Name: 자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 학습하세요 자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비 방법을. 96개 시료를 약 5시간 내에 처리하며 재현성이 뛰어난 고처리량 단백질 분해 워크플로우를 통해 정량 프로테오믹스 분석의 신뢰성을 높입니다.

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<ol><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li>
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<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).</li>
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<li>Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+on+Biomek+i-Series%5BTitle%5D)+AND+%22Technical+note%2C+Beckman+Coulter+Life+Science.+Document+%23+AAG-4890APP02%22%5BJournal%5D)">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series.</a> Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).</li>
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질량 분석에 대한 샘플 처리는 단백질 변성, 감소 및 시스테인을 차단하기 위해 알킬화를 필요로하며, 펩티드로 단백질을 절단하는 트립신 소화. 각 화학 적 또는 효소 반응은 지정된 시간에 시작되고 제어 된 온도에서 수행되어야하며, 공정의 모든 단계는 실험 적 변화가 도입 될 수있는 여러 액체 전달 단계를 포함합니다. 자동화된 샘플 처리는 이러한 딜레마에 대한 해결책을 제공합니다. 현재 사용 가능한 액체 처리 시스템은 사용되는 헤드 및 팁 유형에 따라 5% 미만의 정확도와 정밀도로 시약을 96웰 플레이트로 이송하고, 원하는 경우 14°C에서 70°C에 이르는 제어된 온도하에서 원하는 경우 흔들림으로 샘플을 배양할 수 있습니다. 우리는 자동화된 액체 핸들러를 사용하여 96웰 형식으로 SRM 어세이에 대한 플라즈마를 처리했습니다.
혈청, 혈장 및 기타 생물학적 샘플에서 단백질의 복잡한 혼합물 내에서 프로테아제 절단 부위의 수천이있다; 그리고 이들 단백질의 각각은 분열 부위 접근성 및 생성된 펩티드의 안정성에 영향을 미치는 독특한 특성을 갖는다. 따라서 모든 단백질에 최적인 시료 처리 절차를 설계하는 것은 불가능합니다. 가장 좋은 대안은 가능한 한 일관성을 가지는 것입니다.
일관성을 달성하기 위해 자동화된 액체 처리기가 수행하는 각 파이펫팅 단계를 최적화했습니다. 우리는 먼저 액체의 유형 (플라즈마, 수성 또는 유기) 및 해당 특성 (점도, 응집력 및 변동성), 하드웨어 (워크 스테이션 파이펫 팅 헤드 및 플레이트 잡기 팔) 및 실험실용품에 의해 부과 된 부피와 제약 조건을 고려했습니다. 그런 다음 포부, 디스펜싱을 위한 속도 및 후행 공기 갭, 분배의 속도 및 송풍 량, 혼합의 힘과 지속 시간을 변화시켰으며, 필요한 경우 팁 의 외부에 액체 가재를 제거하기 위해 포부 및 /또는 디스펜싱 후 팁 터치를 통합했습니다(그림 13, 보충 표 1). 안정성을 위해 사전 스크리드된 고유한 SIL 펩타이드를 각 시약에 스파이크하여 각 액체 처리 단계의 정밀도를 모니터링할 수 있습니다. 최적화 후, 대부분의 전환에 대한 프로세스 CV는 10% 미만이었으며, 자동화된 워크스테이션으로 좋은 재현성을 입증하였다(그림9, 그림 10, 그림 11 및 그림 12).
여기에 제시된 자동화된 워크플로는 수동 방법에 비해 향상된 재현성과 처리량으로 일관된 효소 소화를제공합니다(그림 9, 그림 10). 이 접근법은 질량 분석법에 의한 바이오마커 발견 및 검증의 정확성과 신뢰성을 개선할 것을 약속합니다.

질량분석법(MS)-기반 단백질 및 펩타이드 정량화는 기초 연구 및 임상 실험실에서 플라즈마 분석을 위한 생체 분석 도구로 점점 더 많이 적용되고 있다2,,3. 필요한 계측 및 정보학은 MS가 단일 MS 실행4에서수백 개의 펩티드를 정량화하는 능력으로 인해 특정 펩티드 서열을 표적화함으로써 단백질 또는 변형 된 단백질을 정량화하는 방법이 됨에 따라 급속히 발전했습니다. 시료 전제제는 모든 프로테오믹 분석을 위한 기초역할을 합니다. MS 분석에 앞서, 생물학적 샘플의 단백질은 전형적으로 변성, 감소, 알킬화, 트립펩티드내로 소화되고, 및 탈염5. 알킬레이션은 비제어 수정을 방지하고 모든 시스테인이 동일한 질량을 갖도록 시스테인을 차단합니다. 다음으로, 트립신은 펩티드에 단백질을 소화하기 위해 첨가됩니다. 이러한 각 단계는 최적화가 필요하며 전체 프로세스는 일반적으로 수동으로 수행되므로 분석 오류가 도입될 수 있습니다.
전통적인 바이오마커 개발 파이프라인은 두 가지 주요 과정으로 구성됩니다: 글로벌 단백질 발견을 위한 산탄총 프로테오믹스 는 심층단백질 인벤토리6과 고정밀 및 고처리량 단백질 정량화를 목표로 하는 검증 및 검증을 위한 표적 프로테오믹스7. MS 접근법에 관계없이, 샘플 제제는 동일하며 펩타이드 혼합물로 단백질의 효소 절단을 중심으로 합니다. Van Eyk 및 Sobhani8에의해 제안된 바와 같이, 발견 및 표적 분석모두에 대한 정확하고 정밀하며 재현 가능한 분석을 가능하게 하는 방법을 갖는 것은 발견 바이오마커를 임상 구현 분석법으로 효과적으로 이동시키는 것이 요구된다. 이를 위해 시료 전처리의 자동화가 도움이 되고 높은 처리량 분석으로 효율성을 높일 수 있는 기능을 제공합니다. 수동 방법은 전형적으로 바이오마커 및 진단2,,9를포함하는 개정된 생물분석방법 검증 지침에서 식품의약품안전청(FDA)에 의해 지정된 허용 한계를 초과하는 분석 오류를 도입한다. 수천 개의 생물학적 샘플을 준비하고 분석해야 하는 바이오마커 연구를 용이하게 하기 위해서는 빠르고 매우 정확하며 핸즈프리 MS 단백질 샘플 준비 워크플로우의 개발이 필요합니다. MS 샘플 준비에는 오류가 발생될 수 있는 많은 단계가 있으며 프로세스가 지루하고 시간이 많이 걸립니다.
우리의 개선 된 방법에서, 자동화 된 워크 스테이션은 총 6 단계 (그림 1)에서 필요한 모든 플라즈마 샘플 준비 절차를 수행하도록 프로그래밍되어 1) 정확한 액체 전달을보장합니다. 2) 반응은 일관된 시간에 개시되고 중단되는; 3) 반응은 조절 된 온도 (즉, 인큐베이터)에서 수행된다; 및 4) 반응은 모든 반응에 대해 균일한 혼합을 가한다. 우리는 또한 96 웰 형식으로 LC-MS 기반 단백질 및 펩타이드 정량화의 품질과 재현 가능한 처리량을 보장하기 위해 외인성 품질 관리 단백질 및 내부 표준 (안정적인 동위 원소 표지 펩타이드 표준)을 추가구현했습니다. 시약 준비, 작업 시간 및 총 1,000,000개의 파이펫팅 단계를 포함하여 개별 튜브에서 96개의 샘플을 처리해야 합니다. 자동화는 실습 시간과 관련된 인간 상호 작용 의 수를 줄입니다.

<table><tbody><tr><td>풀링된 건강한 인간 혈장</td><td>Bioreclamation Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr>E.Coli <td>Sigma-Aldrich</td><td>G3153-5MG</td><td>외인성 대조 단백질</td>의 재조합 Acetonitrile, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific A998SK1 LC MS/MS 용매<td>B-갈락토시다아제</td></tr>에서 인간 혈장 테스트를 완료했습니다.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomek i7 자동화 워크스테이션</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>단백질체 시료 전처리 워크스테이션: Biomek 자동화 워크스테이션은 질병 또는 기타 질환 진단에 사용하도록 의도되거나 검증되지 않았습니다</td></tr><tr><td>. Biomek i-시리즈 팁 230&micro; L 비 멸균</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B85903&nbsp;</td><td>팁, i7 소모품</td></tr><tr><td>Biomek i-시리즈 팁 90&micro; L 비 멸균</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B85881&nbsp;</td><td>팁, i7 소모품</td></tr><tr><td>FG, 소화에 사용되는 키트 트립신 TPCK</td><td>Sciex</td><td>4445250</td><td>트립신</td></tr><tr><td>하드-쉘 96-웰 PCR 플레이트, 로우 프로파일, 얇은 벽, 스커트, 녹색/투명&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>#hsp9641</td><td>오토샘플러 플레이트</td></tr><tr><td>Octyl B-D-Glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9882-5G</td><td>소화에 사용되는</td></tr><tr><td>세제 폴리프로필렌, 96-Round Deep Well Plate Sterile</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>267007</td><td>시약 및 분해 플레이트</td></tr><tr><td>Prominence UFLCXR HPLC 시스템</td><td>Shimadzu, 일본</td><td></td><td>고유량 LC 시스템</td></tr><tr><td>QTRAP 6500</td><td>SCIEX</td><td></td><td>질량 분석기</td></tr><tr><td>물, HPLC 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W54</td><td>LC MS/MS 용매</td></tr><tr><td>Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm</td><td>Waters</td><td>186003564</td><td>LC MSMS 컬럼</td></tr></tbody></table>

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

프로테오믹스에서 질량 분석 분석을 위한 샘플 준비에는 펩타이드 혼합물로 단백질의 효소 절단이 필요합니다. 이 프로세스는 변성, 감소, 알킬화 및 절단을 달성하기 위해 수많은 인큐베이션 및 액체 전달 단계를 수반합니다. 이 워크플로를 자동화된 워크스테이션에 적용하면 효율성을 높이고 분산 계수를 줄일 수 있어 샘플 유형 간의 통계 비교를 위해 보다 신뢰할 수 있는 데이터를 제공할 수 있습니다. 우리는 이전에 자동화 된 프로테오믹 샘플 준비워크플로우 1을설명했습니다. 여기에서는 다음과 같은 장점을 가진 보다 효율적이고 더 나은 제어 워크플로우의 개발을 보고합니다: 1) 시약을 결합하여 액체 전달 단계의 수가 9개에서 6개로 줄어듭니다. 2) 파이펫팅 시간은 여러 채널이있는 96 위치 파이펫팅 헤드를 사용하여 선택적 팁 파이펫팅에 의해 감소됩니다. 3) 최대 45개의 데크 포지션을 사용할 수 있도록 잠재적 처리량이 증가합니다. 4) 시스템의 완전한 인클로저는 향상된 온도 및 환경 제어를 제공하고 샘플 또는 시약의 오염 가능성을 감소시킵니다. 5) 각 샘플에 β-갈락토시다아제 단백질뿐만 아니라 안정적인 동위원소 표지 된 펩티드를 첨가하면 전체 공정에서 모니터링 및 품질 관리가 가능합니다. 이러한 하드웨어 및 공정 개선은 좋은 재현성을 제공하고 분석 내 및 분석 간 정밀도(CV 20% 미만)를 개선합니다. LC-MS 기반 단백질 및 펩타이드 정량화를 위해. 96웰 플레이트에서 96개의 샘플을 소화하기 위한 전체 워크플로우를 약 5시간 만에 완료할 수 있습니다.

여기서, 우리는 질량 분광법 기반 정량적 단백질 분석을 위한 자동화된 혈장 단백질 소화 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서는 단백질 변성, 감소, 알킬화 및 트립신 소화 반응을 위한 액체 전달 및 배양 단계가 간소화되고 자동화됩니다. 원하는 정밀도로 96웰 플레이트를 준비하는 데는 약 5시간이 걸립니다.

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

이 자동화된 워크플로우는 우수한 재현성과 처리량을 갖춘 일관된 단백질 효소 소화를 제공합니다. 이를 통해 대량 분광법에 의한 바이오마커 발견, 검증 및 임상 적용의 정확성과 신뢰성을 향상시킵니다. 이 기술의 장점은 전체 워크플로우가 단백질의 대다수에 대해 20% 미만의 인트라 분석 및 분석 간 CV를 사용하여 약 5시간 안에 96개의 샘플에 대해 완료될 수 있다는 것입니다.이 정확한 높은 처리량 샘플 준비를 통해 조직 또는 생물 유체의 질병 프로템을 더 큰 규모로 조사할 수 있습니다. 또한, 자동화된 프로테오믹 샘플 준비 워크플로우는 고함량 및 정량적 프로테오믹 분석을 위한 견고한 기초를 제공합니다. 시더 시나이의 고처리량 센터 장과 실험실의 연구 동료인 케이시 존슨(Casey Johnson) 박사가 수술을 시연합니다.분석을 시작하기 전에 풀이 잡힌 건강한 인간 플라즈마 5마이크로리터를 96라운드 딥 웰 프로필렌 플레이트에 넣습니다. 모든 샘플이 로드되면 액체 처리기 장치 소프트웨어를 열고 메서드 탭 아래에 모든 축을 선택하여 자동화된 액체 처리기를 방향을 지정합니다. 모든 워크스테이션 주사기에 보이는 기포가 포함되어 있지 않은지 확인하고 새 메서드를 열고 Run을 클릭하여 메서드를 시작합니다.자동 샘플러 프롬프트에 사용할 값을 입력하여 방법 끝에 자동 샘플러 플레이트를 준비하고 확인을 클릭합니다. 첫 번째 열 프롬프트에 사용할 값을 입력하고 확인을 클릭합니다. 마지막 열 프롬프트에 사용할 값을 입력할 때 12를 입력하고 확인을 클릭합니다. 샘플 플레이트가 최소 20마이크로리터의 샘플 볼륨과 함께 사용되는 경우 샘플 플레이트 프롬프트에 사용할 값을 입력하여 확인을 클릭합니다. 안내 랩웨어 설정 창의 방향을 따라 계속을 클릭합니다. 적절한 시약을 적절한 우물에 로드하고 다음을 클릭합니다. 시약, 반응, 샘플 및 자동 샘플러 플레이트, 6웰 90 마이크로 리터 팁 박스, 빈 90 마이크로 리터 팁 박스 및 전체 230 마이크로 리터 팁 상자를 포함하여 그림과 같이 자동화 된 액체 처리기 데크를 배치하려면 다음을 다시 클릭하십시오.그런 다음 작업을 시작하려면 마무리를 클릭합니다. 원심분리 프롬프트 후 계속되면 반응판을 회수하고 플레이트를 원심분리기에 넣습니다. 원심 분리가 끝나면 반응 판을 자동화된 액체 처리기 내의 위치로 반환하고 계속을 클릭합니다.액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분광법 해석의 경우, 분당 250 마이크로리터의 유속을 가진 고압 액체 크로마토그래피에 의해 C18 2.1에서 100 밀리미터 3.5 마이크로미터 컬럼으로 펩티드를 해결하고 삼중 사중극 질량 분광계에서 라인으로 분석하였다. 적재 후 5분 후, 5%버퍼 B 용액으로 컬럼을 평형화하고 30분 동안 완충 B의 선형 5-35%그라데이션으로 펩티드를 엘테한다. 용출의 끝에서, 다음 샘플을로드하기 전에 5 %의 버퍼 B로 5 분 세척 후 10 분 동안 98 %의 버퍼 B로 컬럼을 세척합니다.온라인 전환의 경우 2단계 스위칭 밸브를 사용하여 이온 소스에 들어가기 전에 열 후 용희석을 낭비하도록 전환합니다. 모든 샘플을 발출하면 다중 반응 모니터링 데이터를 처리할 수 있습니다. 본 대표적인 분석에서, 3개의 베타-갈 펩티드와 2개의 알부민 펩타이드는 스파이크 베타-갈및 가공된 플라즈마 알부민 단백질로부터 감시되었다.자동화된 샘플 준비 워크플로우의 정밀도는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법의 분산계수를 뺀 총 프로테오믹 선택된 반응 모니터링 워크플로우의 분산 계수의 백분율로 계산되었다. 예상대로, 인간 혈청 알부민과 베타 갈 단백질 모두에 대해 양호한 신호 강도가 관찰되었다. 액체 전달 단계의 정밀도를 모니터링하기 위해, 독립적인 시약 전달 단계에서 내인성 인간 혈청 알부민 및 외인성 베타 갈 단백질에 대해 안정적인 동위원소 라벨 펩티드 표준을 스파이크할 수 있다.자동화된 프로테오믹 샘플 준비 워크플로우의 유효성을 검사하기 위해 동일한 날 준비된 21개의 우물에서 분산 값의 장중 계수를 계산했습니다. 40단백질에 대한 평균 장중 분산계는 4~20%까지 플레이트 기반 자동화 워크플로우의 에지 효과를 평가하기 위해 지정된 컬럼 및 행 내의 특정 우물에서 분산의 백분율 계수를 계산할 수 있습니다. 본 대표적인 실험에서, 다중 반응 모니터링 신호 강도는 3-22%에 이르는 분산계수의 퍼센트계수를 가진 모든 컬럼 및 행 구성에서 유사했으며 가장 중요한 단계는 원하는 96웰 플레이트 맵에 따라 샘플을 올바르게 추가하고 소프트웨어에 의한 지시에 따라 시약 플레이트를 올바르게 설정하는 것이다.이 자동화된 프로테오믹 샘플 준비 방법을 통해 연구자들은 신뢰할 수 있고 정량적인 프로테오믹스 데이터를 대규모로 수집할 수 있습니다.

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