Name: 실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 해양 동물 플랑크톤 Dolioletta gegenbauri의 독특한 배양 기법을 통해 해양 생태계 연구와 수산 생물학 실험 모델을 확립하는 방법을.

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G.A를 포함하여 수년에 걸쳐 이 프로젝트에 축적된 지식을 기부해 주신 많은 분들에게 감사드립니다. 파펜회퍼와 D. 데이벨은 원래 이러한 프로토콜을 개발했다. M. Köster, 그리고 L. Lamboley는 또한 이 절차의 발달에 크게 기여했습니다.  N.B. 로페즈-피게로아와 아에 로드리게스-산티아고는 표 1에 제공된 돌리올리드 풍부도의 추정치를 생성했다. 이 연구는 MEF에 OCE 082599, 1031263, 공동 프로젝트 OCE 1459293 및 OCE 14595010 MEF와 DMG에, 국립 해양 및 대기 관리 상 NA16SEC4810007에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 R / V 사바나의 근면하고 전문적인 승무원에게 감사드립니다. 리 앤 델레오(Lee Ann DeLeo)가 피규어를 준비했고, 찰스 Y. 로버트슨이 원고를 교정했고, 제임스(지미) 윌리엄스가 플랑크톤 휠을 제작했습니다.

1. 디게겐바우리 사육을 위한 배양시설 준비
참고: 필요한 모든 재료와 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
<ol><li>1 M 수산화 나트륨 (NaOH), 0.06 M 과망간산산 칼륨(KMnO 4) 용액을 준비하십시오. 이 용액을 준비하려면 NaOH 400g을 10 L 탈이온수에 녹입니다. NaOH 용액에 KMnO4 100 g을 넣고 잘 섞습니다.</li>
	<li>NaHSO3의 100 g을 10L 탈이온수로 용해시켜 0.1 M 나트륨 바이설피테(NaHSO3)용액을 준비하고 잘 섞는다. 주의: 이 시약은 흡입하는 경우에 호흡 문제를 일으키는 원인이 될 수 있는 자극제입니다. 연기 후드와 같이 통풍이 잘되는 곳에 두어 놓습니다. 피부 접촉을 피하십시오. 취급 시 보호 장갑, 보호복, 눈 보호 및 얼굴 보호 기능을 착용하십시오.</li>
	<li>실험실에서 돌리올리드 배양을 확립하고 사육하기 전에 배양 항아리를 청소하고 살균하십시오.<ol>
<li>탈이온수로 1.9L 및 3.8L 배양 항아리를 3회 이상 헹구는다. 캡은 다음 청소 단계에 포함되지 않기 때문에 나사 캡을 건조시키십시오.</li>
		<li>NaOH/KMnO4 용액에 담그어 1.9- 및 3.8L 유리 배양 항아리를 세척하고 살균합니다. 항아리가 하룻밤 동안 담가 두십시오.</li>
		<li>NaOH/KMnO4 용액에서 항아리를 제거하고 항아리를 나트륨 비설피테 (NaHSO3)용액에 담그다. 항아리가 하룻밤 동안 담가 두십시오.</li>
		<li>NaHSO3 용액에서 항아리를 제거하고 탈이온수로 완전히 헹구십시오. 용기가 건조되도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플랑크톤 휠(그림 2)을 온도 제어 공간(환경 챔버)에 놓습니다. 온도를 20°C로 평형화합니다. 사용자 정의 플랑크톤 휠에 대한 자세한 설명은 추가 그림1을 참조하십시오.</li>
</ol>2. 식물성 플랑크톤 문화
<ol><li>국립 해양 조류 및 미생물 (NCMA) 또는 D. 게겐 바우리에대 한 음식으로 사용 될 다른 소스에 대 한 국립 센터에서 조류 문화를 얻을. 이소크리시스 갈바나(CCMP 1323), 로도모나스 스프(CCMP 740), 작은 규조류, 탈라시오시라 바이스플로기이(CCMP 1051)를 포함한 두 종의 기혈종의 혼합물은 NCMA로부터 수득되었고 이전 실험실에서 사용되어 왔다. 성공적으로 후면 돌리오리드에 연구17.</li>
	<li>NCMA에서 권장하는 대로 L1 및 L1-Si 성장 매체(22)를 준비한다.</li>
	<li>새로운 조류 문화를 시작 하려면 공급 업체에서 제공 하는 지침에 따라.</li>
	<li>엄격한 축배양 기술을 사용하여 스톡 배양을 유지하기 위해 2주에 한 번씩 멸균 55 mL 유리 배양 튜브에서 25 mL의 신선한 성장 배지로 오래된 노화 배양액0.5 mL을 옮김을 전달합니다. 참고: 살아있는 조류 문화를 정기적으로 옮기지 않고는 저장할 수 없습니다. 문화권이 장기간 사용되지 않고 비사용 기간 동안 문화권유지가 불가능한 경우, 이러한 일반적인 조류 문화를 원래 소스(예: NCMA)로부터 다시 획득하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>200 mL의 성장 배지를 함유한 깨끗한 500 mL 플라스틱 조직 배양 플라스크에서 돌리올리드를 먹이기 위해 더 많은 양의 식물성 플랑크톤을 준비합니다.<ol>
<li>축주식(4mL)에서 200 mL의 성장매체(1:50 희석)로 식물성 플랑크톤을 접종합니다.</li>
		<li>20 °C에서 12:12 h 의 빛으로 배양: 65-85 μE/m2의 시원한백색 광 조명 하에서 어두운 주기. 배양 플라스크를 평평하게 배치하여 조명을 최대화합니다. 매일 부드럽게 소용돌이치는 배양.</li>
		<li>배양의 성장을 모니터링하기 위해 입자 카운터 또는 현미경을 사용하여 세포의 농도를 결정합니다. 참고 : 접종 후 7-10 일 후, 기혈 배양액은 ~ 105-106 세포 / mL을 포함하고 규조류 배양은 ~ 104-105 세포 / mL을 포함합니다. 이러한 농도는 돌리올리드 배양을 유지하기에 충분하다.</li>
		<li>모든 문화 활동을 지원하기에 충분한 조류 바이오매스를 제공하기 위해 최소 2주마다 새로운 수유 주식을 시작하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 야생 돌리올라이드와 바닷물 문화 컬렉션
참고: 수집 및 재배 접근 방식에 대한 개요는 그림3에 설명되어 있습니다. 도4에서는 전문 수거 플랑크톤 네트 및 대구말에 대한 설명이 제공된다.
<ol><li>플랑크톤 그물 또는 시투 이미징 시스템(23)을 사용하여이를 감지하여 돌리오리드를 찾습니다. 참고: 돌리올리드는 표면 수역에 거의 존재하지 않으며 원격 감지 기술로 감지할 수 없기 때문에 돌리올리드에 유리한 조건에 대한 전제 조건 지식에 의해 유도됩니다(토론 참조) 돌리올리드의 존재를 결정해야 합니다. 샘플링 하기 전에.</li>
	<li>D. 게겐바이 문화를 시동하기 위한 준비를 위해 살아있는 돌리올리드를 수집하기 전에 입자가 풍부한 바닷물을 수집합니다.<ol>
<li>CTD 로제트 또는 이에 상응하는 장비에 장착된 Niskin 병을 배치하여 돌리올라이드가 있는 장소와 현장 형광계에서 추정된 가장 높은 엽록소 농도를 포함하는 깊이에서 물을 수집합니다. 참고: 엽록소 농도는 입자 농도의 지표로 사용됩니다. 남대서양 Bight (SAB) 중간 대륙 선반에, 최대 표면 엽록소는 일반적으로 바닥에 가까운, 하지만 다른 위치에, 그것은 하지 않을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>돌리올리드가 위치하면 특수 플랑크톤 그물과 대구 끝을 사용하여 손상되지 않은 돌리오리드 주이드를 복구하십시오. 그물을 배포하기 전에, 바닷물로 대구 끝을 채웁니다.<ol>
<li>표류선박에서, 하부 및 15~25°의 경사 견인 각을 유지하고 15m/min 이하의 수직 배치 및 검색 속도를 유지하여 물 기둥을 통해 그물을 올립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>그물이 온보드되면, 대구 말단의 내용물을 3, 5 갤런 (~20 L) 플라스틱 양동이로 부드럽게 옮기고 각 부위에서 수집 한 표면 해수 10L을 함유합니다. 참고 : 새로운 플라스틱 양동이는 살아있는 돌리올리드 수집 전에 해수 일의 추가에 의해 조절되어야한다. 목표는 플라스틱에서 화학 물질의 침출을 줄이는 것입니다. 바닷물을 사용할 수 없는 경우, 정제된(예: 밀리 Q) 또는 수돗물무이면 독성 오염물질이 없는 물을 사용하여 양동이를 조절하십시오.</li>
	<li>다른 플랑크톤에서 돌리올리드 주이드를 분리합니다.<ol>
<li>작은 배치 (~ 2 L)에서 그물 견인 내용물 (현재 20 L 플라스틱 양동이)에서 2 L 유리 비커로 혼합 판자를 옮니다.</li>
		<li>와이드 보어 유리 파이펫(8mm ID x 38cm 길이)을 사용하여, 조심스럽게 사이펀을 하고, 비커에서 활발하게 수영하는 돌리오리드 주니드를 깨끗한 유리 배양 항아리로 옮기고, 돌리올리드가 있던 곳에서 니스킨 병을 사용하여 채취한 입자가 풍부한 바닷물을 함유한 깨끗한 유리 배양 항아리로 옮겨줍니다. 있는.</li>
		<li>바닷물 표면 아래에 있는 돌리올리드 동물원을 부드럽게 풀어놓습니다. 참고 : 여조, 부착 된 개발 된 가노 주이드를 포함하는 공포증, 부착 된 트로포주이드를 포함하는 간호사 단계를 수집합니다 (그림 1).</li>
	</ol></li>
	<li>돌리오리드를 첨가한 후, 로도모나스 스프. 배양을 ~ 5 x 103 – 104 세포/mL의 최종 농도에 첨가합니다(~ 5 x 104 - 1 x 105 세포/mL를 3.8 L 병에 함유하는 배양의 ~ 50 mL). 이것은 돌리오리드가 활발하게 공급되는지 여부를 결정하기 위한 것입니다. 돌리올라이드가 로도모나스 를 섭취하면소화관이 빨간색으로 나타납니다. 먹이를 주지 않는 주이드를 제거합니다.</li>
	<li>돌리오리드가 공기-물 인터페이스에 갇히지 않도록 하려면 여과되지 않은 입자가 풍부한 바닷물로 항아리를 완전히 채우고 항아리 개구부(폭 89mm)에 플라스틱 랩 조각을 놓음으로써 배양 항아리의 헤드스페이스를 피하십시오.<ol>
<li>동물을 손상시킬 수 있는 기포를 만들지 마십시오. 조심스럽게 항아리에 뚜껑을 조여 거품이 있는지 확인하기 위해 항아리를 부드럽게 뒤집습니다. 거품이 있으면 제거합니다.</li>
		<li>항아리가 채워진 후, 항아리 의 외부에서 여분의 물을 닦아.</li>
	</ol></li>
	<li>각 항아리를 플랑크톤 휠에 장착 (그림2)고무 튜브로 덮인 수직 금속 막대에 항아리를 놓고 스테인레스 스틸 호스 클램프 사이에 놓습니다.<ol>
<li>용기의 뒷면이 고무 튜브에 대해 쿠션되어 있는지 확인하십시오. 나사를 조정하여 항아리 주변의 호스 클램프를 조입니다.</li>
		<li>제자리에 단단히 고정된 후에는 항아리가 움직이지 않는지 확인하십시오. 항아리가 0.3rpm에서 회전하여 돌리오리드를 서스펜션상태로 유지합니다. 주의: 항아리가 깨지는 것을 방지하기 위해 항아리를 과도하게 조이지 않는 것이 중요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>선박에서, 그들은 실험실 배양 시설로 전송 될 수 있을 때까지 희미한 빛에 20 °C에서 플랑크톤 바퀴에 배양 용기를 유지합니다.</li>
	<li>실험실로 돌아오면 돌리올라이드가 들어있는 항아리를 준비된 문화 시설로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김. 플랑크톤 휠에 항아리를 장착하고 (단계 3.8 참조) 항아리가 0.3 rpm에서 계속 회전 할 수 있도록하십시오. 참고: 본 연구에서 돌리올라이드의 모든 사육은 20°C에서 수행되었다.</li>
</ol>4. D. 게겐바우리 문화 유지
<ol><li>배에서 실험실로, 동물이 3 일 동안 실험실 조건에 원래 항아리에 적응 할 수 있도록.<ol>
<li>적응 기간 동안 넓은 보어 유리 파이펫을 사용하여 3 일 동안 매일 수집 사이트에서 여과되지 않은 입자가 풍부한 바닷물로 물의 10 %를 교환하십시오.</li>
		<li>항아리에 여러 개의 코포드를 보관하지만 다른 모든 동물 플랑크톤, 큰 배설물 펠릿 및 doliolid의 여과 장치 (점액 그물)를 막을 수있는 큰 응집 입자를 제거하십시오. 문화가 초기 간호사로 구성되어 있는 경우, 항아리에 하나의 큰 가노주이드 (≥ 6 mm)를 보관하십시오. 참고 : 어떤 copepod 종은 문화에 포함되어 있는지 중요하지 않지만,이 실험에서 돌리올라이드가 포획 된 곳에서 존재하는 가장 풍부한 종이 사용되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>적응 기간 이후에, 80% 유리 섬유 필터 (GF/F) 여과 된 바닷물과 원래 항아리에서 바닷물의 20 %를 포함하는 깨끗한 재배 항아리에 원래 항아리에서 돌리오 리드 주니드와 대처를 전송합니다. 0.7 μm 필터 용지의 공칭 기공 크기로 GF/F를 통해 바닷물을 여과하여 여과된 바닷물을 준비합니다.</li>
	<li>3일마다 GF/F 여과 된 해수로 물의 10 %를 교환하고 응집체와 배설물을 제거하여 새로운 문화를 유지하십시오. 매주, 4.2단계에서 설명한 대로 동물을 새로운 항아리로 옮김을 옮김을 옮김을 한다.</li>
	<li>40-95 μg C/L 사이의 배양 항아리에서 식물성 플랑크톤 농도를 유지하여 돌리올리드를 공급합니다. 참고: 이러한 농도는 D. 게겐바우리17에대한 꽃 조건을 지원하는 것으로 알려진 환경 조건을 모방. 조류 종의 혼합물은 각 항아리의 수명 단계와 zooids 수에 따라 다릅니다. 초기 수명 단계에서 크립토 모나드 조류(이소크리시스 갈바나 및 로도모나스 sp.)의 1 :1 혼합물 (탄소 함량)을 추가하십시오. 더 큰 먹이 종은 쉽게 작은 간호사와 개발 trophozooids의 먹이 장치를 막을 수 있습니다. 조류 혼합물에 규조류 Thalassiosira weissflogii를 추가, 또한 동등한 탄소 함량에, 더 큰 간호사를 공급 할 때, 포주이드, 및 고노 주이드.<ol>
<li>조류 농도를 전과 후 공급하여 배양액과 조류가 얼마나 자주 그리고 얼마나 많은 조류를 추가해야 하는지 결정하는 방법을 안내합니다. 배양 항아리의 조류 농도가 상대적으로 희석되기 때문에 입자 카운터를 사용하여 조류 농도를 결정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>40 – 95 μgC/L의 조류 농도를 유지하기에 충분한 zooids를 제거하여 나머지 돌리올라이드가 자라기에 충분한 음식을 갖도록 하십시오. 참고 : 실험실 조건하에서 성공적으로 유지하기가장 어려운 생활 단계는 개발 애벌레와 oozooid (초기 간호사)입니다. 배양의이 단계 동안, 하나의 큰 gonozooid유지 (≥ 6 mm) 유충과 oozooids를 개발 항아리에 여러 copepods 이외에 유지 (~ 20 당 3.8 L 항아리).</li>
	<li>최소 8개의 trophozooids가 간호사의 cadophore에 보입니다 (그림 1B)에 1개의적어도 4명의 간호원을 새로운 배양 항아리로 옮기는 것은. 참고: 트로포주이드는 20°C에서 1-2일마다 두 배로 증가합니다. 트로포주이드는 육안으로 볼 수 있을 만큼 크다.<ol>
<li>간호사가 20 개의 trophozooids를 개발하면 간호사 2 명을 제거하십시오.</li>
		<li>간호사가 개발할 때 간호사 1 명 (30 trophozooids)을 카도포에 제거하십시오. 나머지 간호사가 카도포에 포로 주드를 개발할 수 있도록 하십시오.</li>
		<li>간호사가 최대 30개의 포지주이드를 방출하면 간호사를 제거하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>포주체이드의 크기가 3mm에 도달하면 항아리에 있는 동물의 수를 줄입니다.<ol>
<li>포지시드가 커지면 (> 5 mm) 4개의 포지체이드를 제외한 모든 포지시드를 제거하고 고노주이드 클러스터를 개발했습니다.</li>
		<li>가노주이드 클러스터의 수가 증가하고 먹이를 시작할 때 배양을 두 개의 광주체이드로 줄입니다.</li>
		<li>광주체이드가 최대 30개의 고노주이드를 방출하면 포주이드를 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>병당 30개의 주이드에서 2개로 고노주이드의 수를 줄입니다. 기름지게 한 계란이 항아리에 풀어 놓일 수 있도록 하십시오.<ol>
<li>oozooids가 발전하면 항아리에 하나의 고노 주이드를 떠나 하나의 고노 주이드를 제거합니다. 참고 : 버려진 간호사, 포지시드 및 고노 주시드는 추가 배양을 시드하고 추가 실험을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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저자는 선언할 것이 없습니다.

문화 doliolids 수용량은 지난 수십 년 동안 설립되었으며 여러 분야에서 연구를 지원하는 데 사용되었습니다. 우리의 실험실에서 실험 연구는 먹이 와 성장에 초점을 맞춘 적어도 15 과학 연구의 출판을 지원 했다18,26,재생18,28,다이어트6, 29,생리학30,생태31,그리고 돌리오리드의 생태 모델링27.
이 섬세한 동물의 문화는 현재 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리지만, 돌리올라이드의 재배는 가능하며, 더 넓은 공동체가 착수한다면...

동물플랑크톤은 바다에서 가장 큰 동물 바이오매스를 차지하고 있으며, 해양 식품 거미줄의 핵심 구성요소이며 해양 생물지구화학 주기 1,2에서중요한 역할을 한다. 동물플랑크톤은 생물체의 거대한 다양성으로 구성되어 있지만, 두 가지 범주로 크게 구별 될 수있다 :몇 중간 택시 3,4와젤라틴과 비 젤라틴 . 젤라틴 동물플랑크톤이 아닌 동물성 동물플랑크톤에 비해, 젤라틴 동물플랑크톤은 복잡한 삶의역사5 때문에 공부하기가 특히 어렵고, 포획 및 취급 중에 섬세한 조직이 쉽게 손상됩니다. 젤라틴 동물플랑크톤 종은, 따라서, 실험실에서 배양하기가 어렵고 일반적으로 비젤라틴종6에 비해 덜 연구된다.
젤라틴 동물플랑크톤 그룹 중 에는 전 세계 바다에서 풍부하고 생태학적으로 중요한 것이 탈리아세안(Thaliaceans)입니다. 탈리아세산은 살피다, 피로소미다, 돌리오리다 7의 주문을 포함하는 원골 잡화의한 등급이다. 돌리올리다(Doliolida)는 아열대 바다의 생산적인 네릭 지역에서 높은 풍부에 도달할 수 있는 작은 배럴 모양의 자유 수영 펠라그 생물입니다. 돌리올리드는 모든 동물플랑크톤 그룹4,8중 가장 풍부하다. 서스펜션 피더로서, doliolids는 필터 전류를 생성하고 점액 그물9에캡처하여 물 기둥에서 음식 입자를 수집합니다. 분류학적으로, 돌리올리드는 phylum Urochordata10에서분류된다. 조상은 코르다테에 대한 조상이며, 해양 펠라그 시스템의 핵심 구성 요소로서의 생태학적 중요성외에도, 탈리아세산은 식민지 생명의 역사10,11 및 진화의 기원을 이해하는 데 중요합니다. 5,7,10,12,13,14.
doliolids의 생활 역사는 복잡 하 고 그들의 수명 주기를 통해 그들을 배양 하 고 유지에 어려움에 기여. 돌리오리드 수명 주기와 해부학에 대한 리뷰는 Godeaux 외15에서찾을 수 있습니다. 성및 무성생애주기간의 의무적인 교대를 수반하는 돌리올리드 수명주기는 그림1에 제시되어 있다. 계란과 정자는 생애 주기의 유일한 고독한 단계인 헤르마로디틱 고노주이드에 의해 생성됩니다. Gonozooids는 물 기둥에 정액을 풀어 놓이고 계란은 내부적으로 기름지게 하고 애벌레로 발전하기 위하여 풀어 놓입니다. 유충 해치와 1-2 mm에 도달 할 수있는 oozooids로 변신. 도움이 환경 조건과 영양을 가정, oozooids는 20 °C에서 1-2 일 이내에 초기 간호사가되고 수명 주기의 식민지 단계를 시작합니다. Oozooids 무성 그들의 복부 stolon에 싹을 생산. 이 싹은 stolon을 떠나 그들이 세 개의 쌍을 이루는 행에 줄 등도 카도포어로 마이그레이션합니다. 중앙 이중 행은 공포증이 되고 바깥쪽 두 개의 이중 행은 트로포주이드가 됩니다. 후자는 간호사와 포로주시드 모두에게 음식을 제공합니다16,17. 트로포주이드는 간호사에게 모든 내부 장기를 잃으면서 영양을 공급합니다. trophozooids의 풍부가 증가함에 따라, 간호사의 크기는 실험실에서 15mm에 도달 할 수 있습니다. 포로주이드가 자라면서, 그들은 점점 플랑크토닉 먹이를 섭취하고 개인17로출시되기 전에 ~ 1.5 mm 크기에 도달한다. 한 명의 간호사가 수명18동안 > 100 개의 포지주이드를 방출 할 수 있습니다. 공포증이 카도포어에서 풀어 놓인 후에, 그(것)들은 성장을 계속하고 생활 주기의 두 번째 식민지 단계입니다. 일단 그들이 ~ 5mm 크기에 도달하면, 각 포주이드는 복부 페던클에 고노 주이드의 클러스터를 개발합니다. 이 고지체는 길이가 ~1mm에 도달하면 입자를 섭취 할 수 있습니다. gonozooids가 크기에 ~ 2 ~ 3mm에 도달 한 후 그들은 광주체이드에서 방출되고 수명 주기의 유일한 독방 단계가됩니다. 일단 그들이 도달하면 ~ 6mm 크기로, 고노 주이드는 성적으로 성숙17이된다 . 고노주이드는 길이가 9mm 이상에 달할 수 있습니다. 고노주이드는 헤르마로디틱이며, 정자는 간헐적으로 방출되고, 난자의 수정은 내부적으로16,17에서발생한다. 가노주이드의 크기가 ≥ 6 mm일 때, 최대 6개의 수정란을 방출합니다. 성공적인 배양은 이러한 독특한 삶의 역사 단계각각의 특정 한 요구를 지원해야 합니다.
돌리올리드를 포함한 탈리아세산의 생태학적, 진화적 중요성으로 인해, 이 유기체의 독특한 생물학, 생리학, 생태학 및 진화역사의 이해를 증진시키기 위한 재배 방법론이 필요하다19 . Doliolids는 발달 생물학 및 기능성 유전체학에 있는 실험적인 모형 유기체로 상당한 약속이 있기 때문에 투명하고 가능성이 유전체20,21. 그러나 신뢰할 수있는 재배 방법의 부족은 실험실 모델로의 유용성을 방해합니다. 소수의 실험실이 배양 된 돌리오 리드를 기반으로 결과를 발표했지만, 우리의 지식 재배 접근 법 및 자세한 프로토콜은 이전에 출판되지 않았습니다. 다년간의 경험과 시행착오 배양 시도를 바탕으로, 이 연구의 목적은 경험을 검토하고 돌리올라이드, 특히 돌리오레타 게겐바우리종의 수집 및 재배를 위한 프로토콜을 공유하는 것이었다.

<table><tbody><tr><td>조류 배양 튜브(55mL 멸균 일회용 유리 배양 튜브)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>조류 배양용</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>모든</td><td>NA</td><td>조류 배양용 살균 장비 및 해수용</td></tr><tr><td>비커(2L 유리)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>희석된 플랑크톤 그물 토우 내용물 분류용</td></tr><tr><td>버킷(5갤런, ~20L)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>플랜톤 그물 토우의 내용물을 희석하기 위해 - 처음 사용하기 전에 해수를 조절해야</td></tr><tr><td>합니다 Carboys (20 L)&nbsp;</td><td>Any</td><td>NA</td><td>바닷물 저장용</td></tr><tr><td>Doliolid 유리 배양 항아리 (캡이 있는 1.9L 좁은 입 유리 항아리)</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01882</td><td>배양 용기</td></tr><tr><td>돌리올리드 유리 배양 항아리(캡이 있는 3.8L 좁은 입 유리 항아리)</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01858</td><td>배양 용기</td></tr><tr><td>환경 챔버(온도 제어 환경 챔버)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>플랑크톤 휠 및 배양 유지 관리를 수용하기 위해</td></tr><tr><td>47mm 필터용 여과 장치</td><td>Any</td><td>NA</td><td>배양을 위한 해수 여과용</td></tr><tr><td>유리 극세사 필터, 47mm</td><td>Whatman</td><td>1825-047</td><td>배양을 위한 해수 여과용</td></tr><tr><td>유리 피펫(borosillicate 유리 피펫(유리관), OD 10mm, ID 8mm, 벽 두께 1mm)</td><td>Science Company</td><td>NC-10894</td><td>맞춤형 절단 및 모서리 광택 호스</td></tr><tr><td>클램프, 스테인리스 스틸, #104 (178 mm)</td><td>Any</td><td>NA</td><td>배양 항아리를 플랑크톤 휠에 고정하기 위한</td></tr> <tr><td>용도Isochrysis galbana 균주 CCMP1323</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)균</td><td>주 CCMP1323</td><td>돌리오리리드 배양 공급용</td></tr><tr><td>L1 미디어 키트, 50 L</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td><td>MKL150L</td><td>조류 배양용</td></tr><tr><td>램프 (조절 가능한 암이 있는 형광등 테이블 램프)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>항아리와 비커의 돌리오리 뚜껑 조명용</td></tr><tr><td>조명이 있는 온도 조절 인큐베이터</td><td>모든</td><td>NA</td><td>조류 배양용</td></tr><tr><td>마이크로피펫 및 멸균 팁(0-20 &마이크로; l, 20-200 &마이크로; 엘, 200-1000&nbsp; &마이크로; l)</td> <td>조류</td><td>배양의 경우</td>모든 <td>NA</td></tr><tr><td>플랑크톤 그물 (202 &micro; m 0.5 m, 5:1 길이) 대구 엔드 링 및 &nbsp; 4 L 수족관 대구</td><td>Sea-Gear Corporation</td><td>90-50x5-200-4A/BB</td><td>살아있는 돌리오리드를 수집하기 위한 용도 (그림 4 참조)</td></tr><tr><td>플랑크톤 휠</td><td>NA</td><td>NA</td><td>맞춤 제작(그림 2 참조)</td></tr> <tr><td>플라스틱 랩</td><td>Any</td><td>NA</td><td>돌리오리드 배양 항아리 뚜껑 안쪽을 덮기 위해</td></tr><tr><td>과망간산칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>P279-500</td><td>항아리 및 유리 제품</td></tr> <tr><td>세척용 시약Rhodomonas&nbsp;sp. 균주 CCMP740</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)균</td><td>주 CCMP740</td><td>돌리올리드 배양 공급용</td></tr><tr><td>고무 튜빙</td><td>NA</td><td>NA</td><td>배양 항아리를 플랑크톤 휠에 고정하기 위한 용도(타이곤 튜빙으로 만들 수 있음)</td></tr><tr><td>Sodium Bisulfite</td><td>Fisher Scientific</td><td>S654-500</td><td>항아리 및 유리 제품 세척용 시약</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td>항아리 및 유리 제품 세척용 시약</td></tr><tr><td>멸균 혈청학 피펫(1mL, 5mL, 10mL, 25mL)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>조류 배양</td></tr><tr><td>용Thalassiosira weissflogii 균주 CCMP1051</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota(NCMA)</td><td>균주 CCMP1051</td><td>돌리올리드 배양 공급용</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크(250mL)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>조류 배양용</td></tr></tbody></table>

실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884)

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

젤라틴 동물원 플랑크는 해양 생태계에서 중요한 역할을합니다. 그러나, 그들의 생리학을 조사 하는 것이 일반적으로 어렵다, 성장, fecundity, 그리고 영양 상호 작용 주로 방법론 적 도전으로 인해, 그들을 배양 하는 능력을 포함 하 여. 이것은 돌리올리드, 돌리올레타 게겐바우리에 특히 사실이다. D. gegenbauri 일반적으로 생산적인 아열대 대륙 선반 시스템에서 발생, 종종 매일 기본 생산의 큰 부분을 소비 할 수있는 꽃 농도에서. 이 연구에서는 실험실 기반 연구를 수행하기 위한 목적으로 D. 게겐바우리(Gegenbauri)를 수집, 사육 및 유지 관리하는 재배 방법을 설명합니다. D. 게겐바우리 및 기타 돌리올리드 종은 표류하는 선박으로부터 202 μm 메쉬 플랑크톤 그물을 비스듬히 견인하여 살아서 포획할 수 있다. 배양은 수온이 21 °C 이하이고 미성숙한 여조, 숙성 포로주이드 및 대형 간호사로부터 시작될 때 가장 안정적으로 확립됩니다. 배양은 천천히 회전하는 플랑크톤 휠에 둥근 배양 용기에서 유지될 수 있으며 여러 세대에 걸쳐 천연 해수에서 배양된 조류의 식단을 유지할 수 있습니다. D. 게겐바우리(D. gegenbauri)의실험실 배양을 확립하는 능력 외에도, 우리는 자연적으로 조절된 바닷물에 대한 수집 상태, 조류 농도, 온도 및 노출이 모두 문화에 중요하다는 것을 입증합니다. D. 게겐바우리의 설립, 성장, 생존 및 번식.

도3에 기재된 돌리올리드를 수집하고 배양하기 위한 기술된 절차에 따라, D. 게겐바우리의 복잡한 수명 역사를 통틀어 D. 게겐바우리의 배양을 유지할 수 있다(도1)및 여러 세대에 걸쳐 그것을 지탱해 주시고 있습니다. D. 게겐바우리 재배는 여기에 설명되어 있지만, 이러한 절차는 다른 돌리올라이드 종의 재배와도 관련이 있어야합니다.
건강하고 손상되지 않은 돌리오리드 주이드를 캡처하려면 특수 그물및견인 절차를 적용해야합니다 (그림 4). 단단한 구조물이 없는 섬세한 동물로서 물리적 인 손상을 초래할 수있는 절차를 최소화하기 위해주의를 기울여야합니다. 이러한 요인에는 난류, 압력 및 그물, 공기 및 기포를 포함한 표면과의 상호 작용이 포함될 수 있습니다. 그러나 섬세한 특성에도 ...

돌리올리다 게겐바우리종을 포함한 돌리올리드는 전 세계적으로 생산적인 아대륙 선반 시스템에서 발견되는 생태학적 중요성의 작은 젤라틴 해양 동물플랑크톤이다. 이 섬세한 유기체를 배양하는 어려움은 그들의 조사를 제한합니다. 본 연구에서는 돌리올리야게겐바우리(doliolid Dolioletta gegenbauri)를수집, 사육 및 유지하기 위한 재배 접근법을 설명합니다.

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

컬터 가능한 모델 유기체의 가용성은 많은 연구 분야의 발전에 근본적이었습니다. 이 프로토콜은 우리의 지식에, Doliolids를 배양할 수 있는 유일한 접근 방식입니다. 신뢰할 수 있는 Doliolid 배양 기술은 바다의 가장 생산적인 지역 중 일부에 중요하고 척추 동물의 초기 진화 조상을 나타내는 유기체를 연구하는 독특한 실험 모델을 제공합니다.이 기술은 조류 식품 입자와 유기체가 자연에서 경험하는 컨테이너의 벽과 접촉하지 않고 물 기둥에 매달려 있기 때문에 독특합니다. 이 배양 방법은 다른 작은 젤라틴 및 갑각류 또는 플랑크톤 종의 배양에 적용 될 수있다. Doliolids는 복잡한 수명 주기를 가지고 있기 때문에 각 수명 단계의 요구를 이해하고 인식하는 것이 중요합니다.라이프 사이클과 이를 인식하고 처리하는 방법을 배우는 것은 많은 연습을 합니다. 우리의 경험에서,이 배양 기술을 배울 수있는 유일한 방법은 그것을보고 그것을 하는 것입니다. 에린 아르네슨, 니콜라스 카스탈레인, 나탈리아 로페즈, 로렌 램보이, 브리아나 피어스, 아리아 로드리게스-산티아고, 테렐 스카버러 등 여러 프로젝트 참가자들도 이 영상에 짧게 나타났다.실험실에서 Doliolid 배양을 확립하고 사육하기 전에, 심산수화 칼륨 을 심망가네이트 용액에 담그어 1.9 리터 와 3.8 리터 유리 배양 항아리를 청소하고 살균하십시오. 항아리가 하룻밤 사이에 몸을 담글 수 있도록 하십시오. 그런 다음 항아리를 비설피트 나트륨 용액으로 옮춥니까.항아리가 하룻밤 사이에 몸을 담글 수 있도록 하십시오. 다음으로 산화된 물로 항아리를 완전히 헹구십시오. 항아리가 마르도록 합니다.주식 문화를 유지하려면 엄격한 축 문화 기술을 사용하십시오. 2주마다 멸균 55 밀리리터 유리 배양 튜브에서 신선한 성장 매체의 25 밀리리터에 오래된 노화 배양의 0.5 밀리리터를 전송합니다. Doliolids를 먹이기 위한 더 많은 양의 식물성 플랑크톤을 준비하기 위해, 도끼 에서 500 밀리리터의 플라스틱 조직 배양 플라스크로 식물성 플랑크톤의 4 밀리리터를 1~50희석시 접종하도록 한다.평방 미터당 65~85마이크로아인슈타인의 시원한 백색광 조명 아래 12~12시간 밝은 주기로 환경 인큐베이터 또는 워크인 환경 챔버에서 문화를 배양합니다. 평신도 문화 플라스크는 조명을 최대화합니다. 매일 부드럽게 배회합니다.바다로 나가라. 대륙 선반에서 Doliolids를 찾으려면 수온, 염

cultivation-marine-pelagic-tunicate-dolioletta-gegenbauri-uljanin

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

방법에 의한 하와이의 꼬리 자른 오징어 절차를 간략하게...

의 식민지 Euprymna scolopes 오징어에 의한 장염 fischeri</em

여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.

단 세포 변화 조류의 클론 문화 설립

따개 비 (Amphibalanus) Balanus improvisus osmoregulation 및 antifouling 공부에 대 한 모델입니다. 그러나, 자연 계절 산란 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 여기, B. improvisus 의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 프로토콜 설명, 애벌레의 생산을 포함 합니다. 유전자 표현 연구에 교양된 barnacles의 사용을 보여 줍니다.

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

친구를 지키는 행동 속 Tigriopus의 조간 copepods의 재생산에 중요 한 역할을 한다. 그러나,이 행동 공부 방법을 잘 설명 되지 않았습니다. 여기 우리는 방법에 대 한 설명: 처녀 Tigriopus 동물, 그리고 그들의 동료를 지키는 행동의 정량 분석 2)의 1) 개별 문화.

Tigriopus Copepods 및 그들의 동료를 지키는 행동의 정량 분석의 개별 경작

오이코플레우라 디오이카는 다양한 생물학 분야의 투니케이트 모델 유기체입니다. 동물 및 조류 사료에 대한 샘플링 방법, 종 식별, 배양 설정 및 배양 프로토콜을 설명합니다. 우리는 문화 시스템을 강화하고 가능한 문제와 해결에 대해 논의하는 데 도움이 되는 주요 요소를 강조합니다.

펠라곤 코스모폴리탄 라르바천, 오이코플레우라 디오이카의 간소화된 샘플링 및 재배

이 논문은 복족류 Crepidula fornicata 의 유충 배양 방법을 소량의 실험실 규모 시스템과 현장에 배치할 수 있는 주변 해수 중우주 시스템에서 제시합니다.

Slipper Limpet, Crepidula fornicata의 유충의 실험실 및 현장 배양

이러한 미국의 랍스터 어업으로 악용 갑각류 어업에 어업에 의한 변화는 잠재적 짝짓기 성공의 감소로 이어지는, 생식 역학에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구의 목표는 생리 학적으로 또는 기능적으로 성숙 될 수 있습니다 여성의 바다 가재의 짝짓기 성공을 판명하기위한 비 침습적 방법을 개발하는 것이 었습니다.

에 대한 비 침습적 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 여성 미국의 바닷가에 연결 성공 (의 결정<em&gt; Homarus의 americanus</em&gt;)

이러한 생물학적 검정은 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스를 이용 농도 천연 해양 생물의 조직 유기 추출물로부터 병입 억지 대사의 존재를 평가하기위한 모델 육 물고기를 이용한다.

물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해

수중 환경에서 미량 금속 연구를 위해 물 샘플을 적절하게 수집하고 처리하기 위해서는 "깨끗한 기술"을 사용하는 특별한 주의가 필요합니다. 상세한 미량 금속 연구를 위해 신뢰할 수 있는 환경 모니터링 데이터와 높은 감도의 결과를 얻기 위한 샘플링, 처리 및 분석 절차를 위한 프로토콜이 제시됩니다.

클린 샘플링 및 추적 금속 연구 강 하구 바다의 분석

학습하세요 해양 동물 플랑크톤 Dolioletta gegenbauri의 독특한 배양 기법을 통해 해양 생태계 연구와 수산 생물학 실험 모델을 확립하는 방법을.

실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884)

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