 라이브 세포 현미경법을 이용하여 분열효모(Schizosaccharomyces pombe)의 유사분열과 감수분열 핵 역학을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 독성 고정제 없이 생리적 조건에서 단백질 동역학을 연구할 수 있게 합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

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