Name: 뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 생체 내 현미경을 이용하여 뮤린 소장의 상피 내 림프구를 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 점막 면역 및 상피 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH R21 AI143892, 뉴저지 건강 재단 보조금, 부시 생물 의학 보조금 (KLE)에 의해 지원됩니다. 우리는 원고를 편집하고 대표 결과에 표시된 데이터를 제공하는 그녀의 도움 마들렌 후 감사합니다.

모든 연구는 Rutgers 뉴저지 의과 대학 비교 의학 자원에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 실험실 동물 관리 (AALAC)-공인 시설의 평가 및 인증의 협회에서 수행되었다.
1. 마우스 준비
참고: 동물 제제 및 수술을 포함한 다음 절차는 수술 전에 30-40 분이 소요되며 현미경을 켜고 동봉 된 인큐베이터를 현미경으로 37 °C로 따뜻하게합니다.
<ol><li>버나드 말리센 (INSERM, 파리, 프랑스)에서 얻은 C57BL/6 배경에 8-10주 된 TcrdEGFP 마우스에 대한 실험을 수행하였다. IACUC 승인 절차에 따르면, 동물의 무게에 따라 케타민 (120 mg/kg)과 자일라진 (10 mg / kg)을 i.p. 주입하여 마우스를 마취시다. 호흡 속도 (분당 55-65 호흡)21,발가락 핀치 및 팔피브랄 반사로 마취 수준을 평가하십시오.</li>
	<li>수술용 평면 마취에 도달하면 테이프를 사용하여 마우스의 뒷다리를 가열 패드에 고정하여 직장 온도계로 모니터링할 수 있는 체온을 유지합니다. 마취가 벗겨지고 있다는 징후가 있는 경우(예: 호흡 속도 증가, 깜박임 및/또는 팔피브랄 반사에 대한 눈 근육 경련 반응), 마우스가 완전히 진정될 때까지 한 번에 50 μL의 케타민/자일라진을 다시 관리하십시오.</li>
	<li>0.9% 식염수의 315 μL로 Hoechst 33342 (10 mg/mL)의 50 μL을 희석시킴으로써 핵 염료를 준비; 최종 농도는 마우스의 무게에 따라 37.5 mg/kg입니다(대략 적인 부피 200 μl). 일단 마우스가 마취되면, 천천히 레트로 궤도 정맥 부비동을 통해 결핵 주사기를 사용하여 Hoechst를 주입. 참고: 마우스가 레트로 궤도 주입 후 순환 볼륨의 변화에 적응할 수 있도록 다음 단계로 진행하기 전에 1-2 분 기다립니다.</li>
	<li>소량의 윤활제를 눈 위에 두어 건조하지 않도록 하십시오.</li>
</ol>2. 마우스 수술 : 장 점막을 노출하는 개복술
<ol><li>피부와 복막을 통해 2cm 수직 절개를 하고 하복부의 중간선을 따라 심상화할 장의 영역을 외부화합니다.</li>
	<li>각진 집게를 사용하여 복강에서 소굴을 조심스럽게 꺼내서 이미지화 할 소장 영역을 식별하십시오. 이 과정에서 반열성 혈관이 찢어지지 않도록주의하십시오. 잠재적인 손상이나 출혈을 최소화하려면 내장을 집게로 잡거나 꼬집지 마십시오.</li>
	<li>최소한의 배설물을 포함하는 화상 진찰을 위한 소장 (2-3 cm)의 적당한 지구를 찾아내세요. 조심스럽게 소양과 남아있는 소장을 복막 강으로 돌려 보내면서 관심 세그먼트를 외부화하십시오. 참고: 이 단계에서 부양에 구멍을 뚫거나 간부성 혈관을 방해하지 마십시오.</li>
	<li>혈관 사이의 기본 장간막의 양쪽에 두 쌍의 집게를 놓고, 집게의 끝을 부드럽게 문질러 막에 구멍을만듭니다 (도 1)22. 이것은 바늘이 장 아래 복강을 닫을 때 장간막을 통과할 수 있게 합니다.</li>
	<li>외부화 장의 루프를 유지하면서 절개를 닫습니다. 각진 집게와 곡선, 5cm 봉합사에 부착 된 테이퍼 포인트 바늘을 사용하여, 복막의 한쪽을 관통, 이전 단계에서 만든 구멍을 통해 이동, 복막 안감의 다른 측면을 통해 위로. 봉합사 하나를 위쪽에 놓고 다른 봉합사 아래쪽에 놓습니다. 참고: 이 단계에서 혈관을 손상시키지 마십시오.</li>
	<li>이 과정을 반복하여 장 루프 아래의 피부를 닫고 절개 중간에 하나의 봉합사를 기본 복막의 이전 봉합사 사이에 놓습니다. 참고: 이미지화할 영역만 외부화하는 것이 중요합니다. 이것은 화상 진찰 도중 불필요한 운동을 감소시킬 것입니다. 장담동맥을 묶지 않도록 하십시오.</li>
	<li>전기 소작을 사용하여 반 장간막 테두리를 따라 천공 선을 만듭니다. 소작 직후, 추가 열 유발 조직 손상을 방지하기 위해 장 표면에 몇 방울의 물을 바르십시오. 잔류 물을 제거하기 위해 킴 와이프와 얼룩.</li>
	<li>Vannas 가위를 사용하여 소작 조직의 말단 가장자리에 작은 수평 슬릿을 자르고 외부 조직 세그먼트의 근위 쪽 (길이 약 1.5 cm)을 향해 소작 된 라인의 길이를 따라 절단하여 점막을 노출시다. 표면. 참고: 필요한 경우 집게를 사용하여 노출된 점막 표면에 남은 과도한 배설물을 부드럽게 제거합니다.</li>
	<li>조직이 탈수되는 것을 방지하기 위해 촉촉한 김스 와이프로 마우스의 복부를 덮으하십시오. 덮인 용기에 있는 현미경에 마우스를 수송하십시오.</li>
</ol>3. 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의한 이미지 수집
<ol><li>HBSS에서 1 μM AlexaFluor 633의 피펫 150 μL을 35mm 접시의 유리 커버미드 바닥에. 열린 점막 표면이 커버슬립에 직접 닿을 수 있도록 마우스를 배치합니다.</li>
	<li>현미경의 머리를 뒤로 기울이고 미리 데운 인큐베이터에서 이미징 단계에 뚜껑을 덮은 접시에 마우스를 놓습니다. 또는, 체온을 유지하기 위해 가열 담요로 마우스를 덮는다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어를 시작합니다. 각 레이저의 여기 강도와 노출 시간은 광표백을 방지하고 시간 지점 사이의 간격을 최소화하기 위해 각각 10-15 mW 또는 120-150 ms를 초과해서는 안됩니다. 프레임 평균을 "2"로 조정하고 EM 게인 기능을 켜서 배경 노이즈를 줄입니다. 픽셀 크기를 올바르게 측정하려면 63x 대물 보정을 선택합니다. 참고: 위에서 자세히 설명한 설정은 초기 참조를 제공하기 위한 것이지만 개별 현미경 구성에 따라 달라집니다.</li>
	<li>405 nm 레이저와 20x 공기 목표를 사용하여, 눈에 띄는 움직임이나 눈에 띄는 표류가 없는 융모의 필드를 찾기 위해 핵을 시각화합니다. 호흡, 연동 또는 심장 박동으로 인한 실제 운동 영역을 피하십시오.</li>
	<li>XY 스캔을 사용하여 관심 분야의 XY 좌표를 기록하고 글리세롤 침지 63배 대물렌즈로 전환합니다.</li>
	<li>405 nm 채널에서 최대 1분 동안 라이브 이미지를 획득하여 선택한 필드의 융모가 안정적인지 확인합니다.</li>
	<li>405 nm 채널에서 라이브 이미지를 획득하는 동안 초점을 조정하여 우루 끝 바로 아래에 있는 직교 평면을 찾습니다. 1.5 μm 단계를 사용하여 약 15-20 μm의 핵을 해결하기 어려울 때까지 융모 끝 상피 바로 아래에서 시작하여 Z 스택을 획득합니다. 참고: 전술한 노출 시간을 이용하여 3개의 채널(405, 488, 640 nm)으로 이미징할 때, 약 20s 간격으로 3개의 채널을 순차적으로 획득할 수 있다.</li>
	<li>수집 시작 후 3-5분 후에 분석 모드에서 소프트웨어를 열어 이미지 안정성 및 γδ IEL 운동성을 확인합니다. 각 분야별로 30~60분 동안 이미지를 계속 획득합니다. 각 마우스에 대해 2-3개의 필드를 기록합니다. 이미징을 하는 동안 5분마다 마우스를 모니터링합니다. 참고: 마취가 마모되기 시작하면 포셉을 사용하여 마우스의 목을 부드럽게 스크러프하여 케타민/자일라진 50 μL을 한 번에 투여합니다. 마취 수준을 계속 모니터링하고 필요한 경우 다시 관리하십시오.</li>
	<li>4시간 이상 마우스를 이미지화하는 것은 권장되지 않습니다. 이미지 수집이 완료되면, 양측 기흉 에 이어 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 희생.</li>
</ol>4. 이미지의 4D 분석
<ol><li>이미징 파일을 4D 렌더링 소프트웨어로 직접 가져옵니다.</li>
	<li>IeLs 및 루멘에 대한 개별 표면을 만든 다음 표 1에 설명된 매개 변수를 초기 참조로 사용하여 시간이 지남에 따라 표면을 추적합니다. IELs의 경우 표시된 시드 점 지름을 사용하여 분할 터치 오브젝트를 사용하도록 설정합니다.</li>
	<li>자동 회귀 추적 알고리즘을 사용하여 IEL 운동성을 결정합니다. 추적 알고리즘은 비교적 정확하지만 각 IEL의 트랙을 시각적으로 검사하는 것이 필수적입니다. 트랙이 올바르지 않으면 트랙 편집 탭에서 연결 해제 및 연결 기능을 사용하여 수정합니다. </li>
	<li>각 IEL에서 루멘까지의 거리를 확인하려면 루멘 표면을 선택하고 도구 메뉴에서 거리 변환 기능을 수행합니다. 메시지가 표시되면 외부 서피스를선택합니다. 거리 변환이 계산되면 4번째 채널로 표시됩니다.</li>
	<li>4채널의 강도 분음을 필터링하여 측면 세포간 공간(LIS) 내에 있는 γδ ILs를 선택합니다. 이 값은 열 상피 세포의 높이에 따라 15 μm에 가까워야합니다. 이 범위 내의 총 γδ IeLs의 백분율은 LIS에서 γδ IeLs의 주파수로서 보고된다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 IEL 트랙 속도, 트랙 변위, 트랙 직진 및 트랙 길이를 포함한 통계 데이터를 내보냅니다. 또는 Vantage 모듈을 사용하여 데이터를 분석합니다. 실험에 따라 LIS 또는 IEL/상피 상호 작용 내의 거주 시간을 포함하여 수집된 데이터에서 추가 메트릭을 가져옵니다.</li>
</ol>

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<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li>
<li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li>
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<li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

사내 현미경 기술의 발달은 세포 내 구조의 재구성을 관찰 할수있는 전례없는 기회를 제공했다 8,9,22,세포 - 세포 상호 작용12, 25 및 세포 이동 거동13,14,15,16,26 그렇지 않으면 접근할 수 없는 조직에서. 생체 내 18,27에서γδ IELs의 조절...

상피 내 림프구(IEL)는 장 상피 내에 위치하며, 지하막을 따라 그리고 세포간 공간 내의 인접 한 상피 세포 사이에모두 발견된다 1. 5-10개의 상피 세포마다 약 1개의 IEL이 있습니다. 이러한 ILS는 장 상피 장벽2의 큰 창공의 면역 감시를 제공하는 센티넬역할을 한다. γδ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 ILs는 뮤린 소장에서 총 IEL 집단의 최대 60%를 포함한다. γδ T 세포 결핍 마우스에 대한 연구는 장 손상, 염증 및 감염에 대한 응답으로이들 세포의 크게 보호 역할을 입증 3,4,5. Tcrd 녹아웃 마우스 6의생성에도 불구하고, γδ IEL 생물학에 대한 우리의 이해는 γδ TCR에 의해 인식된 리간드가 아직 확인되지 않았다는 사실로 인해 부분적으로 제한적으로 남아 있다7. 그 결과, 이러한 세포 집단을 연구하는 도구의 부족으로 인해 생리적 및 병리학적 조건 하에서 γδ TCR 활성화 및 기능의 역할을 조사하기가 어려워졌다. 이러한 격차를 해소하기 위해, 우리는 γδ IEL 기능및 생체 내 외부 자극에 대한 반응성에 대한 추가적인 통찰력을 제공하는 수단으로 γδ IEL 철새 행동과 이웃 장세포와의 상호 작용을 시각화하는 라이브 이미징 기술을 개발했습니다.
지난 10 년 동안, intravital 화상 진찰은 상피 세포 흘리기 8, 상피 장벽 기능 의조절을 포함하여 장 생물학의 다중 양상에 관련되었던 분자 사건의 우리의 이해를 현저하게 확장했습니다9 ,10,발광 내용의 골수성 세포 샘플링11,12,및 숙주 미생물 상호 작용11,13,14,15,16 . IEL 생물학의 맥락에서, 내활력 현미경 검사법의 사용은 IEL 운동성의 시공간역학 및 감시 행동을 중재하는 요인에 빛을 비추었습니다13,14,15, 16. 핵 GFP 발현17에의해 γδ IeLs를 표시하는 TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) 기자 마우스의 개발은 γδ ILs가 상피 내 의 높은 운동성이며 미생물에 반응하는 독특한 감시 행동을 나타낸다는 것을 밝혔습니다. 감염17,13,14. 최근에는, 또 다른 γδ T 세포 리포터 마우스가 전체 세포(18)의 시각화를 허용하도록 세포질에서GFP를 발현하는 (Tcrd-GDL)이 개발되었다. 유사한 방법론은 IEL 운동성19,20의역학에 G 단백질 결합 수용체(GPCR)-18 및 -55와 같은 특정 케모카인 수용체의 요구사항을 조사하기 위해 사용되어 왔다. 세포 특이적 리포터가 없는 경우, CD8α에 대한 형광 공액 항체를 생체내IEL 운동성을 시각화하고 추적하는 데 사용되었으며,20. 2광자 레이저 스캐닝 현미경은 일반적으로 intravital 화상 진찰을 위해 사용되지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경의 사용은 최소한의 배경 잡음으로 고속 및 고해상도 멀티 채널 이미지를 캡처하는 독특한 장점을 제공합니다. 이 기술은 장 점막의 복잡한 미세 환경 내에서 면역 / 상피 상호 작용의 시공간 역학을 해명하는 데 이상적입니다. 더욱이, 다양한 형질전환 및/또는 녹아웃 마우스 모델의 사용을 통해, 이러한 연구는 장 내 면역 및/또는 상피 세포 기능의 분자 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>35mm 접시, No. 1.5 Coverslip</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 피하 주사 바늘 - 27G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>BD 슬립 팁 멸균 주사기 - 1mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD 투베르쿨린 주사기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>전기 소작</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>밀폐형 배양 챔버</td><td>OKOLAB</td><td></td><td>현미경</td></tr><tr><td>눈 바늘, 크기 #3; 1/2 원, 테이퍼 포인트, 12mm 현 길이</td><td>Roboz</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 균형 잡힌 소금 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (v. 9.2.1) 시작, 트랙, XT 모듈</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Inverted DMi8</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>IQ3 (v. 3.6.3)</td><td>Andor</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td></td><td>Ketamine Putney</td><td></td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 가위 3 " (7.5 cm) 긴 5 x 0.15mm 스트레이트 샤프</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>비흡수성 수술용 봉합사, 실크 스풀, 블랙 브레이디드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>뉴젠트 집게 4.25" (11cm) 긴 각진 부드러운 1.2mm 팁</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 연고</td><td>Dechra</td><td></td><td>윤활 눈 연고</td></tr><tr><td>회전 디스크 Yokogawa CSU-W1 63x 1.3 NA HC PLAN APO 글리세롤 침지 대물렌즈, iXon Life 888 EMCCD 카메라, 405nm 다이오드 레이저, 488nm DPSS 레이저, 640nm 다이오드 레이저</td><td>Andor</td><td></td><td>Confocal system</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td></td><td>Anesthesia</td></tr></tbody></table>

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

γδ T 세포 수용체 (γδ IEL)를 발현하는 상피 내 림프구는 장 상피의 면역 감시에 중요한 역할을한다. γδ T 세포 수용체에 대한 확실한 리간드의 부족으로 인해, γδ IEL 활성화및 생체 내의 이들의 기능의 조절에 대한 우리의 이해는 제한적이다. 이것은 γδ IEL 기능 및 국부적인 미세 환경에 대한 이 세포의 반응성에 관여하는 신호 통로를 심문하는 대체 전략의 개발을 필요로 합니다. γδ IELs는 병원체 전좌를 제한하기 위하여 넓게 이해되더라도, intravital 화상 진찰의 사용은 안정상태에서 및 침략적인 병원체에 응하여 IEL/상피 상호 작용의 좌측 시간 역학을 이해하는 것이 중요했습니다. 본 명세서에서, 우리는 역회전 디스크 공초점 레이저 현미경을 사용하여 GFP γδ T 세포 리포터 마우스의 소장 점막에서 IEL 철새 거동을 시공하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 접근법의 최대 이미징 깊이는 2광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법의 사용에 비해 제한적이지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경 은 광표백을 감소시키고 고속 이미지 수집의 이점을 제공합니다. 사진 손상. 4D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 T 세포 감시 동작과 이웃 세포와의 상호 작용을 실험 조작 후 분석하여 장 점막 내IEL 활성화 및 기능에 대한 추가 적인 통찰력을 제공합니다.

TcrdEGFP 리포터 마우스의 intravital 화상 진찰을 사용하여, 우리는 이전에 γδ IELs가 지하 막을 따라 그리고 측면 세포 간 공간 (LIS)로 이동하여 상피를 순찰하는 동적 감시 행동을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 상태(그림2,동영상 1)를 참조하십시오. 
이 접근법은 또한 특정 세포 신호화 경로 및/또는 수용체의 억제가 γδ IEL 철새 거동에 미치는 영향을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인터류킨(IL)-15는 γδ IEL 항상성23,24에필수적인 흉막사이토카인이다. IL-2Rβ 수용체를 통한 IL-15 신호가 안정상태에서 γδ IEL 운동성의 역학에 기여하는지 여부를 확인하기 위해, TcrdEGFP 리포터 마우스는 항-IL-2Rβ 항체(TM-β1) 또는 이소...

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

소장 점막의 인트라바이탈 현미경 검사는 다른 면역 세포 유형 사이의 상피 내에서 세포 상호 작용의 현물 역학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, 또는이 두 구획 사이. 이 기술의 주요 장점은 장 점막 내에서 실시간으로 고속 및 고해상도 이미지를 획득 할 수 있다는 것입니다. 장의 라이브 이미징은 세포 상호 작용, 또는 점막 면역, 상피 생물학 또는 암 생물학에 관여하는 세포 신호에 대한 추가 통찰력을 제공 할 수 있습니다.이것은 수술 기술의 연습뿐만 아니라 이미지 수집을위한 마우스의 인내및 최적의 위치 가필요한 도전적인 방법입니다. 마취형 형질성 마우스에 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP, 감마 델타 T 세포 수용체를 표현한 후, 새로 준비된 Hoechst 33342 염료 용액200마이크로리터를 천천히 주입하기 위해 결핵 주사기를 사용합니다. 주사 후 1~2분 후에 동물의 눈에 연고를 발라 건조를 방지합니다.그런 다음, 피부와 복막을 통해 2CM 수직 절개를 하고, 하복부의 중간선을 따라 각진 집게를 사용하여 복막 구멍에서 케이쿰을 조심스럽게 끌어냅니다. 최소한의 배설물을 함유한 소장의 2-3CM 영역을 식별하고, 장간 혈관을 찢지 않도록 주의하고, 자궁과 소장을 복막 구멍으로 조심스럽게 반환하여 관심 의 세그먼트를 외부화시켰다. 혈관 사이의 밑줄 막질의 양쪽에 두 쌍의 집게를 놓고 집게 끝을 부드럽게 문지르면 막에 구멍을 만듭니다.각진 집게와 5CM 봉합사에 부착된 곡선 테이퍼 포인트 바늘을 사용하여, 멤브레인의 구멍을 통해 회막의 한쪽을 관통하고, 하중 안대기의 반대편을 통해 위로 침투하고, 한 봉합사를 상단에 배치하고, 다른 하나는 절개 하부 근처에 배치하여 절개 의 루프를 유지하면서 외부화하였다. 성공가능성을 높이기 위해 복부 봉합사를 배치하면서 혈관을 묶거나 찢어버리지 말고 장의 불필요한 취급을 제한하십시오. 그런 다음, 같은 방식으로 장 루프 아래 의 피부를 닫고, 밑줄 복막에서 이전 봉합사 사이의 절개 중간에 하나의 봉합사를 배치합니다.전기 카우테리를 사용하여, 시간 발생 경계를 따라 천공의 라인을 확인하고 즉시 추가 열 유도 조직 손상을 방지하기 위해 장의 표면에 물 몇 방울을 적용합니다. 잔류물을 제거하기 위해 김스 와이프와 블롯. 바나 가위를 사용하여 소작 된 조직의 탈면 가장자리에서 약 1.5CM 수평 슬릿을 잘라 내고, 소작 라인의 길이를 따라 외부 조직 세그먼트의 근접 단부를 향해 절단하십시오.점막 표면이 노출되면, 습한 김와이프로 복부를 덮어 조직을 수분을 유지합니다. 회전 디스크 공초점 현미경 이미징의 경우, 덮여 혈관의 현미경으로 마우스를 수송. 이미징 소프트웨어를 실행하고 현미경의 머리를 다시 기울이고 1 마이크로 몰라 벼룩 알렉사 플루어 염료와 행크의 버퍼링 식염수 용액150 마이크로 리터를 유리 커버의 미끄러진 바닥에 추가합니다.열린 점막 표면이 커버슬립에 직접 닿을 수 있도록 마우스를 배치합니다. 미리 데워진 인큐베이터에 마우스와 접시를 이미징 단계에 놓습니다. 각 레이저의 흥분 강도 및 노출 시간을 각각 10-15 밀리와트 및 120-150 밀리초 이하로 설정하고 프레임 평균을 2로 조정합니다.전자곱게인 함수를 켜면 배경 노이즈를 줄이고 63X 목표 교정을 선택하여 픽셀 크기를 올바르게 측정합니다. 405 나노미터 레이저와 20X 공기 목표를 사용하여 핵을 수동으로 시각화하여 눈에 띄는 움직임이나 표류가 부족한 사악한 필드를 찾아 호흡, 연반 또는 심장 박동으로 인한 관절 운동 영역을 피합니다. X-Y 스캔을 사용하여 관심 분야의 X-Y 좌표를 기록하고 글리세롤 침지 63X 목표로 전환합니다.405나노미터 채널에서 최대 1분간 라이브 이미지를 획득하여 선택한 필드의 빌리가 안정되어 있는지 확인하고, 초점을 조정하여 villus 팁 바로 아래에 직교 평면을 찾습니다. 그런 다음 1.5 마이크로미터 단계를 사용하여 핵을 해결하기 어려울 때까지 약 15-20 마이크로미터에서 빌루스까지 약 15-20 마이크로미터에서 시작하여 z-스택을 획득합니다. 인수를 시작한 후 3-5분 후, 이미지 안정성과 감마 델타 내피성 세포 운동성을 확인하고, 각 빌드 필드에 대해 30-60분 동안 이미지를 계속 수집합니다.감마 델타 내 림프구는 동적 감시 행동을 나타내며, 지하 막을 따라 연구 상태에서 측면 세포 간 공간으로 이동하여 상피를 순찰합니다. 이러한 대표적인 이미지에서, 컬러 트랙은 30분 동안 개별 감마 델타 내 림프구의 철새 경로를 나타냅니다. 측측 세포간 공간에서 의 상피 림프구의 빈도가 항-인터류키-2 수용체 베타 항체로 처리된 마우스에서 증가되었지만, 이러한 감마 델타 내성 림프구의 30% 이상이 공회전 동작을 나타냈다.이러한 공회전 표현형은 감마델타 내상피성 림프구의 즉각적인 속도와 감금 비율 모두에서 현저한 감소에 의해 확인되었다. 또한, 유휴 감마 델타 내 림프구는 더 오래 거주했고, 모틸감마 델타 내 림프구에 비해 측면 세포 간 공간 내에서 더 자주 국한되었다. 연동으로 인해 과도한 움직임이 부족한 사악한 분야를 식별하기 어려울 수 있습니다.마우스 위치를 재배치하면 보다 안정적인 필드를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 셀 트래킹 데이터의 추가 분석은 특정 운동성 동작을 식별하거나 세포 상호 작용을 측정하기 위한 추가 메트릭을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. IEL-motility의 인트라바이탈 이미징 및 분석은 타고난 면역 신호가 감마 델타 IEL 기능을 어떻게 조절하는지에 대한 통찰력을 제공하는 IEL 기능의 표준 판독이 되었습니다.

intravital-imaging-intraepithelial-lymphocytes-murine-small

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

사타구니 림프절 (LN)의 intravital 현미경을 수행하기위한 기법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 실시간으로...

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

2 - 광자 현미경의 최근 발전은 실시간으로...

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

이 비디오는 컨포칼 현미경을 사용하여 형질전환 마우스에서 γδ 상피내 림프구(IEL)를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 수술 절차에는 천공 라인을 만들고 장 점막과 융모를 노출시키기 위해 세로로 절개하는 것이 포함됩니다. 형질전환 마우스는 γδ IEL에서만 리포터 단백질을 발현하여 추적을 가능하게 합니다. Intravital 이미징은 장 상피 세포의 기저막을 따라 녹색 형광 표지된 γδ IEL의 동적 움직임을 캡처합니다.

Gamma Delta 상피내 림프구의 생체 내 시각화

형질전환 리포터 마우스와 주사 가능한 형광 라벨을 사용함으로써, 장기 생체 내 회전 디스크 컨포칼 현미경 검사는 ApcMin/+ 대장암 모델에서 장 선종에 대한 골수성 세포 거동을 직접 시각화할 수 있습니다.

골수 세포 역학의 실시간 영상 APC 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

여기서는 서로 다른 마우스 조직 내에서 IL-22 생성 세포를 시각화하기 위한 형질전환 리포터 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스에서 다른 사이토카인 또는 비서 단백질의 위치를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

여기에서는 레이저로 인한 상처 시 장의 이미지를 얻는 방법을 제시합니다. 마우스 장을 다광자 레이저에 노출시킴으로써, 단일 또는 다중 crypt(들)의 손실이 국소적으로 유도된다. 수개월에 걸쳐 손상된 부위를 반복적으로 이미징하여 장 회복의 실시간 역학을 캡처합니다.

장 리모델링을 연구하기 위한 레이저 절제 및 생체 내 현미경 검사

배우세요 생체 내 현미경을 이용하여 뮤린 소장의 상피 내 림프구를 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 점막 면역 및 상피 생물학 연구에 활용됩니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

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