Name: 표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 고커버리지 다중 병변 시퀀싱과 면역표현형 분석을 활용한 종양내 이질성 평가 방법입니다. 이 프로토콜은 동일 환자의 원발성 및 전이성 병변에서 클론 및 서브클론 유전자 변이를 식별하여 종양 진화를 이해하고 맞춤형 표적 치료 전략 수립에 활용할 수 있습니다.

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연구 결과는 이탈리아 암 게놈 프로젝트 (그랜트 번호)에 의해 지원되었습니다. FIRB RBAP10AHJB), 아소시아지오네 이탈리아나 리케르카 칸크로 (AIRC; 그랜트 번호 12182 에 AS 와 18178 VC), FP7 유럽 공동체 보조금 (캠 팩 No 602783 에 AS). 자금 조달 기관은 데이터의 수집, 분석 및 해석또는 원고 작성에 아무런 역할을하지 않았다.

<ol><li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li>
<li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution%3A+Past%2C+Present%2C+and+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li>
<li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li>
<li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li>
<li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+oncogenesis%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li>
<li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li>
<li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979(2014).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li>
<li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692(2013).</li>
<li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li>
<li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리의 방법은 주어진 환자의 별개의 병변에서 수직 데이터 (즉, 형태학, DNA 염기서열 분석 및 면역 조직 화학)의 통합을 통해 고형 종양의 진행에 관여하는 분자 변이를 식별 할 수 있습니다. 우리는 409개의 암 관련 유전자8의 코딩 서열을 심문하여 돌연변이 침묵 종양 유형(즉, SPN, 췌장의 고체-가성세포 신생물)에서 클론 및 하부 클론 이벤트를 검출하는우리의 방법의 능력을 입증하였다. 여기서 사용되는 앰플리코 기반 표적 시퀀싱 접근법의 장점은 1000x의 전형적인 평균 커버리지 깊이에서 심문 된 영역 (15,992)에 걸쳐 커버리지 (90 % 표적 염기는 100x, 95 %는 20 배 커버)의 균일성입니다. 미세 해부를 통한 신생물 세포 농축에 결합된 높은 커버리지 커버리지는 낮은 대문자 주파수 이벤트를 검출하기 위한 높은 감도를 보장합니다. 우리가 이전에9를보여주었듯이, 표적으로 한 순서 는 FFPE 조직에서 DNA 견본에 2% ee...

차세대 염기서열 분석(NGS)의 출현은 암이 진단되고 치료되는 방식에 혁명을 일으켰습니다1. 다국지 시퀀싱에 결합된 NGS는 고형 종양2에서고종양 내 이질성(ITH)의 높은 정도를 노출시켰으며, 이는 부분적으로 다른 약물 민감성을 가진 서브클론의 존재로 인한 표적 치료의 실패를 설명한다2 . 게놈 전체 시퀀싱 연구에 의해 제기 된 중요한 도전은 개별 적인 암에 있는 승객 (즉, 중립) 및 드라이버 돌연변이 를 구별하는필요성입니다 3. 몇몇 연구 결과는 실제로, 특정 종양에서, 승객 돌연변이가 ITH의 대다수를 차지한다는 것을 보여주었습니다, 운전사 변경은 동일 개별의 병변 중 보존되는 경향이 있는 동안4. 또한 큰 돌연변이 부담 (폐암 및 흑색종에서 볼 수 있듯이)이 반드시 큰 종하 돌연변이 부담을 의미하지는 않는다는 것을 주의하는 것이 중요합니다2. 따라서, 높은 수준의 ITH는 낮은 돌연변이 부담을 가진 종양에서 발견될 수 있다.
전이는 전 세계적으로 암 관련 죽음의 90% 이상에 책임 있습니다5; 그러므로, 1 차및 전이성 병변 중 드라이버 유전자의 돌연변이 이질성을 포착하는 것은 고급 단계 질병을 위한 효과적인 치료의 디자인에 중요합니다. 임상 시퀀싱은 일반적으로 고정 된 조직에서 핵산에 수행, 때문에 가난한 DNA 품질의 게놈 전체 탐사 어려운 렌더링. 다른 한편으로는, 임상 순서의 의도는 주어진 치료 식이요법에 응답성/무반응을 예측할 수 있는 실행 가능한 돌연변이 및/또는 돌연변이를 확인하는 것입니다. 시퀀싱은 임상적으로 관련된 정보를 적시에 추출하기 위해 게놈의 작은 분획으로 제한될 수 있습니다. 낮은 처리량의 DNA 프로파일링(예: Sanger Sequencing)에서 NGS로의 전환은 수백 개의 암 관련 유전자를 높은 범위의 범위에서 분석할 수 있게 하여 종전 이벤트를 검출할 수 있게 합니다. 여기에서, 우리는 동일 개별에게서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에 설명된 방법은 세 가지 잘 확립된 접근법(조직학적 분석, 고커버리지 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석)을 통합하여 확인된 변이의 기능적 결과를 예측합니다. 접근법은 도 1에 개략적으로 설명되고 췌장의 고체 가성 신생물(SPN)의 5가지 전이성 사례의 연구에 적용되었다. 우리는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 견본의 처리 그리고 분석을 기술하는 동안, 동일 절차는 신선한 동결 조직에서 유전 물질에 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2100 바이오분석기 기기</td><td>애질런트 테크놀로지스</td><td>G2939BA</td><td>&nbsp; 자동 전기영동 도구</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 키트</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>NC9959336</td><td>PCR 산물 정제를 위한 비드 기술; 비즈 기반 정제 시약</td></tr><tr><td>애질런트 고감도 DNA 키트</td><td>애질런트 테크놀로지스</td><td>5067-4627</td><td>라이브러리 정량화</td></tr><tr><td>안티 BAP1</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td>SC-28383</td><td>항체</td></tr><tr><td>안티 GLUT1</td><td>써모 사이언티픽</td><td>RB-9052</td><td>항체</td></tr><tr><td>안티 KDM6A</td><td>세포 신호 전달</td><td>#33510</td><td>항체</td></tr><tr><td>안티 p53</td><td>노보카스트라</td><td>NCL-L-p53-DO7</td><td>항체</td></tr><tr><td>안티 & 베타; 카테닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7207</td><td>항체</td></tr><tr><td>차단 솔루션</td><td>수제</td><td>-</td><td>TBST의 5% 소 혈청 알부민(BSA)</td></tr><tr><td>내인성 과산화효소 비활성화 용액</td><td>수제</td><td>-</td><td>트리스 완충 식염수(TBS)에서 3% H2O2</td></tr><tr><td>라이카 CV 울트라</td><td>라이카</td><td>70937891</td><td>Entellan mountin 미디어</td></tr><tr><td>에피토프 회수 솔루션 1</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>AR9961</td><td>구연산염 기반 pH 6.0 에피토프 회수 용액</td></tr><tr><td>에피토프 회출 솔루션 2</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>AR9640</td><td>EDTA 기반 pH 9.0 에피토프 회수 용액</td></tr><tr><td>Eppendorf 0.2 ml PCR 튜브, 투명</td><td>에펜도르프</td><td>951010006</td><td>튜브</td></tr><tr><td>Eppendorf DNA LoBind 튜브, 1.5 mL</td><td>에펜도르프</td><td>22431021</td><td>튜브</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>디아패스</td><td>A0123</td><td>IHC 탈파라핀화 시약</td></tr><tr><td>ImmEdge 펜&nbsp; 소수성&nbsp; 장벽&nbsp; 펜</td><td>벡터 연구소</td><td>H&shy; 4000</td><td>소수성 펜</td></tr><tr><td>ImmPACT DAB&nbsp; 과산화효소</td><td>벡터 연구소</td><td>SK&shy; 4105</td><td>HRP 기질</td></tr><tr><td>ImmPRESS 안티 & 수줍음; 토끼&nbsp; Ig&nbsp; 시약&nbsp; 과산화효소</td><td>벡터 연구소</td><td>MP&shy; 7401&shy; 50</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>ImmPRESS 안티 & 수줍음; 마우스&nbsp; Ig&nbsp; 시약&nbsp; 과산화효소</td><td>벡터 연구소</td><td>MP&shy; 7402&shy; 50</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>통합 유전체학 뷰어(IGV)</td><td>브로드 인스티튜트</td><td>-</td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 종합 암 패널</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4477685</td><td>409개 암 관련 유전자의 다중화된 표적 선택. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 라이브러리 키트 2.0</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4480441</td><td>Ion AmpliSeq 패널을 사용한 앰플리콘 라이브러리 준비</td></tr><tr><td>Ion Chef 기기</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4484177</td><td>자동 라이브러리 준비, 템플릿 준비 및 칩 로딩</td></tr><tr><td>Ion PI 칩 키트 v3 또는 Ion 540 칩</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>A26771 또는 A27766</td><td>시퀀싱을 위한 바코드 칩</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q Chef 키트 또는 Ion 540 Kit-Chef</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>A27198 또는 A30011</td><td>템플릿 준비</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q 시퀀싱 200 키트 또는 Ion S5 시퀀싱 키트</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>A26433 또는 A30011</td><td>시퀀싱</td></tr><tr><td>Ion Proton 또는 Ion GeneStudio S5 시스템</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4476610 또는 A38196</td><td>시퀀싱 시스템</td></tr><tr><td>Ion Reporter 소프트웨어 - AmpliSeq 종합 암 패널 종양-정상 쌍</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4487118</td><td>워크플로</td></tr><tr><td>Ion Reporter 소프트웨어 - 업로더 플러그인</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4487118</td><td>데이터 분석 도구</td></tr><tr><td>Ion Torrent Suite 소프트웨어 - Coverege Analysis 플러그인</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4483643</td><td>생성된 순차 커버리지 수준을 설명하는 플러그인</td></tr><tr><td>Ion Torrent Suite 소프트웨어 - Variant Caller 플러그인</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4483643</td><td>참조를 통해 샘플에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 삽입 및 결실을 식별할 수 있는 플러그인</td></tr><tr><td>Ion Xpress 바코드 어댑터 1-96 키트</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4474517</td><td>고유한 바코드 어댑터</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>ND-2000 시리즈</td><td>DNA 순도 검출</td></tr><tr><td>NCBI 참조 시퀀스(RefSeq) 데이터베이스</td><td>NCBI</td><td>-</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix 하이 피델리티</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12532-016 또는 12532-024</td><td>PCR 증폭을 위한 SuperMix; 충실도가 높은 PCR 믹스</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 혈액 미니 키트</td><td>퀴아겐</td><td>51106 0R 51104</td><td>DNA 혈액 추출 키트</td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE 조직</td><td>퀴아겐</td><td>56404</td><td>DNA FFPE 조직 추출 키트</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광계</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>질문32866</td><td>DNA 정량화</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 분석 키트</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>질문32850</td><td>Qubit 2.0 형광계에서 DNA 정량화를 위한 키트</td></tr><tr><td>TBST</td><td>수제</td><td>-</td><td>트리스 완충 식염수(TBS) 및 0.1%의 Tween 20</td></tr><tr><td>티슈텍 프리즈마 플러스 & 티슈텍 필름</td><td>사쿠라 유럽</td><td>6172</td><td>자동 조직 슬라이드 염색기</td></tr><tr><td>VEP(Variant Effect Predictor) 소프트웨어</td><td>엠비-EBI</td><td>-</td><td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /도구/VEP</td></tr><tr><td>자일렌, 이성질체 혼합물</td><td>카를로 에르바</td><td>492306</td><td>IHC 탈파라핀화 시약</td></tr></tbody></table>

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

종양 내 이질성 (ITH)을 평가하는 것은 표적으로 한 치료의 실패를 예상하고 그에 따라 효과적인 항 종양 전략을 디자인하기 위하여 가장 중요합니다. 시료 처리 및 커버리지 의 깊이의 차이로 인해 우려가 자주 제기되지만, 고형 종양의 차세대 시퀀싱은 종양 유형 전반에 걸쳐 매우 가변적인 ITH 정도를 해명했습니다. 클론 및 전이성 집단의 식별을 통해 1 차 및 전이성 병변 사이의 유전 적 관련성을 포착하는 것은 사전 단계 질병에 대한 치료법의 설계에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 동일 환자에서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에서 기술된 실험적인 접근은 세 개의 잘 확립된 접근을 통합합니다: 조직학 분석, 고범위 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석. 부적절한 시료 처리에 의한 소동 적 사건 의 검출에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 우리는 신중한 병리학 검사와 신 생물 세포 농축에 조직을 실시했다. 신생물 병변 및 정상 조직으로부터의 품질 조절 DNA는 409개의 관련 암 유전자의 코딩 영역을 표적으로 하는 높은 커버리지 시퀀싱을 실시하였다. 제한된 게놈 공간만을 보는 동안, 우리의 접근은 주어진 환자에게서 명백한 병변에 있는 체세포 변경 (단 핵약 돌연변이 및 사본 수 변이) 중 이질성의 정도를 평가할 수 있습니다. 시퀀싱 데이터의 비교 분석을 통해 클론 과 하위 클론 변경을 구별할 수 있었습니다. ITH의 대다수는 수시로 승객 돌연변이에 기인합니다; 그러므로, 우리는 또한 돌연변이의 기능적인 결과를 예측하기 위하여 면역성 화학을 이용했습니다. 이 프로토콜은 특정 종양 모형에 적용되는 동안, 우리는 여기에서 기술된 방법론이 그밖 고형 종양 모형에 광범위하게 적용가능하다는 것을 예상합니다.

스터디 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 409개의 암 관련 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 5개의 SPN 케이스의 다중 병변 (n=13) 염기서열 분석은 8개의 유전자에서 총 27개의 체세포 돌연변이를확인하였다(CTNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1및 FGFR3). 돌연변이는 주어진 환자의 모든 병변 사이에서 공유될 때 창립자/클로날로 정의되었고, 주어진 환자의 모든 병변에서 검출될 때 진행자/소클레날(subclonal)으로 정의되었다(그림5A,B). 전반적으로, 코호트에 걸쳐 확인된 점 돌연변이의 대다수는 CTNNB1, KDM6A, TET1 및 FLT1의돌...

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

우리의 프로토콜은 질병 진행에 관련있는 분자 변경의 확인을 통해 1 차및 전이성 병변 사이 유전 관련성의 포착을 허용합니다. 우리의 방법은 높은 감도와 특이성을 가진 임상 견본에 있는 유전 관련성을 탐구하는 기회를 제공합니다. 이것은 분자 및 조직 병리학 분석의 통합 때문입니다.암 연구 분야에서 종양 이질성의 평가는 효과적인 항종양 전략을 설계하는 데 가장 중요하며 우리의 방법은 많은 고형 종양 유형에 광범위하게 적용됩니다. 관심 있는 라이브러리를 준비하고 정량화한 후 각 라이브러리를 뉴클레아제 없는 물에 100피코몰라 농도로 희석하고 각 희석 된 라이브러리의 10 마이크로리터를 결합하여 단일 튜브에서 단일 실행을 합니다. 그런 다음 파이펫팅으로 풀로 풀이 된 라이브러리를 혼합합니다.시퀀싱 실행을 시작하려면 먼저 시퀀싱 시스템에 연결된 컴퓨터에서 토런트 브라우저를 엽니다. 선택한 응용 프로그램에 대한 일반 템플릿을 사용하여 키트 탭에서 이온 양성자 시스템 또는 이온 진 스튜디오 S5 시스템을 선택하여 새 실행을 계획합니다. 칩 유형 드롭다운 메뉴에서 적절한 칩을 선택하고 라이브러리 키트 드롭다운 목록에서 Ion AmpliSeq 2.0 라이브러리 키트를 선택합니다.템플릿 키트에 대한 Ion Chef 버튼을 선택하고 템플릿 키트 드롭다운 목록에서 적절한 Chef 키트를 선택합니다. 시퀀싱 키트 드롭다운 메뉴에서 적절한 시퀀싱 키트를 선택하고 바코드 세트 드롭다운 목록에서 Ion Express를 선택합니다. 플러그인 탭에서 커버리지 분석 플러그인을 선택합니다.계획 탭에서 참조 라이브러리 드롭다운 목록에서 GRCH37HG19 게놈을 선택합니다. 대상 지역 드롭다운 목록에서 시퀀스할 적절한 패널을 선택합니다. 그런 다음 시퀀시할 바코드 수를 설정하고 각 라이브러리에 대한 바코드 이름과 샘플 이름을 설정합니다.풀이 된 라이브러리 희석의 경우, 핵이 없는 물로 스톡 라이브러리를 25 피코몰라 농도로 희석하여 각 희석 된 라이브러리의 이온 양성자 칩 및 파이펫 50 마이크로리터를 적절한 라이브러리 샘플 튜브의 바닥으로 희석하십시오. 풀링된 희석 라이브러리를 포함하는 샘플 튜브를 라이브러리 준비 시스템에 로드하고 복제 증폭을 시작합니다. 차세대 시퀀싱의 경우 화면 의 지침을 따라 계측기를 초기화합니다.복제 증폭이 완료되면 Ion Chef 계기문을 열고 칩 로딩 원심분리기의 뚜껑을 열고 라이브러리 준비 시스템에서 두 개의 칩을

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애를 일으키는 데 노보 변이를 찾기위한 분자 유전 전략.

같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 드 노보 변이를 식별하는 전략

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

여기에서는 고전적인 Hodgkin lymphoma (CHL)의 Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) 세포로부터 고품질, 전체 exome 데이터를 생산하도록 고안된 결합 된 유동 세포 계측법 세포 분류 및 저 입력, 차세대 라이브러리 구성 프로토콜을 설명합니다.

고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

타겟된 다음-세대 시퀀싱 질병 연구 및 임상 진단에서 점점 인기 끌고있다는 시간 및 비용 효율적인 접근 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 시퀀싱에 필요한 복잡 한 워크플로 및 질병을 유전 이체를 식별 하는 데 사용 하는 생물 정보학 과정을 제공 합니다.

다음-세대 시퀀싱과 생물 정보학 파이프라인 헌법 질병의 유전 결정 요인 평가 대상

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

이 문서에서는 마우스에서 학습 공포와 메모리를 평가하기 위해 비디오 분석 시스템을 사용하여 상황과 큐 공포 조건화 시험을위한 프로토콜을 제시한다.

마우스에서 비디오 분석 시스템을 사용하여 콘텐츠 및 시작됨 공포 컨디셔닝 테스트

배우세요 고커버리지 다중 병변 시퀀싱과 면역표현형 분석을 활용한 종양내 이질성 평가 방법입니다. 이 프로토콜은 동일 환자의 원발성 및 전이성 병변에서 클론 및 서브클론 유전자 변이를 식별하여 종양 진화를 이해하고 맞춤형 표적 치료 전략 수립에 활용할 수 있습니다.

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

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