자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비
2020년 4월 24일
여기서, 우리는 질량 분광법 기반 정량적 단백질 분석을 위한 자동화된 혈장 단백질 소화 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서는 단백질 변성, 감소, 알킬화 및 트립신 소화 반응을 위한 액체 전달 및 배양 단계가 간소화되고 자동화됩니다. 원하는 정밀도로 96웰 플레이트를 준비하는 데는 약 5시간이 걸립니다.
이 자동화된 워크플로우는 우수한 재현성과 처리량을 갖춘 일관된 단백질 효소 소화를 제공합니다. 이를 통해 대량 분광법에 의한 바이오마커 발견, 검증 및 임상 적용의 정확성과 신뢰성을 향상시킵니다. 이 기술의 장점은 전체 워크플로우가 단백질의 대다수에 대해 20% 미만의 인트라 분석 및 분석 간 CV를 사용하여 약 5시간 안에 96개의 샘플에 대해 완료될 수 있다는 것입니다.
이 정확한 높은 처리량 샘플 준비를 통해 조직 또는 생물 유체의 질병 프로템을 더 큰 규모로 조사할 수 있습니다. 또한, 자동화된 프로테오믹 샘플 준비 워크플로우는 고함량 및 정량적 프로테오믹 분석을 위한 견고한 기초를 제공합니다. 시더 시나이의 고처리량 센터 장과 실험실의 연구 동료인 케이시 존슨(Casey Johnson) 박사가 수술을 시연합니다.
분석을 시작하기 전에 풀이 잡힌 건강한 인간 플라즈마 5마이크로리터를 96라운드 딥 웰 프로필렌 플레이트에 넣습니다. 모든 샘플이 로드되면 액체 처리기 장치 소프트웨어를 열고 메서드 탭 아래에 모든 축을 선택하여 자동화된 액체 처리기를 방향을 지정합니다. 모든 워크스테이션 주사기에 보이는 기포가 포함되어 있지 않은지 확인하고 새 메서드를 열고 Run을 클릭하여 메서드를 시작합니다.
자동 샘플러 프롬프트에 사용할 값을 입력하여 방법 끝에 자동 샘플러 플레이트를 준비하고 확인을 클릭합니다. 첫 번째 열 프롬프트에 사용할 값을 입력하고 확인을 클릭합니다. 마지막 열 프롬프트에 사용할 값을 입력할 때 12를 입력하고 확인을 클릭합니다. 샘플 플레이트가 최소 20마이크로리터의 샘플 볼륨과 함께 사용되는 경우 샘플 플레이트 프롬프트에 사용할 값을 입력하여 확인을 클릭합니다. 안내 랩웨어 설정 창의 방향을 따라 계속을 클릭합니다. 적절한 시약을 적절한 우물에 로드하고 다음을 클릭합니다. 시약, 반응, 샘플 및 자동 샘플러 플레이트, 6웰 90 마이크로 리터 팁 박스, 빈 90 마이크로 리터 팁 박스 및 전체 230 마이크로 리터 팁 상자를 포함하여 그림과 같이 자동화 된 액체 처리기 데크를 배치하려면 다음을 다시 클릭하십시오.
그런 다음 작업을 시작하려면 마무리를 클릭합니다. 원심분리 프롬프트 후 계속되면 반응판을 회수하고 플레이트를 원심분리기에 넣습니다. 원심 분리가 끝나면 반응 판을 자동화된 액체 처리기 내의 위치로 반환하고 계속을 클릭합니다.
액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분광법 해석의 경우, 분당 250 마이크로리터의 유속을 가진 고압 액체 크로마토그래피에 의해 C18 2.1에서 100 밀리미터 3.5 마이크로미터 컬럼으로 펩티드를 해결하고 삼중 사중극 질량 분광계에서 라인으로 분석하였다. 적재 후 5분 후, 5%버퍼 B 용액으로 컬럼을 평형화하고 30분 동안 완충 B의 선형 5-35%그라데이션으로 펩티드를 엘테한다. 용출의 끝에서, 다음 샘플을로드하기 전에 5 %의 버퍼 B로 5 분 세척 후 10 분 동안 98 %의 버퍼 B로 컬럼을 세척합니다.
온라인 전환의 경우 2단계 스위칭 밸브를 사용하여 이온 소스에 들어가기 전에 열 후 용희석을 낭비하도록 전환합니다. 모든 샘플을 발출하면 다중 반응 모니터링 데이터를 처리할 수 있습니다. 본 대표적인 분석에서, 3개의 베타-갈 펩티드와 2개의 알부민 펩타이드는 스파이크 베타-갈및 가공된 플라즈마 알부민 단백질로부터 감시되었다.
자동화된 샘플 준비 워크플로우의 정밀도는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법의 분산계수를 뺀 총 프로테오믹 선택된 반응 모니터링 워크플로우의 분산 계수의 백분율로 계산되었다. 예상대로, 인간 혈청 알부민과 베타 갈 단백질 모두에 대해 양호한 신호 강도가 관찰되었다. 액체 전달 단계의 정밀도를 모니터링하기 위해, 독립적인 시약 전달 단계에서 내인성 인간 혈청 알부민 및 외인성 베타 갈 단백질에 대해 안정적인 동위원소 라벨 펩티드 표준을 스파이크할 수 있다.
자동화된 프로테오믹 샘플 준비 워크플로우의 유효성을 검사하기 위해 동일한 날 준비된 21개의 우물에서 분산 값의 장중 계수를 계산했습니다. 40단백질에 대한 평균 장중 분산계는 4~20%까지 플레이트 기반 자동화 워크플로우의 에지 효과를 평가하기 위해 지정된 컬럼 및 행 내의 특정 우물에서 분산의 백분율 계수를 계산할 수 있습니다. 본 대표적인 실험에서, 다중 반응 모니터링 신호 강도는 3-22%에 이르는 분산계수의 퍼센트계수를 가진 모든 컬럼 및 행 구성에서 유사했으며 가장 중요한 단계는 원하는 96웰 플레이트 맵에 따라 샘플을 올바르게 추가하고 소프트웨어에 의한 지시에 따라 시약 플레이트를 올바르게 설정하는 것이다.
이 자동화된 프로테오믹 샘플 준비 방법을 통해 연구자들은 신뢰할 수 있고 정량적인 프로테오믹스 데이터를 대규모로 수집할 수 있습니다.
개요
본 논문은 질량 분석 기반의 정량적 단백질체 분석을 위해 설계된 자동화된 혈장 단백질 소화 방법을 제시합니다. 간소화된 워크플로우를 통해 약 5시간 만에 96개의 샘플을 준비할 수 있어, 재현성과 처리량이 향상되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 단백질체학
- 질량 분석법
- 바이오마커 발굴
배경
- 자동화된 워크플로우는 단백질체학 연구의 정확성과 신뢰성을 향상시킵니다.
- 대규모 조사를 위해서는 고처리량 시료 준비가 필수적입니다.
- 정량 분석을 위해서는 일관된 효소 소화가 매우 중요합니다.
- 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 분석 내 및 분석 간 변동성을 최소화해야 합니다.
연구 목적
- 재현성을 향상시키는 단백질 소화를 위한 자동화된 방법을 개발합니다.
- 질병 프로테옴의 고처리량 분석을 용이하게 합니다.
- 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 기초를 제공합니다.
사용된 방법
- 시료 준비를 위한 자동 액체 핸들러.
- 분석을 위한 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분석법.
- 정밀도 모니터링을 위한 안정 동위원소 표지 펩타이드 표준물질의 사용.
- 워크플로 정밀도를 평가하기 위한 변동 계수 계산.
주요 결과
- 대부분의 단백질에 대해 20% 미만의 분석 내(intra-assay) 및 분석 간(inter-assay) CV를 나타냄.
- 40종 단백질의 평균 일내(intraday) CV는 4-20% 범위였음.
- 가장자리 효과(edge effect) 분석 결과, 플레이트 구성 전반에 걸쳐 일관된 신호 강도가 확인됨.
- 대규모의 신뢰할 수 있는 정량적 데이터 수집을 달성함.
결론
- 자동화된 방법은 단백질체 분석 효율성을 크게 향상시킵니다.
- 이를 통해 연구자는 높은 신뢰도로 대규모 연구를 수행할 수 있습니다.
- 최적의 결과를 얻기 위해서는 적절한 설정과 시료 로딩이 매우 중요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
질량 분석을 위한 자동화된 혈장 시료 전처리는 바이오 제약 분야의 바이오마커 발굴 및 검증에 필요한 고처리량의 재현성 있는 프로테오믹스 워크플로우 요구를 충족합니다. 5시간 이내에 96개 시료에 대해 일관된 효소 소화를 가능하게 하여 가변성을 줄임으로써, 이 방법은 신뢰할 수 있는 통계적 비교와 대규모 질환 프로테옴 분석을 지원합니다. 이를 통해 해당 워크플로우는 초기 발굴 및 중개 연구의 정량 프로테오믹스를 위한 확장 가능한 기반이 됩니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 정밀한 단백질 소화 및 펩타이드 생성을 통해 하위 질량 분석 분석을 위한 가설 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 수동 액체 이송 단계를 9단계에서 6단계로 줄여 워크플로 효율성을 높이고 작업자에 따른 변동성을 감소시킵니다.
- 예측 신뢰도: 대부분의 단백질에 대해 20% 미만의 분석 내 및 분석 간 CV를 달성하여, 실험 간 신뢰할 수 있는 정량화 및 데이터 비교 가능성을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 선택적 팁 피펫팅 기능이 있는 96채널 피펫팅 헤드를 사용하여 피펫팅 시간을 단축하고 처리량 잠재력을 높입니다.
- 재현성: 시스템 전체를 완전히 밀폐하여 온도 및 환경 제어 능력을 향상시킴으로써 오염 위험을 줄이고 분석 일관성을 높입니다.
- 품질 관리: 안정 동위원소 표지 펩타이드와 β-galactosidase 단백질을 내부 표준 물질로 포함하여, 전체 공정 동안 정밀도를 모니터링하고 워크플로 성능을 검증합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 조직 또는 생체 시료 내 질환 프로테옴의 대규모 조사를 지원하여, 정량적 엄격함을 갖춘 바이오마커 발굴을 가능하게 합니다.
- 전임상 모델 일치성: 질환 관련 시스템에서 기전적 이해와 타겟 검증에 정보를 제공할 수 있는 신뢰할 수 있는 프로테오믹스 데이터를 생성합니다.
- 위험 조정 기반의 발전: 기술적 변동성을 최소화하여 전임상 개발 단계의 go/no-go 결정(진행 여부 결정)을 지원하는 일관된 데이터 품질을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 자동화된 워크플로우는 시료 준비부터 데이터 분석에 이르는 발견 연속체(discovery continuum)에 적합하며, 타겟 선정 및 리드 최적화 노력에 정보를 제공하는 재현 가능한 프로테오믹 프로파일링을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 정확한 단백질 식별 및 정량을 위해 일관된 펩타이드 혼합물을 생성함으로써 가설 기반의 프로테오믹 분석을 촉진합니다.
- 스크리닝(Screening): LC-MS/MS 분석을 위한 생물학적 시료의 고처리량 준비를 가능하게 하여 확장 가능한 스크리닝 캠페인을 지원합니다.
- 분석(Analytics): 변동 계수가 낮은 정량적 펩타이드 측정값을 생성하여 조건 간의 단백질 발현을 정밀하게 비교할 수 있게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 재현 가능한 시료 처리를 통해 임상 시료 내 바이오마커 후보 물질을 검증하기 위한 기반을 제공합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 여러 프로젝트와 팀에서 일관된 프로테오믹 워크플로우를 위해 재사용할 수 있는 표준화되고 자동화 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 분석 전 변동성을 최소화하여 단백질 정량의 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 수작업 시간 단축과 샘플 처리량 증대를 통해 실험실 효율성을 높입니다.
- 전략적 가치: 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로테오믹스 데이터를 제공함으로써 타겟 검증의 의사 결정 능력을 강화합니다.
- 포트폴리오 영향: 샘플 세트 전반에 걸친 일관된 데이터 품질을 통해 바이오마커의 위험 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 자동 액체 핸들링 및 질량 분석 기반 프로테오믹스에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 온도 제어 및 인클로저 기능이 있는 호환 가능한 자동화 워크스테이션의 사용 가능 여부에 따라 결정됩니다.
- 소프트웨어 가이드 프로토콜에 따른 표준화된 시약 준비 및 플레이트 설정이 필수적입니다.
- 적절한 샘플 로딩, 원심분리 통합 및 방법 개시에 대한 교육이 포함됩니다.
- 정밀 모니터링 및 품질 관리를 위해 안정 동위원소 표지 펩타이드의 사용에 의존합니다.
