Name: 라이브 셀에서 Fura-2-Analog를 이용한 세포내 Ca2+ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 배우세요 Fura-2 형광 프로브를 이용한 살아있는 세포 내 칼슘 농도 측정 시 NADH 신호 간섭을 보정하는 새로운 방법을. 심근세포에서 정확한 미토콘드리아 칼슘 역학 분석이 가능합니다.

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이 작품은 교육부(2018R1A6A3A0111832)가 지원하는 국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램(NRF-2016M3C1A696606)의 지원을 받았습니다. 산업통상자원부(10068076)에 의해

모든 실험 프로토콜은 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>단 하나 갓 고립된 심장 근세포11를준비하십시오. 참고: 각 실험실에는 다른 세포 저장 솔루션이 있을 수 있습니다. 여기서, 근세포는 배양 배지(DMEM)에 저장된다.</li>
	<li>Ca2+-free 용액 100 mL을 준비하십시오(표 1).</li>
	<li>50 mL 비커에 배양 배지 50 mL을 준비합니다. Aliquot 5 mL및 37°C에서 수조에 넣습니다. 남은 용액을 실온에서 유지하십시오.</li>
	<li>50 mL의 사포닌을 50 mL의 Ca2+-free 용액에 추가하여 사포닌 용액 50 mL을 준비하십시오. 참고 : 사포닌은 심장 근세포를 투과시키고, 세포실 구획을 제거하고, 미토콘드리아 형광만을 시각화하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해된 1mM의 후라-2-FF-AM 16 μL을 준비한다. 참고: DMSO에 용해된 후라-2-FF-AM의 1mMM 스톡 용액을 2mL 튜브에 16 μL로 만듭니다. 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>NADH 프리Ca2+-무첨가 용액 50 mL을 준비(표 1)및 NADH 프리Ca2+-포화 용액 50 mL(표 1)때 등변 점을 측정한다. KOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. 참고: NADH 프리Ca2+-free 용액(표 1)에는미토콘드리아에서 NADH를 최소화하기 위해 미토콘드리아 기질없이 10 μM FCCP 및 100 μM ADP가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>NADH 보정 인자 측정에 사용할 50 mL의Ca2+-free 솔루션, 50 mL의 말레이트 용액, 50 mL의 말레이트-피루바트 용액 및 50 mL의 로테네 용액을 준비합니다(표1).</li>
</ol>2. 미토콘드리아에 플루오로프로브 로딩 절차
<ol><li>배양 배지의 2 mL을 1mM fura-2-FF-AM의 16 μL에 첨가하여 염료 로딩 용액을 준비한다. 참고: 형광 염료는 빛 아래에서 깨지기 쉽습니다. 사용 직전에 솔루션을 준비하십시오. 형광염료를 함유한 용액을 어두운 곳에 보관하십시오. 후라-2-FF-AM의 최종 농도는 8 μM이다. 카복시-SNARF-1을 사용한 경우, 2 μM 카르복시-SNARF-1-AM으로 염료 로딩 솔루션을 준비하십시오.</li>
	<li>단리된 세포의 2 mL을 가지고 5 mL 시험관에 똑바로 놓습니다.</li>
	<li>근세포가 바닥으로 가라앉을 때까지 15분 기다렸다가 상판을 제거합니다. 참고: 상한제에는 세포 파편이 포함될 수 있습니다. 세포 손상을 피하기 위해 튜브를 원심 분리하지 마십시오.</li>
	<li>염료 로딩 솔루션의 2mL를 추가합니다.</li>
	<li>4 °C에서 60 분 동안 세포로 염료 로딩 용액을 배양하십시오.</li>
	<li>이어서, 시험관을 37°C 수조에 30분 동안 똑바로 놓는다.</li>
	<li>상온액을 제거하고, 37°C의 미리 온난화된 배양 배지의 4 mL를 첨가한다. 37°C 수조에서 60분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>마지막으로, 상류를 제거하고 실온에서 배양 배지 4 mL를 추가하고 튜브를 실온에서 유지하십시오.</li>
</ol>3. 다분체 측정 시스템 도입
참고: 그림 1은 전체 시스템의 다이어그램을 보여줍니다.
<ol><li>여기 광원의 경우 3ms 이내의 빛을 변경할 수 있는 빠른 단색화기(폴리크롬 II)를 사용하십시오.</li>
	<li>신호 강도를 높이기 위해 반전된 현미경으로 오일 침지 렌즈(40x, NA 1.3)를 사용하십시오.</li>
	<li>근적외선 필터와 CCD(충전 결합 장치) 카메라를 사용하여 형광 신호 간섭 없이 물체 필드를 모니터링합니다.</li>
	<li>개체 필드 이미지를 캡처하여 영역을 가져옵니다.</li>
	<li>배경을 줄이기 위한 셀을 표시하기 위해 필드 다이어프램으로 모니터 화면의 개체 필드를 조정합니다.</li>
	<li>각 밴드 패스 필터(450, 500, 590 및 640 nm)가 있는 4개의 광증배튜브를 사용하여 광자 계수 방법으로 방출 파장을 감지합니다. 적절한 이색 거울을 사용하여 방출 라이트를 분할하고 리디렉션합니다. 참고: 여기 표시등은 방출 광에 비해 매우 강합니다. 따라서 가장 높은 차단 특성을 가진 밴드 패스 필터를 선택하여 배경을 줄입니다. 광자 계수 시스템은 PMT, 광자 카운터 유닛 및 고속 카운터의 조합으로 구성됩니다. 시스템을 제어하고 데이터를 샘플링하기 위해 맞춤형 드라이빙 소프트웨어가 사용되었습니다. 이 메서드를 다른 시스템과 적용할 방법을 찾아야 합니다.</li>
</ol>4. 다분측정 시스템을 통한 NADH 보정 방법
<ol><li>후라-2-FF의 이소성 지점의 식별. 참고: 많은 보고는 형광 특성이 세포에서 변경된다는 것을 명시했습니다. 따라서, 모든 절차를 수행하여 상체에서 간섭을 보정하기 위해 파라미터를 구한다.
	<ol>
<li>염료가 장착된 세포를 현미경으로 장착하고 세포를 바닥으로 가라앉힐 때까지 3분 동안 기다립니다. 참고: 40x 대물 렌즈로 하나의 대물필드당 하나의 셀을 볼 수 있도록 셀 수를 조정합니다.</li>
		<li>37°C에서 NADH 프리 Ca2+-무첨가 용액을 주입하십시오.</li>
		<li>세포를 표적으로 한 후, 섹션 4.1에 도시된 바와 같이 무세포 배경 및 세포 영역을 측정한다. 셀 영역에서 셀 배경을 계산합니다. 참고: 각 실험에서 두 배경 신호를 모두 수정해야 합니다.</li>
		<li>사포닌 용액을 60s에 퍼우고 NADH가 없는 Ca2+-free 용액으로 되돌아갑니다.</li>
		<li>0.1 nm 단계로 350 nm에서 365 nm까지의 여기 스캔에 의해 450 nm 및 500 nm에서 Fura-2-FF 방출 신호를 동시에 측정합니다.</li>
		<li>NADH 프리 Ca2+-포화 용액을 주입하고 4.2.5 단계를 반복하십시오.</li>
		<li>Ca2+-채도가 낮은 솔루션의 신호를 Ca2+-free 조건의 신호에서 뺍니다.</li>
		<li>다른 단일 심장 근세포와 함께 4.2.2에서 4.2.7까지의 절차를 반복하십시오. 참고: 신호 강도가 약해지면 4.2.1에서 반복합니다. 적어도 5 개의 다른 세포에 대한 절차를 반복하십시오.</li>
		<li>획득한 모든 신호에서 각 여기에서 방출의 표준 편차를 계산하고 isosbestic 점으로 최소 표준 편차(SD) 값을 보여주는 여기 파장을 선택합니다. 참고: 대표적인 수치는 그림 2에나와 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>셀 영역이 있는 배경 신호 감지 및 보정 방법 참고: 배경에는 두 가지 종류가 있습니다. 하나는 셀에서 오고 다른 하나는 커버 슬립 (셀없는 배경)에 반사에서 온다. 각 실험에서 두 배경을 수정해야 합니다.<ol>
<li>염료가없는 세포를 현미경으로 욕조에 장착하고 세포를 바닥으로 가라 앉힐 때까지 3 분 동안 기다립니다. NADH 프리 Ca2+-free 솔루션을 약 5분 동안 사용하십시오. 참고: 모든 용액 관류 속도는 37°C에서 2-3 mL/min입니다. 참고: 40x 대물 렌즈로 하나의 대물필드당 하나의 셀을 볼 수 있도록 셀 수를 조정합니다.</li>
		<li>대상 셀을 덮도록 개체 필드를 설정합니다.</li>
		<li>셀을 필드 밖으로 이동한 후 셀없는 창의 배경 신호를 측정하고 오프셋으로 설정합니다. 참고: 신호는 광자 계수 시스템에서 감지되는 신호입니다.</li>
		<li>셀을 초기 위치로 되돌리고 셀 배경 신호와 셀 영역을 측정합니다. 참고: 여기 표시등이 밴드패스 필터로 필터링되더라도 여전히 많은 양의 필터링된 라이트가 포함되어 있습니다. 이 빛은 세포를 칠 때 분산되며 광자 계수 시스템이 매우 민감하기 때문에 상당한 배경 신호를 발생시킵니다. 수정해야 합니다. 참고: 셀 영역은 캡처된 셀 이미지와 사용 가능한 이미징 소프트웨어로 계산될 수 있습니다. 셀 영역의 단위는 픽셀 수를 포함한 임의의 단위일 수 있다. 저기 표준화가 필요합니다.</li>
		<li>4.1.1에서 4.1.4까지 10회 반복하여 세포 영역과 세포 배경 신호 사이의 관계를 얻었다. 참고: 나중에, 세포 배경 신호는 관계에서 셀 영역에서 계산될 수 있다. 여기 전구가 노화되기 때문에이 절차는 적어도 매달 반복되어야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>R 요인의 측정<ol>
<li>섹션 4.2에서 얻은 신호에서 수학식 4로 Rf를 계산합니다.</li>
		<li>염료가 없는 세포를 현미경에 장착하고 Ca2+-free 용액을 주입합니다.</li>
		<li>F361, 450, NADH,F400, 500, NADH,F361, 450, NADH및 F353, 500,NADH와 같은 신호를 측정합니다.</li>
		<li>malate 솔루션을 침투하고 4.3.3을 반복하십시오. 신호를 측정합니다.</li>
		<li>피루바테 용액을 침전시키고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.</li>
		<li>말레이트-피루바테 용액을 주입하고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.</li>
		<li>로테네 용액을 주입하고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다. 참고: 5 mM 피루바테, 5 mM malate 플러스 5 mM 피루바테 및 10 μM 로테논 첨가에 기록된 NADH 신호의 예는 도 3에도시되어 있다.</li>
		<li>F361, 450, NADH 대 F400, 500, NADH 및 F361, 450, NADH 대 F353, 500, NADH의각 경사를 계산합니다. 그림 3에도시된 바와 같이 . 각 경사는 RN1 및 RN2를나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. TMRE 또는 카복시-SNARF-1의 여기 및 방출 표시등 선택
<ol><li>미토콘드리아 전위를 측정하기 위한 TMRE가 추가로 사용된 경우, 530 nm 여기 파장 및 590 nm 방출 파장을 사용한다.</li>
	<li>미토콘드리아 전위를 측정하기 위한 카복시-SNARF-1이 추가로 사용된 경우, 540 nm의 여기 파장 및 590 nm 및 640 nm12의방출 파장을 사용한다.</li>
</ol>6. 후라-2-FF의 Kd 값 선택
<ol><li>pH의 변화는 fura-2-FF10에대한Ca2+ 바인딩에 대한 Kd 값에 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아의 경우 pH 7.5에서 5.28의 Kd 값을 사용합니다.</li>
</ol>

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<li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2%2B+concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li>
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<li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li>
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</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

간섭 보정 방법은 NADH 및 fura-2 유사체의 신호를 측정하기 위해 성공적으로 개발되었습니다. 정확한 교정을 위해서는 신호의 정확한 측정이 필수적입니다. 그러나, 형광 장치의 본질적인 특성은 후라-2의 NADH와 관련이 없는 배경 신호를 생성한다. 최고 품질의 밴드 패스 필터는 빛의 원치 않는 파장의 10-8까지 만 통과 할 수 있습니다. 그러나 단일 셀의 형광 신호는 매우 작고, 밴드 패스 필터 후 여기 빛의 반사는 실제 형광 신호를 오염시킬 만큼 충분히 강합니다. 따라서 배경 신호를 주의 깊게 수정해야 합니다.
Fura-2는 미토콘드리아 Ca2+측정에 로딩 문제가 있습니다. 첫째, 염료를 미토콘드리아에 구체적으로 적재하는 것은 쉽지 않으며, 다른 세포기관에 비특이적 로딩이 잘못될 수 있다. 미토콘드리아Ca2+ 농도는 일반적으로 시토졸보다 높고, 높은 Kd 값을 가진 fura-2-FF를 사용하면...

세포 내 Ca2+의 중요한 역할은 널리 알려진1. [Ca2+]의정량화는 세포 생리 기능의 과정을 이해하는 데 필수적입니다. Fura-2 아날로그는 UV 범위(&400 nm)에서 흥분하기 때문에 매우 유용하며, 비율 측정 방법은 정량 측정에 적용될 수 있습니다. 따라서, pH, 막 전위 등과 같은 다른 생리학적 파라미터는 다른 형광 염료로 측정될 수 있다. 미토콘드리아Ca2+ 농도([Ca2+]m]범위는 0.08-20 μM2,3,4,5로알려졌다. fura-2 유사체 중에서 fura-2-FF는 [Ca2+]의 이 범위를 측정하는 데 적합합니다. 그러나, 살아있는 세포는 불행하게도 그들의 신진 대사 과정에 대한 NADH/NADPH를 포함하고, NADH는 fura-2 아날로그와 겹치는 여기 및 방출 스펙트럼 때문에 신호 간섭을 생성합니다. 이 간섭은 fura-2 유사체의 사용을 크게 제한합니다. 구체적으로, 유사체가 미토콘드리아[Ca2+]를측정하기 위해 적용되는 경우, NADH의 가장 높은 양이 미토콘드리아에 있기 때문에 이러한 간섭이 가장 큰 장애물이다. 이것은 NADH 변화가 미토콘드리아 막 전위(Θm)와관련이 있고 Θm의 변화가[Ca2+ ]m6,7,8에영향을 미치므로 더욱 복잡해져요. , 9. 또한,[Ca2+]m 역학을 공부하기 위해, NADH, Θm및 pH와 같은 다른 미토콘드리아 매개 변수의 상태를 아는 것이 필수적이다.
450 nm 및 500 nm에서의 방출은 353 nm, 361 nm 및 400 nm에서 NADH 및 fura-2-FF로부터의 신호를 포함하고, 수학식은 다음과 같다. 본 명세서에서, 353 nm 및 361 nm는 각각 450 nm 및 500 nm에서 배출을 위한 후라-2-FF의 이등산 지점이다.
F361,450 = F361,450, NADH + F361,450,후라 방정식 1 F353,500 = F353,500, NADH + F353,500,후라 방정식 2 F400,500 = F400,500, NADH + F400,500, 후라 방정식 3
여기서 Fx, y는 x-nm 여기, Fx, y, NADH는 순수한 NADH 의존 방출 강도를 나타내고, Fx, y, Fura는 순수한 후라-2-FF 의존 방출 강도를 나타냅니다. 형광 염료의 동일한 농도하에서, 특정 여기 강도는 동일한 방출 강도를 생성해야 한다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. Ca2+ 및 fura-2는 NADH 형광 특성에 영향을 미치지 않았다; 따라서 NADH의 450 nm 및 500 nm에서의 방출 비율은 임의의 여기 파장에서 일정하였다. 동일한 규칙은 NADH 또는[Ca2+]가후라-2-FF의 방출 및 여기 스펙트럼에 영향을 미치지 않는다는 가정에 기초하여 fura-2-FF에 사용될 수 있다. 그러나,Ca2+는 후라-2-FF 방출의 스펙트럼 변화를 일으켰다. 따라서Ca2 +의효과를 제거하려면Ca2 +와무관한 isosbestic 여기를 사용해야합니다. 각 방출 파장(즉, 450 nm 및 500 nm)은 상이한 isosbestic 포인트를 가지며, 우리의 실험 설정에서, 500 nm에서 353 nm 및 450 nm에서 361 nm이 선택되었다. 이 로부터 다음 방정식은 유효한10.
Rf = F361,450, 후라/ F353,500, 후라 방정식 4 RN1 = F400,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 5 RN2 = F353,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 6
이러한 상수의 경우 (수학식 1) 및 (수학식 3)의 다음 방정식이 유효합니다.
F361,450 = F361,450, NADH + Rf × F353,500, 후라 방정식 7 F353,450 = RN2 × F361,450, NADH + F353,500, 후라 방정식 8 F400,500 = RN1 × F361,450, NADH + F400,500, 후라 방정식 9
이러한 방정식으로부터, Rf,RN1및 RN2가 공지된 경우, NADH 및 fura-2의 순수한 신호는 다음과 같이 얻어질 수 있다.
F361,450,NADH = (F361,450 - RF × F353,500)/(1− RF ×R N2)방정식 10 F353,500,후라 = (RN2 × F361,450 - F353,500)/(RF × RN2 - 1) 방정식 11 F400,500,후라 = F400,500 - RN1 × F361,450, NADH 방정식 12 R후라 = F353,500, 후라/ F400,500, 후라 방정식 13
Ca2+-바운드 형태의 후라-2-FF는 400 nm 여기 파장에서 실질적으로 비형광이었다. 이 속성에 따라 다음과 같은 새 교정 방정식을 파생할 수 있습니다.
[Ca2+ +] = KD ∙ (F400,500, 최대/ F353,500, 최대)× (R후라 - R분)방정식 14
여기서Kd는 해리 상수, F400,500, 최대 및 F353,500, 최대는 각각 400 nm 및 353 nm에서 여기와 500 nm에서 방출 된 신호의 최대 값이며, Rmin은 Ca 2의 최소 RFura입니다. +- 무료 상태. 이소성 여기가 사용되었기 때문에, 방정식은 다음과 같이 더 단순화 될 수있다.
[Ca2+ +] = KD ∙ (1 / R분)∙ (R후라 - R분)방정식 15
따라서 [Ca2+]를 계산하려면 Kd 및 R최소 값만 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>2 mL eppendorf tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 mL Tube</td></tr><tr><td>AD/DA converter</td><td>Instrutech</td><td>ITC-18</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>ADP, Adenosine 5&prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A5285</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Band pass filter</td><td>Ealing Electro-Optics, Inc</td><td>35-3920</td><td>장비, 640&plusmn; 11nm</td></tr><tr><td>Band 통행 여과기</td><td>Omega 광학</td>적인 <td>690-9823</td><td>장비, 590&plusmn; 15nm</td></tr><tr><td>Band pass filter</td><td>Omega Optical</td><td>500DF20-9916</td><td>장비, 500&plusmn; 20nm</td></tr><tr><td>밴드 패스 필터</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>60685</td><td>장비, 450&plusmn; 30nm</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21114</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>carboxy-SNARF-1(AM)</td><td>Invitrogen</td><td>C1272</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Charge-coupled device (CCD) camera</td><td>Philips</td><td>FTM1800NH/HGI</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>크로마 테크놀로지 코퍼레이션</td><td>86009</td><td>장비, 다중대역 이색성 거울, 반사 : < 400nm, 490&플러스mn; 10, 560&플러스mn; 10, 전송 : 460&plusmn; 15, 510&플러스mn; 20, >580nm</td></tr><tr><td><강>다이크로익 미러</강></td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>567DCXRU</td><td>장비, 반사 : < 560nm, 투과 : > 580 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>480DCLP</td><td>장비, 반사 : < 470nm, 투과 : > 490 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>20728</td><td>장비, 다대역 이색성 거울, 반사 : < 405nm, 470&플러스mn; 30, 투과 : 430nm ~ 520nm, > 640 nm</td></tr> <tr><td>< 강> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) < / 강></td> <td>시그마 알드리치</td><td>154938</td><td>화학</td></tr> <tr><td>< 강>DMEM, Dulbecco ' 의 변형된 독수리' s 매체</강></td><td>시그마-알드리치</td><td>D5030</td><td>화학</td></tr><tr><td><강>EGTA, 에그타진산, 에틸렌-비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산, 글리콜 에테르 디아민 테트라아세트산</강></td><td>시그마-알드리치</td><td>E4378</td><td>화학</td></tr><tr><td><강>FCCP, 메톡살로니트릴 4-트리플루오로메톡시페닐히드라존</강></td><td>시그마-알드리치</td><td>21857</td><td>화학물질</td></tr><tr><td>field 다이어프램</td><td>Nikon</td><td>86506</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Fura-2-FF(AM)</td><td>TEFLABS</td><td>137</td><td>chemicals</td></tr><tr><td>Green tube</td><td>DWM</td><td></td><td>test tube</td></tr><tr><td>Hepes,&nbsp; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime;-(2-ethanesulfonic acid))</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3375</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>High-speed counter</td><td>National Instruments</td><td>NI-6022</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Hot mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>21002</td><td>장비, 50:50</td></tr><tr><td><강력>도립 현미경 </강력></td><td>니콘</td><td>TE-300</td><td>장비</td></tr><tr><td><강력>말레이트</강력></td><td>시그마-알드리치</td><td>27606</td><td>화학</td></tr><tr><td><강력>근적외선 필터 </강력></td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>D750/100X</td><td>장비, 750&plusmn; 100nm</td></tr><tr><td><강력>오일 이멀젼 렌즈 </강력></td><td>니콘</td><td>MRF01400</td><td>40배, 개구수 1.3; 장비</td></tr><tr><td>광자 카운터 장치</td><td>Hamamatsu</td><td>C3866</td><td>장비</td></tr><tr><td>광자 증배기 튜브</td><td>Hamamatsu</td><td>R2949</td><td>장비</td></tr><tr><td>Polychrome II</td><td>Till Photonics</td><td>SA3/MG04</td><td>장비</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>화학 물질</td></tr> <tr><td>< 강> 수산화 칼륨 용액 < / 강></td> <td>시그마 알드리치</td><td>P4494</td><td>화학 물질</td></tr> <tr><td>< 강> 피루브 산 염 < / 강></td> <td>시그마 알드리치</td><td>107360</td><td>화학 물질</td></tr> <tr><td>< 강> 로테논 < / 강></td> <td>시그마 알드리치</td><td>R8875</td><td>화학</td></tr> <tr><td>< 강>사포닌 < / 강></td> <td>시그마 알드리치</td><td>S4521</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>TMRE, 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르 </강></td><td>분자 프로브</td><td>T669</td><td>화학 물질</td></tr></tbody></table>

라이브 셀에서 fura-2-analog를 이용한 세포내 ca2+ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

[Ca2+]정량적으로 측정하기 위해 비메트릭 플루오로프로브인 fura-2 유사체가 자주 사용됩니다. 그러나, 염료 사용은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)로부터 주로 자가형광 간섭으로 인해 살아있는 세포에서 본질적으로 제한된다. 보다 구체적으로, 이것은 NADH의 대부분이 미토콘드리아에 있기 때문에 fura-2 유사체를 정량적으로 사용하여 미토콘드리아[Ca2+]를측정할 때 주요 장애물이다. 형광 염료 농도가 동일하면 특정 여기 강도가 동일한 방출 강도를 생성해야 합니다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. 이러한 원리에 기초하여, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운온라인 보정 방법이 개발되었으며, NADH 및 fura-2의 실제 신호 강도를 얻을 수 있다. 또한,[Ca2+]를계산하는 새로운 방정식은 400 nm에서 isosbestic 여기 또는 여기로 개발되었다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 [Ca2+]의변화를 성공적으로 측정할 수 있습니다. 또한, 다른 일련의 여기 및 방출 파장의 경우, NADH,[Ca2+],및 pH 또는 미토콘드리아 막 전위(Θm)를포함하는 다중 파라미터를 동시에 측정할 수 있었다. 미토콘드리아[Ca2+] 및 Θm 또는 pH는 후라-2-FF 및 테트라메틸호다민 에틸 에스테르(TMRE) 또는 카르복시-세미나피-호르다플루오르-1(카르복시-SNARF-1)을 사용하여 측정하였다.

미토콘드리아 Ca2+ 수정으로 인한 변경10 그림 4는 보정 전후의[Ca2+]m의 변화를 보여줍니다. 결과는[Ca2+]m의상당한 변화를 명확하게 보여 주었다. 시토솔산 Ca2+([Ca 2+]c)가없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도는 1.03±0.13 μM(평균 ±S.E., n=32)이었고, 1-μM에서[Ca2+]m의 최대는 29.6±1.61 μM(0.6 ±1.61 μM) 평균 ± S.E., n = 33)(그림 5).
NADH, [Ca2+ +], 및 Θm10의 동...

NADH 및 fura-2 유사체의 여기 및 방출 파장의 스펙트럼 중첩으로 인해[Ca2+]의 정량 적 측정 중에 라이브 셀의 두 화학 물질의 신호 간섭이 불가피합니다. 따라서, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운 온라인 보정 방법이개발되었다[Ca2+]

라이브 셀에서 Fura-2-Analog를 이용한 세포내 Ca2+ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV 흥분성 복수 프로브는 자동 복수음으로 인해 고유 신호 오염을 가지게 된다. NADH의 대부분의 문제점은 복수 프로브의 사용을 제한하고 있다. NADH로부터의 외부 플로레시브를 정밀하게 교정하여, 오염되지 않은 다원 탐사 신호를 추출하기 위해 방법을 사용할 수 있다.그 절차를 시연하는 것은 제 실험실에서 연구조교수인 이정훈 교수입니다. 심근세포가 튜브 의 바닥에 정착 할 수 있도록 한 후, 슈퍼 나탄을 흡인. 갓 준비된 밀리머 1밀리머 fura-2-FFAM 희석 용액을 섭씨 4도에서 60분간 2밀리리터로 셀에 라벨을 붙입니다.인큐베이션이 끝나면, 수퍼를 제거하기 전에 37도 의 수조에 튜브를 똑바로 세워 30 분 동안 배치하십시오. 그런 다음 실온에서 보관할 수 있는 실온 배양 배지 4밀리리터를 추가합니다. 시투 동위 상층포라-2-ffa 포인트 식별을 위해 희석된 세포를 현미경 단계에 장착하고 세포가 바닥으로 가라앉을 때까지 3분을 기다린다.NADH가 없는 섭씨 37도 칼슘 없는 용액을 세포 배양에 투입하고 표적 세포를 찾습니다. NADH 가 없는 칼슘 없는 용액을 재사용하기 전에 60초 동안 사포닌 용액을 사용하십시오. 동시에 450 및 500 나노미터에서 fura-2-ff 방출 신호를 측정하여 350 ~ 365 나노미터의 암분 스캔을 사용하여 0.1 나노미터 단계로 NADH가없는 칼슘없는 용액으로 다시 profuse.다음으로 칼슘 없는 조건의 신호로부터 칼슘 포화 용액의 신호를 빼는다. 그런 다음 각 여기에서 배출의 표준 편차를 계산하고 개별 동면 점으로 최소 표준 편차 값을 나타내는 흥분 파장을 선택합니다. 다중 파라메트릭 측정 시스템을 사용하여 배경 신호를 감지하고 세포 영역 내의 신호를 수정하려면 현미경 욕조에 염료가 없는 세포를 장착하고 세포가 3분 동안 정착할 수 있도록 합니다.NADH 칼슘이 없는 용액을 분당 2~3밀리리터로 약 5분 동안 욕조에 넣고 표적 세포를 커버하기 위해 물체 필드를 설정합니다. 셀을 필드 밖으로 이동한 후 셀이 없는 창의 배경 신호를 측정하고 신호를 오프셋으로 설정합니다. 그런 다음 셀을 초기 위치로 되돌리고 셀 배경 신호 및 셀 영역을 측정합니다.R-factor를 계산하기 위해 획득 한 세포 배경 및 영역 신호를 사용하여 염료가없는 세포를 현미경에 재장착하고 칼슘이없는 용액을 주입합니다. malate 용액으로 세포 현탁액을 교화하기 전에 표시된 신호를 측정합니다. 신호를 측정한 후 피루바테 용액으로 세포를 풍부하게 한 다음, malate-pyruvate 용액 및 로테네용액을 풍부하게 합니다.그런 다음 각 신호에 대한 경사를 계산합니다. 여기에 교정 전후의 미토콘드리아 칼슘의 변화가 나타난다. 그 결과 1.03플러스 또는 마이너스 0.13 마이크로몰라 및 최대 미토콘드리아 칼슘 이없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도를 가진 미토콘드리아 칼슘의 상당한 변화를 명확하게 밝혀 29.6 플러스 또는 마이너스 1.61 마이크로몰라의 한 마이크로몰라에서 최대 미토콘드리아 칼슘.미토콘드리아 막 전위는 2나노몰라 TMRE의 풍부와 함께 모니터링되었다. 미토콘드리아 전위의 변화는 마이너스 150 밀리볼트의 초기 미토콘드리아 막 전위력을 기준으로 계산되었으며, 칼슘 첨가에 대한 반응으로 NADH의 감소를 입증하고 미토콘드리아 막 잠재력에 대한 무시할 만한 효과를 보였다. 미토콘디랄 pH는 카박스SNARF-1 하중에 의해 유도된 미토콘드리아 칼슘의 증가에 의해 영향을 받지 않았다.잘못된 등약 점수로 인해 잘못된 R 및 NADH 보정이 발생합니다. 따라서 항상 세포가 없는 배경 과 셀 영역을 올바르게 측정하십시오. 이 기술은 생체 분석 유출에 있는 미토콘드리아 칼슘 동적 연구 결과를 준비하는 데 사용됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

칼슘 신호는 유전자 발현, 생존과 분화 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을한다. 여기 Fura - 2 오전 사용하여 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 이미징은 실시​​간 신호 폭포 자사의 규제에 세포 내 칼슘의 규정을 연구하기위한 귀중한 도구입니다.

Fura - 2 오전 사용하여 두피 뉴런의 칼슘 이미징

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

이 동영상은 배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 컨포칼 현미경 이미징 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료 Rhod-2/AM을 사용하여 투과 배양 세포에서 미토콘드리아 칼슘을 측정합니다.

배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 칼슘 유입 분석

절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

이 논문은 쥐의 심장에서 분리된 심장 근세포에서 수축하는 동안 myofilament Ca2+ 감도의 변화를 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 심장 전기생리학, 수축기/이완기 세포질 Ca2+ 수치 및 수축/이완과 함께 이 측정은 건강한 심장과 질병이 있는 심장에서 심장 흥분-수축 결합을 매개하는 메커니즘을 뒷받침하는 데 필수적입니다.

Myofilament 칼슘의 평가<sup&gt; 2 +</sup&gt; 감도 근본적인 심장 여진 수축 커플 링

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

세포 칼슘 이미징은 독특한 기능적 시그니처를 제공하는 칼슘 투과성 채널 / 수용체의 발현을 기반으로 개별 세포, 배양 또는 각성 동물의 혼합 집단에서 동적 신호 전달을 연구하는 다목적 방법론입니다.

칼슘 이미징 기술로 뉴런-글리아 회로의 변화 시각화

분리된 쥐 근세포에서 칼슘(Ca 2+) 과도 측정과 함께 근절 길이 검출을 통한 수축 기능의 측정을 설명하는 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 심부전 동물 모델에서의 연구에 대한이 접근법의 적용도 포함됩니다.

설치류 근육 세포에서 심장 수축 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상 분석

이 프로토콜은 수축하는 림프관에서 세포질, 유리 칼슘[Ca2+]i 및 혈관 직경을 동시에 측정한 다음 절대 Ca2+ 농도와 수축성/리듬 매개변수를 계산하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 실험 조건에서 Ca2+ 및 수축 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ 및 해당 수축성의 실시간 평가

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

배우세요 Fura-2 형광 프로브를 이용한 살아있는 세포 내 칼슘 농도 측정 시 NADH 신호 간섭을 보정하는 새로운 방법을. 심근세포에서 정확한 미토콘드리아 칼슘 역학 분석이 가능합니다.

라이브 셀에서 Fura-2-Analog를 이용한 세포내 Ca²⁺ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법

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