라이브 셀에서 Fura-2-Analog를 이용한 세포내 Ca2+ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법
2019년 9월 20일
NADH 및 fura-2 유사체의 여기 및 방출 파장의 스펙트럼 중첩으로 인해[Ca2+]의 정량 적 측정 중에 라이브 셀의 두 화학 물질의 신호 간섭이 불가피합니다. 따라서, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운 온라인 보정 방법이개발되었다[Ca2+]
UV 흥분성 복수 프로브는 자동 복수음으로 인해 고유 신호 오염을 가지게 된다. NADH의 대부분의 문제점은 복수 프로브의 사용을 제한하고 있다. NADH로부터의 외부 플로레시브를 정밀하게 교정하여, 오염되지 않은 다원 탐사 신호를 추출하기 위해 방법을 사용할 수 있다.
그 절차를 시연하는 것은 제 실험실에서 연구조교수인 이정훈 교수입니다. 심근세포가 튜브 의 바닥에 정착 할 수 있도록 한 후, 슈퍼 나탄을 흡인. 갓 준비된 밀리머 1밀리머 fura-2-FFAM 희석 용액을 섭씨 4도에서 60분간 2밀리리터로 셀에 라벨을 붙입니다.
인큐베이션이 끝나면, 수퍼를 제거하기 전에 37도 의 수조에 튜브를 똑바로 세워 30 분 동안 배치하십시오. 그런 다음 실온에서 보관할 수 있는 실온 배양 배지 4밀리리터를 추가합니다. 시투 동위 상층포라-2-ffa 포인트 식별을 위해 희석된 세포를 현미경 단계에 장착하고 세포가 바닥으로 가라앉을 때까지 3분을 기다린다.
NADH가 없는 섭씨 37도 칼슘 없는 용액을 세포 배양에 투입하고 표적 세포를 찾습니다. NADH 가 없는 칼슘 없는 용액을 재사용하기 전에 60초 동안 사포닌 용액을 사용하십시오. 동시에 450 및 500 나노미터에서 fura-2-ff 방출 신호를 측정하여 350 ~ 365 나노미터의 암분 스캔을 사용하여 0.1 나노미터 단계로 NADH가없는 칼슘없는 용액으로 다시 profuse.
다음으로 칼슘 없는 조건의 신호로부터 칼슘 포화 용액의 신호를 빼는다. 그런 다음 각 여기에서 배출의 표준 편차를 계산하고 개별 동면 점으로 최소 표준 편차 값을 나타내는 흥분 파장을 선택합니다. 다중 파라메트릭 측정 시스템을 사용하여 배경 신호를 감지하고 세포 영역 내의 신호를 수정하려면 현미경 욕조에 염료가 없는 세포를 장착하고 세포가 3분 동안 정착할 수 있도록 합니다.
NADH 칼슘이 없는 용액을 분당 2~3밀리리터로 약 5분 동안 욕조에 넣고 표적 세포를 커버하기 위해 물체 필드를 설정합니다. 셀을 필드 밖으로 이동한 후 셀이 없는 창의 배경 신호를 측정하고 신호를 오프셋으로 설정합니다. 그런 다음 셀을 초기 위치로 되돌리고 셀 배경 신호 및 셀 영역을 측정합니다.
R-factor를 계산하기 위해 획득 한 세포 배경 및 영역 신호를 사용하여 염료가없는 세포를 현미경에 재장착하고 칼슘이없는 용액을 주입합니다. malate 용액으로 세포 현탁액을 교화하기 전에 표시된 신호를 측정합니다. 신호를 측정한 후 피루바테 용액으로 세포를 풍부하게 한 다음, malate-pyruvate 용액 및 로테네용액을 풍부하게 합니다.
그런 다음 각 신호에 대한 경사를 계산합니다. 여기에 교정 전후의 미토콘드리아 칼슘의 변화가 나타난다. 그 결과 1.03플러스 또는 마이너스 0.13 마이크로몰라 및 최대 미토콘드리아 칼슘 이없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도를 가진 미토콘드리아 칼슘의 상당한 변화를 명확하게 밝혀 29.6 플러스 또는 마이너스 1.61 마이크로몰라의 한 마이크로몰라에서 최대 미토콘드리아 칼슘.
미토콘드리아 막 전위는 2나노몰라 TMRE의 풍부와 함께 모니터링되었다. 미토콘드리아 전위의 변화는 마이너스 150 밀리볼트의 초기 미토콘드리아 막 전위력을 기준으로 계산되었으며, 칼슘 첨가에 대한 반응으로 NADH의 감소를 입증하고 미토콘드리아 막 잠재력에 대한 무시할 만한 효과를 보였다. 미토콘디랄 pH는 카박스SNARF-1 하중에 의해 유도된 미토콘드리아 칼슘의 증가에 의해 영향을 받지 않았다.
잘못된 등약 점수로 인해 잘못된 R 및 NADH 보정이 발생합니다. 따라서 항상 세포가 없는 배경 과 셀 영역을 올바르게 측정하십시오. 이 기술은 생체 분석 유출에 있는 미토콘드리아 칼슘 동적 연구 결과를 준비하는 데 사용됩니다.
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개요
본 연구는 살아있는 세포에서 칼슘 농도를 측정할 때 NADH 및 fura-2 유사체로 인해 발생하는 신호 간섭 문제를 다룹니다. NADH 신호 오염이 존재하는 상황에서 [Ca2+] 측정의 정확도를 높이기 위해 새로운 온라인 보정법이 개발되었습니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 형광 측정 시의 신호 간섭
- 살아있는 세포 내 칼슘 측정
- 보정 기술의 개발
배경
- 들뜸 파장과 방출 파장의 스펙트럼 중첩은 측정을 어렵게 합니다.
- NADH는 형광 현미경에서 다중 프로브의 활용성을 제한할 수 있습니다.
- [Ca2+]의 정확한 측정은 세포 연구에서 매우 중요합니다.
사용된 방법
- fura-2를 이용한 형광 측정
- 근세포를 이용한 세포 분석
- 신호 보정 기술 및 배경 측정
주요 결과
- 미토콘드리아 칼슘 농도의 상당한 변화가 관찰됨.
- NADH 간섭을 보정하기 위한 체계적인 접근법을 개발함.
- 엄격한 실험 절차를 통해 해당 기술을 검증함.
결론
- 본 연구는 형광 측정 정확도를 향상시키는 방법을 성공적으로 입증하였습니다.
- 이는 세포 생물학의 정량 분석에 시사하는 바가 큽니다.
자주 묻는 질문
산업계 주요 관련성
정확한 세포 내 칼슘 측정은 약물 발견 과정의 타겟 검증, 특히 미토콘드리아 신호 전달 경로 분석에서 매우 중요합니다. NADH 자가형광은 fura-2 기반 분석법에서 상당한 간섭을 일으켜 데이터의 신뢰도를 떨어뜨리고 초기 스크리닝 단계에서 위양성률을 높입니다. 본 NADH 보정법은 실제 칼슘 신호를 분리함으로써 예측 신뢰도를 높이며, 심혈관 및 대사 타겟 프로그램의 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 질환 모델에서 치료 가설로서의 미토콘드리아 칼슘 처리 능력을 분석할 수 있게 합니다.
- 운영적 가치: NADH 자가형광을 실제 fura-2 신호와 분리함으로써 기전적 모호성을 줄여줍니다.
- 예측적 가치: 정량적이고 간섭 없는 칼슘 플럭스 측정을 통해 타겟 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 기저 NADH 보정 형광을 설정함으로써 후속 화합물 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 재현성: 등흡광점 결정을 통해 들뜸 파장 선택을 표준화하여 분석 간 변동성을 최소화합니다.
- 다중 분석 능력: 서로 다른 들뜸/방출 세트를 사용하여 NADH, 칼슘, 그리고 pH 또는 막 전위를 동시에 측정할 수 있도록 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 신경퇴행성 및 대사 질환의 미토콘드리아 기능 장애 모델에 직접 적용 가능합니다.
- 중개 연구의 연속성: 보정된 fura-2-FF 신호를 사용하여 발견 단계의 칼슘 플럭스 관찰 내용을 전임상 검증으로 연결합니다.
- 리스크 조정 추진: 미토콘드리아 칼슘 분석의 위양성 신호를 줄여 더욱 신뢰할 수 있는 go/no-go 결정을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 표적 가설 검증부터 리드 화합물 발굴, 그리고 전임상 기전 검증에 이르는 신약 발굴 연속 과정에 적합하며, 특히 미토콘드리아 표적에 특화되어 있습니다.
- 발견 생물학: 살아있는 세포 분석에서 대사 간섭으로부터 칼슘 의존적 신호를 분리함으로써 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 배경 감산 및 오프셋 보정을 통해 분석 준비도를 높여, 화합물 평가를 위한 신호 대 잡음비를 향상시킵니다.
- 분석: 450 nm 및 500 nm에서 보정된 방출광을 이용한 R-인자 계산을 통해 정량적 비례 측정(ratiometric measurement)을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: TMRE를 사용하여 칼슘과 미토콘드리아 막 전위를 동시에 모니터링함으로써 전임상 연구와 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 세포 유형 및 NADH 간섭이 발생하기 쉬운 형광 프로브에 적용 가능한 재사용 가능한 보정 프레임워크를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 칼슘 신호 전달에서 NADH로 인한 위양성을 제거함으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: 체계적인 등흡광점 식별 및 배경 감산을 통해 분석 표준화와 재현성을 개선합니다.
- 전략적 가치: 초기 단계의 스크리닝 캐스케이드에서 생물학적 노이즈를 줄여 더 정확한 go/no-go 결정을 지원합니다.
- 포트폴리오 영향: 신뢰할 수 있고 간섭 없는 기능적 판독을 통해 미토콘드리아 타겟의 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 형광 현미경 및 비례 측정 프로브(ratiometric probe) 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 파장 스캐닝 여기(350–365 nm) 및 이중 방출 검출(450 nm, 500 nm)이 가능한 장비가 필요합니다.
- 배경 신호 측정 및 오프셋 보정 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 이 방법을 서로 다른 무염색 세포 준비 워크플로우에 적용할 때 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 잘못된 등흡광점(isobestic point) 선택을 방지하기 위해 세포가 없는 배경 및 세포 영역 신호의 세심한 측정이 필요합니다.
