Name: RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 항체 무첨가 분석법으로 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 정량적·정성적으로 평가하는 방법을 익히세요. 삼중수소 표지 S-아데노실메티오닌을 이용하여 안전하고 신뢰성 높은 메틸화 분석이 가능합니다.

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저자는 ChemDraw에 대한 그의 도움에 대한 박사 투르자 칸티 데브나스 에게 감사드립니다. Xhemalçe 실험실에서 연구는 국방부에 의해 지원됩니다 - 의회 지시 의료 연구 프로그램 - 유방암 획기적인 상 (W81XWH-16-1-0352), NIH 그랜트 R01 GM127802 및 셀룰러 연구소의 시작 자금 분자 생물학 및 오스틴, 미국 텍사스 대학에서 자연 과학 대학.

1. 대상 RNA의 생체 외 전사 및 젤 정제
<ol><li>확립된 분자 복제 기술12 또는 키트를 사용하여 T7 및/또는 SP6 프로모터를 함유하는 플라스미드로 관심 의 순서를 복제합니다.</li>
	<li>시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿 선형화
	<ol>
<li>앞서 설명한바와같이, 삽입을 통해 T7 프로모터 영역을 포함하도록 설계된 프라이머를 사용하여 플라스미드의 PCR에 의한 관심의 서열을 증폭, +20-30 bp 업스트림 및 다운스트림.</li>
		<li>대안적으로, RE의 공급자가 제공한 지침에 따라 인서트를 하류로 사용할 수 있는 제한 효소(RE) 컷 사이트를 사용하여 플라스미드의 5 μg를 소화한다. 참고: 선택한 RE에 의해 인서트가 절단되지 않는지 다시 확인하십시오. 이 단계에서 사용되는 RE의 선택은 전사체의 수율에 극적으로 영향을 미칠 수 있다. 우선, 반대 DNA 가닥(14)에 T7 RNA 폴리머라제의 템플릿 스위칭을 피하기 위해무딘 또는 5'-돌출된 말단 생산 RE로 선형화한다. 초기 수율이 충분하지 않은 경우 다른 RE를 시도하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA 아가로즈 겔 추출 및 정화용 키트를 사용하여 생성된 DNA를 정화한다. 30 μL의 물로 DNA를 용해시다.</li>
	<li>소용돌이, 파이펫 1.5 μL로 잘 혼합하고 마이크로 볼륨 분광광도계로 DNA 농도를 측정합니다.</li>
	<li>250 ng의 DNA를 사용하여 1% 아가로즈 겔 전기영동에 대해 정제된 DNA의 품질과 크기를 4V/cm에서 1시간 동안 이동한 1x TBE 완충액에서 확인합니다.</li>
	<li>시험관 내 전사 키트의 냉동 시약을 해동합니다. T7 RNA 폴리머라제 믹스를 얼음 위에 놓고 다른 시약을 실온의 영양분위에 놓습니다. 해동이 완료된 직후, rNTP 튜브를 5s로 빠르게 회전하여 튜브 바닥에 용액을 수집하고 얼음 위에 놓습니다. 강수량을 피하기 위해 10x 반응 버퍼를 실온에서 유지하십시오.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 피펫은 표시된 순서로 실온에서 20 μL 전사 반응의 다음 구성 요소: 물 6 μL, 선형 DNA 템플릿의 2 μL (0.1 - 1 μg), 75 mM ATP 솔루션의 2 μL, 75 mM GTP 용액의 2 μL , 75 mM CTP 용액의 2 μL, 75 mM UTP 용액의 2 μL, 10x 반응 완충제의 2 μL 및 T7 RNA 폴리머라제 믹스의 2 μL. 참고 : PCR에 의해 생성 된 DNA 템플릿의 경우 100 - 200 ng DNA를 사용하십시오. 플라스미드의 제한 효소 다이제스트에 의해 생성된 DNA 템플릿의 경우,~1 μg. 활성 재조합 그의 6-태그가 있는 T7 RNA 폴리머라제는 대장균15에서정제될 수 있다.</li>
	<li>튜브를 완전히 섞는다. 5s에 대한 빠른 스핀은 튜브의 바닥에 반응 용액을 수집한 다음 2-4 시간 동안 37 °C에서 배양합니다. 참고 : 모든 전사체는 DNA 템플릿, 길이, 서열 또는 구조에 따라 다르게 행동합니다. 최대 6 시간까지 다른 배양 시간을 테스트하여 시험관 내 전사 조건을 최적화; DNA 템플릿, T7 RNA 폴리머라제, 또는 NTP의 상이한 농도; 또는 T7 RNA 폴리머라제 혼합물에 존재하는 것에 보충 MgCl 2를 첨가한다.</li>
	<li>잠복기의 끝에서, 20 μL 반응 당 1 μL의 DNase I를 추가하고 15 분 동안 37 °C에서 배양한다. 참고 : 전사 반응은 폴리 아크릴아미드 젤이 준비 될 때까지 얼음에 일시적으로 보관 될 수 있습니다.</li>
	<li>폴리아크릴아미드 겔로 정제를 진행합니다. 참고: RNA는 pH 및 RNase 오염에 민감하기 때문에 RNA 전용 장비와 RNase 가없는 시약을 사용하십시오.</li>
	<li>관심있는 전사체의 크기에 따라 겔에 대한 폴리 아크릴아미드의 비율을 결정 : 100-2000 nt에 대한 3.5 %(XC : 460 nt; BB: 100 nt), 80-500 nt에 대한 5 % (XC : 260 nt; BB: 65 nt), 60-400 nt에 대한 8 % (XC : 160 nt; BB: 45 nt), 40-200 nt에 대한 12 % (XC : 70 nt; BB: 20 nt), 25-150 nt에 대한 15 % (XC : 60 nt; BB: 15 nt, 및 6-100 nt에 대한 20% (XC: 45 nt; BB: 12 nt).</li>
	<li>50 mL 원추형 튜브에 다음 시약을 결합하여 우레아 변성 폴리아크릴아미드 겔을 준비: 분자 등급 요소 9.6 g, 10x TBE의 2 mL, 40% 아크릴아미드의 x mL:비스-아크릴아미드 믹스(29:1) 및 튜브에 20 mL 마크까지 물 , 여기서 x = 20 mL / (40 % / 젤 비율 %). 주의: 폴리아크릴아미드 젤에는 종종 환경에 도입될 때 위험을 초래할 수 있는 독성 물질인 중합되지 않은 아크릴아미드를 함유하고 있습니다. 기관의 화학 폐기물 프로그램을 통해 폴리아크릴아미드 젤을 폐기하십시오.</li>
	<li>30% 전원으로 15s용 전자레인지. 실온에서 또는 우레아가 완전히 녹을 때까지 10분 동안 영양분에 놓습니다.</li>
	<li>겔 혼합물이 회전하는 동안, 겔 카세트(18-well, 1 mm 두께, 13.3 x 8.7 cm(W x L))를 회수하고, 빗을 제거하고 겔 주조를 위해 카세트를 배치한다.</li>
	<li>5s에 대한 50 mL 튜브를 빠르게 회전하여 튜브 의 바닥에 젤 용액을 수집합니다. 10% 황산암모늄 용액(APS)의 125 μL을 첨가하십시오. 영양을 1분 동안 영양에 놓습니다.</li>
	<li>테트라메틸레틸렌디아민 25μl(TEMED)을 넣고 거품을 피하는 25mL 파이펫으로 5회 위아래로 파이펫팅하여 조심스럽게 섞습니다.</li>
	<li>피펫을 젤 캐스트에 넣고 거품을 피하면서 젤 빗을 조심스럽게 삽입합니다.</li>
	<li>카세트 상단에 큰 바인더 클립을 추가하여 씰을 조입니다.</li>
	<li>겔이 1시간 동안 중합되도록 합니다.</li>
	<li>젤이 굳어지면 바인더 클립을 제거합니다. 전기 동공 상자에 카세트를 삽입합니다. 상단 및 하단 저장소에 1x TBE 버퍼를 추가합니다.</li>
	<li>전사 반응을 검색합니다. 물을 최대 100 μL까지 추가한 다음 2x 젤 로딩 버퍼의 100 μL을 추가합니다. 권장량을 물과 10 μL 및 10 μL의 2x 겔 로딩 버퍼를 별도의 1.5 mL 튜브에 혼합하여 사다리를 준비한다.</li>
	<li>사다리와 시험관내 전사 반응을 70°C에서 15분 동안 열믹서에 인큐베이션한다.</li>
	<li>시료가 70°C에서 변성하는 동안 빗을 조심스럽게 제거하고, P1000 파이펫으로 각 우물을 위아래로 파이펫팅하여 우물을 청소하고, 100V에서 10분 동안 즉시 사전 실행합니다.</li>
	<li>시료가 70°C에서 15분 변기를 완료하면 써모믹서에서 튜브를 제거하고 즉시 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>P1000 파이펫으로 젤의 각 웰을 다시 청소합니다. 사다리의 20 μL을 왼쪽에 첫 번째 우물에, 10 개의 별도 웰에 RNA 샘플의 20 μL, 미사용 우물에 1x 젤 로딩 버퍼의 20 μL을 로드합니다.</li>
	<li>젤의 % 폴리아크릴아미드에 따라 60-240 분 동안 100V에서 젤을 실행합니다. 참고: 젤 로딩 버퍼의 염료는 젤을 통과할 때 두 개의 밴드, 느린 이동 브로모페놀 블루(BB) 블루 밴드, 그리고 빠르게 이동하는 자일렌 시안(XC) 시안 밴드로 분리됩니다. 상이한 % 폴리아크릴아미드 겔에서 이들 밴드의 대략적인 이동은 공지되어 있으며(단계 1.11 참조) 겔에서 RNA의 이동을 추정하는데 사용될 수 있다.</li>
	<li>젤이 멈추면 카세트에서 젤을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>50 μL의 핵산 겔 얼룩을 가진 1x TBE 완충액의 50 mL의 용액을 포함하는 깨끗한 상자에 젤을 놓고 RNA를 염색하기 위하여 로커에 5 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>겔 이미징 시스템에서 겔의 전후 밴드 절제 사진을 촬영, 바람직하게는 UV transillumation 대신 청색광을 사용하여.</li>
	<li>뉴클레아제 프리 일회용 젤 절단 팁을 사용하여 관심 있는 각 밴드를 절제합니다. 각각잘 후, 겔 슬라이스를 함유하는 팁을 1.5 mL 튜브로 옮기고 젤 슬라이스를 모으기 위해 잠시 스핀한다. 모든 밴드가 동일한 1.5 mL 튜브에서 수집될 때까지 반복합니다.</li>
	<li>모든 젤 슬라이스가 수집되면, 1.5 mL 튜브에 100 μL의 뉴클레아제 없는 물 또는 TE 버퍼를 추가합니다. ~48시간 동안 4°C에서 보관하십시오. 이것은 RNA가 용액으로 젤 조각을 종료하는 것을 허용합니다.</li>
	<li>48시간 후, 물 또는 TE 버퍼를 신선한 1.5 mL 튜브로 피펫처리한다. 나머지 젤 슬라이스를 폐기합니다. 다음과 같이 클린업 키트를 통해 RNA를 정화한다.<ol>
<li>실온에서 스핀 컬럼을 30분 이상 평형화합니다.</li>
		<li>1.32단계에서 새로운 1.5 mL 튜브에서 RNA 용액의 100 μL에, 350 μL의 RLT 버퍼를 첨가하고 영양분에 2분 동안 잘 섞는다. 튜브 의 하단에 용액을 수집하기 위해 200 x g에서 1 s를 회전합니다.</li>
		<li>100% EtOH의 675 μL을 넣고 영양분에 2분 동안 잘 섞으세요. 200 x g에서 1 s를 스핀하고 즉시 다음 단계로 진행하십시오.</li>
		<li>혼합물의 565 μL을 스핀 컬럼에 옮기고 15,000 x g에서 1 분 동안 회전합니다. 포부로 수집 튜브를 비웁습니다.</li>
		<li>샘플의 두 번째 절반으로 이전 단계를 반복합니다.</li>
		<li>RPE 버퍼 500 μL을 컬럼에 추가하고 15,000 x g에서 1분 동안 회전합니다. 포부로 수집 튜브를 비웁습니다.</li>
		<li>열에 750 μL의 80 % 에탄올을 추가하고 15,000 x g에서 1 분 동안 돌루습니다. 포부로 수집 튜브를 비웁습니다.</li>
		<li>뚜껑이 열린 새 2mL 컬렉션 튜브에 컬럼을 놓고 5분 동안 15,000 x g으로 회전합니다.</li>
		<li>컬럼을 새 1.5mL 튜브로 옮김.</li>
		<li>기둥 중앙에 17 μL의 물을 넣고 1분 동안 15,000 x g으로 돌리면 용해됩니다. 또 다른 17 μL의 물을 사용하여 다시 용신하십시오. 회수된 총 부피는 32 μL이어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>소용돌이, 파이펫 1.5 μL에 의해 잘 혼합하고 마이크로 볼륨 분광광도계를 사용하여 RNA의 농도를 측정합니다.</li>
	<li>단계 1.11-1.29에서와 같이 우레아 변성 폴리아크릴아미드 겔에 의한 RNA 정제의 품질을 확인한다.</li>
</ol>2. 체외 RNA 메틸 트랜스퍼라제 분석
<ol><li>100 μL RNA 메틸 트랜스퍼래아제 분석제를 얼음 위에 1.5 mL 튜브에 설정: 물 23 μL, 10 μL 의 10 x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl), 0.05 M EDTA의 2 μL, 100 mMMMM의 5 μL , 40 μL 의 50 % 글리세롤, 4 μL 의 58 μM 3H-SAM, 5 20 x 프로테아제 억제제 칵테일의 5 μL, RNaseOUT 의 1 μL (선택 사항), RNA 5 μL 및 메틸 트랜스 페트리파아제 5 μL. 주의: 방사성 삼각물질은 위험하며 장갑, 실험실 코트 및 기타 필요한 PPE를 착용한 상태에서만 취급해야 합니다. 방사성 물질과 접촉하는 모든 파이펫 팁과 튜브는 고체 방사성 폐기물로 간주됩니다. 실험실의 승인된 방사성 폐기물 프로토콜에 따라 모든 고체 및 액체 방사성 폐기물을 폐기합니다. 참고: 메틸 트랜스퍼라제없이 RNA없이 대조군 샘플을 포함시다. 시약 농도는 MgCl2 또는 라벨이 지정되지 않은 SAM과 같은 이가 성 양이온 염의 최적화 및/또는 포함이 필요할 수 있습니다. 최종 RNA 농도의 최적 범위는 50 nM에서 1 μM이며 메틸 트랜스퍼 라제 농도는 25 nM에서 300 nM입니다.</li>
	<li>튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 서 완전히 섞으세요. 튜브의 하단에 용액을 수집하기 위해 200 x g에서 5 s를 돌루십시오. 튜브를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>1.32단계에서와 같이 컬럼 정제를 사용하여 반응을 정리한다. 주의: 특히 컬럼 세차(수거 튜브에서 폐기물을 흡입하는 대신 파이펫 아웃)하는 동안 방사성 물질을 적절히 폐기할 때 매우 주의하십시오.</li>
	<li>액체 침전 카운트 수행<ol>
<li>샘플당 유리병 1개, 배경 측정용 바이알 1개, 스와이프 테스트를 위한 바이알 1개로 별미 계산 랙을 설정합니다. 5 mL의 진미 계수 용액으로 바이알을 채웁니다.</li>
		<li>용출된 방사성 RNA 샘플 10 μL을 1바이알에 넣고 뚜껑을 조이고 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>스 와이프 테스트 바이알을 준비합니다. 프로토콜 중에 사용되는 모든 표면과 장비에 면봉을 철저히 문지릅니다. 5 mL의 진미 용액이 채워진 바이알에 면봉을 넣고 뚜껑을 조입니다.</li>
		<li>다음과 같이 반짝이 카운터에서 샘플을 실행합니다. 카운터 후드를 열고 랙을 기기에 삽입하고 후드를 닫습니다. 단일 랙 수를 선택합니다. 사용자 프로그램 선택 선택을 선택합니다. 선택 하거나 60 s. 히트 카운트 랙에 대 한 삼중수소 (3 H)를 측정 하는 프로그램을 만듭니다. 세 번 번 번 번의 반짝이 계산을 반복합니다. 참고: 장비는 각 샘플의 번화 수를 측정하고 화면과 인쇄물 모두에 출력합니다. 원하는 경우 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 2.3단계에서 남은 RNA 샘플은 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 동결되어야 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>자동 라디오그램 진행<ol>
<li>단계 1.11-1.20에서와 같이 우레아 분해 폴리아크릴아미드 겔을 준비하고 미리 실행한다.</li>
		<li>방사성 RNA 물질의 피펫 20 μL을 2x 겔 로딩 버퍼의 20 μL을 함유하는 새로운 1.5 mL 튜브로. 잘 섞으세요. 1.21단계에서와 같이 사다리를 준비한다. 샘플을 70°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>시료 로딩 직전에 젤의 우물을 한 번 더 씻으시고 드시면 됩니다. 준비된 사다리의 20 μL, 시료의 20 μL, 나머지 차선에 1x 젤 로딩 버퍼의 20 μL을 적재하십시오. 폴리아크릴아미드 백분율에 따라 60-180분 동안 100V에서 젤을 실행합니다.</li>
		<li>겔이 실행이 끝나면 카세트에서 젤을 제거하고 50 mL의 1x TBE 버퍼를 함유 한 상자에 5 μL의 초감응성 핵산 젤 얼룩을 담았습니다.</li>
		<li>RNA를 얼룩지게 하기 위해 로커에 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>조심스럽게 상자에서 젤을 꺼내 우물과 왼쪽에있는 사다리가있는 젤 이미징 시스템의 UV 트랜스 딜루미에이터에 놓습니다.</li>
		<li>젤에 카메라를 초점을 맞추고 UV 광선을 켜고 신호 강도에 따라 50ms에서 1s까지 노출하여 젤의 이미지를 찍습니다.</li>
		<li>UV 노출을 끄고 이미지를 Tiff 파일로 저장합니다.</li>
		<li>젤을 다시 상자에 넣습니다. TBE를 제거합니다. 로커에서 실온에서 30 분 동안 50 mL의 고정 용액 (50 % 메탄올, 10 % 아세트산, 40 % 초순수)으로 젤을 고정하십시오.</li>
		<li>젤을 다시 25mL의 자가 방사선 증강 용액이 들어 있는 신선한 블랙 박스로 부드럽게 옮김. 블랙 박스가없는 경우, 빛으로부터 용액을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 상자를 덮습니다.</li>
		<li>로커의 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>젤을 살짝 들어 올려 우물과 오른쪽 사다리가 있는 플라스틱 랩 시트에 얼굴을 아래로 향하게 놓습니다. 젤 뒷면에 크로마토그래피 용지 2장을 놓습니다. 전체 스택을 부드럽게 뒤집습니다.</li>
		<li>젤 건조기를 80°C로 예열합니다. 젤 건조기의 플라스틱 커버를 뒤로 이동합니다. 플라스틱 커버 아래에 랩, 젤 및 크로마토그래피 용지 스택을 삽입하고 플라스틱 커버를 아래로 이동하여 씰을 만듭니다.</li>
		<li>젤 건조기에서 80°C에서 1시간 동안 건조시.</li>
		<li>젤 드라이어를 끄고 스택을 부드럽게 제거합니다. 랩과 두 번째 크로마토그래피 용지를 제거합니다. 자가 라디오 그램 카세트에 말린 젤과 함께 남아있는 크로마토그래피 종이를 테이프로 채집니다.</li>
		<li>어두운 방에 1 장의 자가 방사선 필름을 추가하십시오.</li>
		<li>-80 °C에서 카세트를 놓고 이전에 측정 된 scintillation 카운트에 따라 판단 할 수있는 신호 강도에 따라 1 시간에서 4 주 후에 필름을 개발하십시오 : 250-1,000 cpm의 경우 1-4 주, 1,000-10,000 cpm의 경우 24 h ~ 1 주, gt;10,000h의 경우 1 h ~ 24 h M.</li>
		<li>필름이 개발되면, 카세트 위에 필름을 놓고 실험실 마커로 조심스럽게 젤의 4 가장자리, 각 우물, XC 및 BB 염료의 위치를 표시합니다.</li>
		<li>인치 해상도당 300 픽셀 또는 600 픽셀로 필름을 스캔하고 이미지를 Tiff 파일로 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기서, 특정 전사체를 향한 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다. 이 분석은 S-아데노실 메티오닌이 메틸 기공체에서 삼각화될 수있다는 사실을 활용합니다(그림 1), 메틸화된 RNA가 항체를 사용하지 않고 정확하게 검출될 수 있도록 한다. 그러나,이 분석효소는 어떤 잔기 또는 화학 기가 효소에 의해 메틸화되어 있는지 나타낼 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 특정 잔기가 메틸화되어 있는지 확인하거나 확인하기 위해 RNA 기판의 돌연변이 분석, 역전사 블록 또는 질량 분광 분석과 같은 다른 방법이 RNA 메틸 트랜스퍼라제 분석과 함께 사용될 수 있다.
RNA의 선택과 합성의 그들의 모드는 RNA의 크기에 달려 있습니다. 18 과 120 nt 사이의 크기의 특정 RNA는 많은 평판이 좋은 핵산 공급자로부터 편리하게 맞춤형 합성될 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로, 다양한 크기...

DNA, RNA 및 단백질은 유전자 발현을엄격하게 조절하는 변형의 대상이 된다 1. 이러한 수정 중, 메틸화는 세 가지 생체 고분자 모두에 발생합니다. DNA와 단백질 메틸화는 지난 3년간 아주 잘 연구되었습니다. 대조적으로, RNA 메틸화에 대한 관심은 최근에 RNA 메틸화를 쓰거나 지우거나 결합하는 단백질이 발달 및 질병2에서재생하는 중요한 역할에 비추어 재점화되었다. 풍부한 리보좀 및 전사 RNA에서 더 잘 알려진 기능 외에도 RNA 메틸화 경로는특정 메신저 RNA 안정성 3,4,접합5 및 번역6,7을조절합니다. miRNA처리 8,9 및 전사 일시 중지 및 릴리스10,11.
여기서, 분자 생물학 실험실의 설정에서 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다(도 1에요약). 많은 연구는 관심의 RNA 수정에 대하여 항체를 가진 점 얼룩을 통해 RNA 메틸 트랜스퍼라제의 활동을 평가합니다. 그러나, 도트-블롯은 RNA 메틸트랜스퍼라제와 배양시 RNA의 무결성을 검증하지 않는다. 이것은 중요 하기 때문에 뉴클레아제와 재조합 단백질의 사소한 오염 부분 RNA 저하 및 혼란 결과 이어질 수 있습니다. 더욱이, 고도로 특이적인 RNA 변형 항체조차도 특정 서열 또는 구조를 가진 수정되지 않은 RNA를 인식할 수 있다. 여기서 보고된 시험관내 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석서는 S-아데노실 메티오닌이 메틸군 공여자에 삼각화될수 있다는 사실을 활용한다(그림 1), 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정확하게 검출할 수 있도록 함 . 지시서는 관심 있는 효소에 의해 말의 전사체의 메틸화및 시험의 생체외 전사 및 정제를 위해 제공된다. 이 방법은 유연하고 견고하며 주어진 프로젝트의 요구에 따라 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 시험관 내에서 전사 및 정제된 RNA, 화학적으로 합성된 RNA, 뿐만 아니라 세포 RNA도 사용될 수 있다. 이 분석법은 메틸화된 RNA가 겔에서 정확히 실행되는 위치를 보여줌으로써 질적 정보뿐만 아니라, 석질 카운트의 형태로 정량적 정보를 제공한다. 이것은 메틸화에 표적으로 하는 RNA RNA 또는 RNA의 크기를 직접 관찰하는 방법을 제공하기 때문에, 특히 세포 RNA를 기질로 사용하는 경우에, RNA 메틸 트랜스퍼라제의 기능에 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>10 bp DNA Ladder 키트.</td></tr><tr><td>10% 과황산암모늄(APS)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>요소 변성 폴리아크릴아미드 겔의 경우(10mL의 경우 1g을 8mL의 milliQ 물에 용해시킵니다. milliQ 물로 부피를 10mL로 조정하고, 0.45 &micro가 장착된 10mL 주사기를 사용하여 용액을 여과합니다. m 필터).</td></tr><tr><td>10X TBE 버퍼</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>요소 변성 폴리아크릴아미드 겔 (1L의 경우, 트리스 베이스 108g, 붕산 55g을 교반 막대가 있는 실린더에 추가합니다. 증류수 800mL를 넣고 용해시킵니다. 0.5M Na2EDTA (pH 8.0) 40mL를 추가합니다. milliQ 물로 부피를 1L로 조정하고, 0.22&micro를 사용하여 용액을 필터링합니다. m 필터).</td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>1L의 경우, 60.5g의 트리스 염기, 87.6g의 NaCl을 교반 막대가있는 실린더에 추가하십시오. 800mL의 증류수를 넣고 용해시키십시오. 농축 HCl로 pH를 7.5로 조정하십시오. milliQ 물로 1L로 부피를 조정하십시오. 0.22 &micro를 사용하여 용액을 필터링하십시오. M 필터.&nbsp;</td></tr><tr><td>아크릴 아미드 : 비스 아크릴 아미드 29 : 1 (40 % 용액 / 전기 영동), 피셔 바이오 시약</td><td>피셔</td><td>BP1408-1</td><td>요소 변성 폴리 아크릴 아미드 겔.</td></tr><tr><td>아데노실-L-메티오닌, S-[메틸-3H]; (샘[3H])</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155V250UC</td><td>RNA의 시험관 내 메틸화; 농도 = 1.0 mCi/mL; 특정 활성 = 17.1 Ci / mmol; 몰 농도 = (1.0 Ci / L) / (83.2 Ci / mmol) = 0.0584 mmol / L = 58.4 &마이크로;M.&nbsp; &nbsp; 냉동 3H-SAM 튜브를 받으면 4°C에서 해동하십시오. C, 20 &micro를 만드십시오. L 분취를 하고 -30&deg;C에서 동결합니다. 부분적으로 사용한 부분 표본은 절대 재동결하거나 재사용하지 마십시오.</td></tr><tr><td>Amersham Hypercassette Autoradiography 카세트</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>autoradiogram 젤 노출용.</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>자동 방사선 조영술 젤 노출용.</td></tr><tr><td>Beckman 섬광 카운터</td><td>Beckman</td><td>LS6500</td><td>액체 섬광 계수용.</td></tr><tr><td>Biorad Mini 수평 전기영동 시스템</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>Mini 수평 전기영동 시스템.</td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>20X 용액의 경우 1정을 0.525mL의 뉴클레아제가 없는 물에 녹입니다.</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>폴리아크릴아미드 겔용 RNase free 빈 카세트.</td></tr><tr><td>Criterion 비어 있는 카세트</td><td>Biorad</td><td>1656001</td><td>수직 미디 형식 전기영동 셀.</td></tr><tr><td>DeNovix DS-11 미량 분광 광도계</td><td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>DNA 및 RNA 농도 측정용 미량 분광 광도계.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>액체 섬광 조사용.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 7mL HDPE 섬광 바이알</td><td>Fisher</td><td>03-337-1</td><td>액체 섬광 계수용.</td></tr><tr><td>Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>오토라디오그램 젤 전처리용.</td></tr><tr><td>젤 건조기</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>젤 건조용.</td></tr><tr><td>겔 로딩 버퍼 II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>변성 폴리아크릴아미드 우레아 겔(구성: 95% 포름아미드, 18mM EDTA 및 0.025% SDS, 크실렌 시아놀 및 브로모페놀 블루)에 RNA를 로드하기 위해.</td></tr><tr><td>GeneCatcher 일회용 젤 절제 팁</td><td>Gel Company</td><td>NC9431993</td><td>아가로스 및 폴리아크릴아미드 젤에서 밴드를 제거합니다.</td></tr><tr><td>메가스크립트 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>T7 RNA 중합효소를 사용한 체외 전사용.&nbsp;</td></tr><tr><td>Perfectwestern Extralarge Container</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382 (투명)/ NC9965364 (검정)</td><td>젤 염색 상자.</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous end</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNA clean-up의 경우 프로토콜에 제공된 수정된 protocol을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen</td><td></td> <td>28704</td><td>in vitro transcription에 사용되는 dsDNA 단편의 겔 추출 및 세척을 위한 키트.</td></tr><tr><td>Saran 프리미엄 플라스틱 랩</td><td>Saran 랩</td><td>아마존</td><td>건조 젤용.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>초고감도 핵산 겔 염색제.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>핵산 겔 염색제.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM 다이소듐 EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>요소 변성 폴리아크릴아미드 겔용.</td></tr><tr><td>SMARTBLOCK 24X 1.5mL 튜브가 있는 써모믹서</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>1.5 mL 튜브의 온도 제어 배양용.</td></tr><tr><td>TOPO TA 클로닝 키트</td><td>생명 기술</td><td></td><td>Taq 중합효소의 빠른 클로닝을 위한 키트; in vitro RNA transcription을 위해 PCR 산물을 T7 및/또는 SP6 promoter를 포함하는 벡터로 증폭했습니다.</td></tr><tr><td>터보 DNase (2 U&frasl; &마이크로; L)</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>시험관 내 전사 반응에서 DNA 제거용.</td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마</td><td>51456-500G</td><td>우레아 변성 폴리아크릴아미드 겔용.</td></tr><tr><td>Whatman 3MM 종이</td><td>GE 헬스케어</td><td>3030-154</td><td>젤 건조용 크로마토그래피 종이.</td></tr></tbody></table>

rna 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

RNA의 100개 이상의 화학적으로 명백한 수정이 있습니다, 그 중 2/3는 메틸화로 이루어져 있습니다. RNA 수정, 특히 메틸화에 대한 관심은 질병과 암과 관련된 생물학적 과정에서 효소를 쓰고 지우는 중요한 역할로 인해 다시 나타났습니다. 여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 RNA 메틸화 기활성의 정확한 분석을 위한 민감한 시험관내 분석이 제공된다. 이 분석은 삼각형태인 S-아데노실-메티오닌을 사용하며, 그 결과 메틸화된 RNA를 트리튬으로 직접 라벨링합니다. 삼중수소 방사선의 낮은 에너지는 이 방법을 안전하고 기존의 삼중수소 신호 증폭 방법을 가능하게 하며, 일반적으로 유물에 걸리기 쉬운 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다. 이 방법은 RNA 메틸화를 위해 쓰여진 동안, 몇몇 비틀기는 14C 아세틸 코엔자임 A를 가진 RNA 아세틸화와 같은 방사성으로 표지될 수 있는 그밖 RNA 수정의 연구 결과에 적용가능하게 합니다, 이 분석법은 RNA를 빨리 평가할 수 있습니다 메틸화 조건, 소분자 억제제로 억제, 또는 RNA 또는 효소 돌연변이체의 효과, 세포에서 얻은 결과를 검증하고 확장할 수 있는 강력한 도구를 제공한다.

생체 외 에서 전사 반응 그림 2 A는 7SK snRNA의 T7 RNA 폴리머라제와의 시험관내 전사 반응으로부터의 전형적인 실행을 나타내며, 이는 비교적 짧은(331 nt) 및 고도로 구조화된 RNA이다. 원시 이미지에 표시된 것처럼, 여러 원치 않는 밴드가 있다, 둘 다 짧고 긴 7SK, 아마 임의의 전사 개시 또는 종료 이벤트에서 발생. 이 때문에, 시험관 내 전사 반응에 따른 겔 정제는 도 2B에도시된 바와 같이 깨끗한 RNA 샘플을 얻는 것이 중요하다. 이 시점에서, 관심 있는 RNA는 사다리에 상대적인 위치에 의해 식별되고 겔 정제에 의해 정제될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 겔 정제 단계 이전에 전사 반응의 길이를 최적화할 필요가 있을 수 있다. 너무 오래 실행되...

여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

RNA의 100개 이상의 뚜렷한 수정이 있으며, 그 중 3분의 2는 메틸레이션입니다. 이 프로토콜은 RNA 메틸화 라이터 활성에 대한 민감하고 정확한 분석을 위한 방법을 제공한다. 이 사용하기 쉬운 기술은 일반적으로 유물에 수그리는 항체의 사용 없이 메틸화된 RNA를 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생인 사만다 셸튼이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 100 마이크로리터 RNA 메틸 트랜스퍼라아제 분석기를 얼음 에 1.5 밀리리터 튜브에 설정합니다. 튜브를 완전히 혼합하고 원심분리기를 5초 동안 200배 g에서 혼합하여 튜브 의 바닥에서 용액을 수집합니다.2 시간 동안 37 섭씨에서 튜브를 배양하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컬럼 정제를 사용하여 반응을 청소합니다. 액체 신경수 수를 수행하려면 샘플당 1개의 유리병, 백그라운드 측정용 유리병 1개, 스 와이프 테스트를 위한 바이알 1개로 신경 수 랙을 설정합니다.바이알을 5밀리리터의 신경화 계수 용액으로 채웁니다. 각 용출 된 방사성 RNA 샘플의 10 마이크로 리터를 하나의 유리병에 추가합니다. 뚜껑을 조이고 부드럽게 섞습니다.스 와이프 테스트 바이알을 준비하려면 절차 중에 사용되는 모든 표면과 장비에 면 봉면을 철저히 문지릅니다. 이러한 면봉을 반짝이는 용액으로 채워진 바이알에 넣고 뚜껑을 조입니다. 신경화 카운터에서 샘플을 실행하려면 카운터 후드를 열고 랙을 기계에 삽입하고 후드를 닫습니다.단일 랙 카운트를 선택합니다. 사용자 프로그램 선택 선택을 선택합니다. 60초 동안 트리튬을 측정하는 프로그램을 선택하거나 만들고 카운트 랙을 누르세요.반짝이 수를 세 번 반복합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 우레아 데마포링 폴리아크라이알라미드 젤을 준비하고 다시 실행합니다. 방사성 RNA 물질 20 마이크로리터를 2X 젤 로딩 버퍼 20마이크로리터를 포함하는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기.사다리를 준비한 후 샘플을 섭씨 70도에서 15분 동안 배양합니다. 젤 탱크에서 버퍼를 겔의 우물로 피펫팅하여 시료 로딩 하기 직전에 젤의 우물을 다시 한 번 씻으시다. 그런 다음 준비된 사다리 20개, 샘플의 마이크로리터 20개, 1X 젤 로딩 버퍼 20개를 젤 의 차선에 적재합니다.폴리아크릴아미드 백분율에 따라 60~180분 동안 100볼트에서 젤을 실행합니다. 젤이 실행이 완료되면 카세트에서 젤을 제거하고 초감도 핵산 젤 얼룩 5 마이크로 리터와 함께 1X TBE 버퍼의 50 밀리리터를 포함하는 상자에 놓습니다. RNA를 얼룩지게하기 위해 5 분 동안 로커에 배양하십시오.그런 다음, 조심스럽게 상자에서 젤을 꺼내, 우물과 왼쪽에 사다리와 젤 이미징 시스템의 UV transilluminator에 배치. 젤에 카메라를 집중하고 UV 광을 켜고 젤 이미지를 찍습니다. 그런 다음 UV 노출을 끄고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.젤을 다시 상자에 넣고 TBE를 제거하고 실온에서 로커에 50 밀리리터의 고정 용액으로 젤을 30 분 동안 고정하십시오. 다음으로, 부드럽게 자동 방사선 화 강화 용액의 25 밀리리터를 포함하는 신선한 블랙 박스에 젤을 이동합니다. 실온에서 로커를 30분 동안 배양합니다.젤을 부드럽게 들어 올리고, 우물과 오른쪽에 사다리가 있는 플라스틱 랩 시트에 얼굴을 아래로 놓습니다. 젤 뒷면에 크로마토그래피 용지 2장을 놓고 전체 스택을 뒤집습니다. 젤 드라이어를 섭씨 80도로 예열합니다.젤 드라이어의 플라스틱 커버를 다시 이동합니다. 플라스틱 덮개 아래에 전체 스택을 삽입하고 플라스틱 덮개를 다시 아래로 이동하여 씰을 만듭니다. 젤을 섭씨 80도에서 1시간 동안 건조시다.그런 다음 젤 건조기를 끄고 스택을 부드럽게 제거합니다. 랩과 두 번째 크로마토그래피 용지를 제거합니다. 나머지 크로마토그래피 용지에 말린 젤을 자동 라디오그램 카세트에 테이프로 테이프로 바세요.어두운 방에 는 사인 라디오 필름 1 장을 추가합니다. 카세트를 음의 섭씨 80도에 저장하고 신호 강도에 따라 적절한 시간에 필름을 개발합니다. 필름이 개발되면 카세트 위에 놓고 실험실 마커를 사용하여 젤의 네 모서리, 각 우물 및 XC 및 BB 염료의 위치를 신중하게 표시합니다.인치당 300 픽셀 또는 600 픽셀의 해상도로 필름을 스캔하고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 본 연구에서는, 항체가 없는 분석이 RNA 메틸트랜스체 활성을 분석하는 것으로 입증된다. 7SK 소형 핵RNA의 T7 RNA 폴리머라제와 함께 체외 전사 반응에서 전형적인 실행은 상대적으로 짧고 고도로 구조화된 RNA를 나타낸다.7SK보다 짧고 긴 여러 개의 원치 않는 밴드가 있는데, 이는 무작위 전사 개시 또는 종료 이벤트로 인해 발생할 수 있습니다. 이 때문에, 체외 전사 반응에 따른 겔 정제는 깨끗한 RNA 샘플을 얻는 것이 중요하다. 이 시점에서, 관심있는 RNA는 사다리에 상대적인 위치에 의해 식별되고 겔 정화에 의해 정제될 수 있다.추천 RNA 및 단백질 농도의 하한을 이용한 대표적인 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석이 여기에 나와 있다. 이 분석법은 신자극 수의 정량적 결과뿐만 아니라 자동 방사선 사진의 정성적 결과를 모두 허용합니다. 여기서, 메틸레이트 7SK로 알려진 RNA 메틸트랜스퍼라제는 또한 U6를 메틸레이트할 수 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 최근 7SK에 대해 나타난 바와 같이, 그의 음색 H4를 MePCE에 결합하는 것도 U6 메틸화를 억제한다.이는 이 프로토콜의 견고성을 보여주는 신경 수와 자동 라디오그램 모두에서 관찰될 수 있다. RNA는 분해에 취약하므로 RNase 가없는 시약을 사용하고 모든 표면과 장비를 철저히 청소하십시오. 이 메틸트랜스퍼라제 분석에서 얻은 방사성 표지 된 RNA는 전기 이동성 이동 분석에 의한 RNA 디메틸라제 활성 또는 RNA 결합 활성을 평가하기 위해 직접 사용될 수 있다.이 방법은 연구원이 포인트 돌연변이 및 작은 분자 억제제 처리를 포함하여 RNA 메틸 전달효소 활동에 다른 요인의 효력을 시험할 수 있습니다. 이 방법은 방사성 물질을 사용하므로 적절한 PPE를 착용하고 방사성 물질을 취급하고 폐기하는 동안주의하십시오.

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 프로토콜은의 합성 tRNA 기판의 준비에 대해...

Entamoeba histolytica DNA와 tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) 효소를 체외 tRNA의 Methylation 분석에서

RNA에 N 6 -methyladenosine (m 6 A) 변형을 측정하기위한 수정 북부 블로 팅 방법을 설명한다. 현재의 방법은 여러 가지 실험 설계에 따라 다양한 RNA를에서 수정 및 컨트롤을 감지 할 수 있습니다.

RNA 측정 방법<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

우리가 효 모 RNA 수정 효소, Mod5, 생 화 확 적인 특성에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 프로토콜 다른 RNA 수정 효소 적용할 수 토론.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

여기에서 우리는 RNA의 DNAzyme 의존적인 절단을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 RNA 2'-O-메틸화의 신속하고 현장 의존적인 분석을 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 스노RNA 활성의 예비 또는 주요 평가를 위해 사용될 수 있다.

RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

메틸화 RNA 면역 침전 분석법은 메틸화 RNA 단편을 농축하는 데 사용되는 항체 기반 방법입니다. 깊은 시퀀싱과 결합하여 m5C수정을 운반하는 성적 증명서를 식별합니다.

메틸화 RNA 면역 침전 분석연구 m5C 변형에 대한 애비독증

이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.

세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

바이러스 감염에 있는 RNA 수정의 역할은 탐구하기 시작하고 새로운 바이러스성 호스트 상호 작용 기계장치를 강조할 수 있었습니다. 이 작업에서는 바이러스 감염의 맥락에서 m6A 및 m5C RNA 수정을 조사하는 파이프 라인을 제공합니다.

바이러스 감염시 m6A 및 m5C 에피레미테롬 탐험: HIV를 가진 예

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

여기서는 도트 블롯을 이용해 전반 m⁶A 수치를 반정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 총 RNA를 추출, 변성, 나일론 막에 점상화하고, 항-m⁶A 항체로 탐침하며, 화학발광으로 시각화합니다. ImageJ 그레이스케일 분석으로 정량화된 신호 강도는 상대적인 메틸화 풍부도를 반영하여 연구에 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

글로벌 N6-메틸라데노신 RNA 변형 수준을 검출하기 위한 도트 블롯 분석

여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

배우세요 항체 무첨가 분석법으로 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 정량적·정성적으로 평가하는 방법을 익히세요. 삼중수소 표지 S-아데노실메티오닌을 이용하여 안전하고 신뢰성 높은 메틸화 분석이 가능합니다.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

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