Name: 자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 자동 이미지 처리를 사용하여 효모 세포의 지질 방울을 정량 분석하는 방법을. BODIPY 염색과 MATLAB 파이프라인으로 고처리량 데이터를 생성하여 다양한 균주와 성장 조건을 비교할 수 있습니다.

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이 작품은 찰스 대학 보조금 PRIMUS / MED / 26, GAUK 1308217 및 SVV 260310에 의해 지원되었다. 우리는 현미경 검사법 및 이미지 분석 파이프 라인의 개발에 도움을 Ondřej Šebesta 감사합니다. 우리는 S. 세레비시아 균주에 대한 ReGenEx 실험실, 그리고 S. japonicus 균주에 대한 JapoNet과 히로노리 니키의 실험실에 감사드립니다. ppc1-88 균주는 효모 유전 자원 센터 일본에 의해 제공되었다. 현미경 검사법은 유럽 지역 개발 기금과 체코 공화국의 국가 예산에 의해 공동 으로 자금을 조달 공초점 및 형광 현미경 검사법의 실험실에서 수행되었다 (프로젝트 번호. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 및 CZ.2.16/3.1.00/21515).

1. 솔루션 및 미디어 준비
<ol><li>
지질 염색 용액을 준비하십시오.
	<ol>
<li>스톡 지질 염색 용액을 준비하려면 무수 DMSO 10 mL에 BODIPY 493/503 10 mg을 용해하십시오 (최종 농도 1 mg / mL). 계량 중 재료 손실을 방지하기 위해 10 mg BODIPY 493/503 바이알의 전체 함량을 용해하십시오. 주의 사항: DMSO는 피부를 통과할 수 있다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.</li>
		<li>1 mg/mL BODIPY 493/503 스톡 용액의 100 μL과 무수 DMSO 의 900 μL(최종 농도 0.1 mg/mL)을 혼합하여 작업 지질 염색 용액을 준비합니다.</li>
		<li>Aliquot 재고 및 작업 솔루션, -20 °C에서 저장합니다. 참고: 용해 된 BODIPY 493/503은 -20 °C에서 몇 년 동안 안정적입니다. 그러나 용액은 습기와 빛으로부터 보호되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 경계 시각화를 위한 스톡 솔루션을 준비하려면 2.5 mL의 탈이온수(최종 농도 10 mg/mL)에 캐스케이드 블루 덱젠(전체 바이알) 25 mg을 용해합니다. Aliquot 재고 용액을 -20 °C에서 저장하여 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드 코팅 용액을 준비하려면 탈이온수 5 mL (최종 농도 1 mg / mL)에 콩 렉틴 5 mg을 용해하십시오. 알리쿼트 렉틴 용액을 -80°C에서 보관한다. 참고: 렉틴 용액은 -80 °C에서 몇 년 동안 안정적입니다. 현재 사용 중인 알리쿼트는 -20°C에서 보관할 수 있다.</li>
	<li>
재배 매체를 준비합니다.
	<ol>
<li>S. pombe 및 S. japonicus에 대한 복잡한 YES 재배 배지 400 mL을 준비하려면 효모 추출물 2 g과 SP 보충제 0.1 g (보조 영양 돌연변이에 필요한 경우)을 500 mL 병및 오토 클레이브에 탈이온 수 340 mL에 녹입니다. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 20 % (w / v)의 60 mL을 추가하십시오.</li>
		<li>S. pombe 및 S. japonicus에 대해 정의된 EMM 재배 배지 400 mL를 준비하려면 500 mL 병 및 오토클레이브에 덱스트로오스없이 4.9 g의 EMM 국물을 360 mL의 탈이온수로 용해하십시오. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 40 mL (w / v)를 추가하십시오. 참고: S. pombe 및 S. japonicus 재배에 대한 일반적인 지침은 각각25 및26을참조하십시오.</li>
		<li>사카로미세세스 세레비시아에대한 복합 YPAD 재배 배지 300 mL를 준비하기 위해 효모 추출물 3 g, 펩톤 6 g, 아데닌 황산염 30 mg을 270 mL의 탈이온수 500 mL 및 오토클레이브에 용해시다. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 30 mL (w / v)를 추가하십시오.</li>
		<li>S. cerevisiae에 대해 정의된 최소 배지 300 mL을 준비하려면 500 mL 병및 오토 클레이브에 270 mL의 탈이온수에 효모 질소 염기 2 g (아미노산 제외)을 용해하십시오. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 30 mL (w / v)를 추가하십시오. 참고: S. 세레비시아 재배에 대한 일반적인 지침은27을참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 재배
<ol><li>
기하 급수적 또는 초기 고정 단계에 성장 S. pombe 또는 S. japonicus.
	<ol>
<li>아침에, 신선한 핵분열 효모 바이오매스와 YES 배지 의 5 mL을 접종. 32 °C에서 몇 시간 동안 흔들림 (180 rpm)으로 배양하십시오. 참고: 모든 재배의 경우, 적절한 폭기를 보장하기 위해 배양량의 10배를 갖는 Erlenmeyer 플라스크를 사용하십시오. 일부 실험실은 30 °C에서 핵분열 효모를 성장하는 것을 선호하지만 재배 온도가 32 °C로 생성되어 세포에 해로운 영향없이 두 배의 시간이 짧아지므로 실험25,28을 수행하는 데 필요한 총 시간이 줄어듭니다. .</li>
		<li>같은 날 늦은 오후(재배 후 최소 6시간 후)에 신선한 YES 배지를 10 mL 최종 배양 부피로 희석하여 다음 날 아침 원하는 광학 밀도(OD) (또는 세포 수/mL 수)에 도달하고 32°C에서 배양합니다. (180 rpm). 희석 계수를 정확하게 결정하기 위해 사용된 각 변형균의 두 배 시간을 아는 것이 장점입니다(수학식 1 사용). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> V배양이 희석에 필요한 전배양량이 있는 경우, Vfinal은 새로운 배양(표준 재배를 위한 10 mL)의 총 부피이며, OD final은 원하는 OD에 도달하게 된다. 다음 아침, OD 전류는 전배양의 현재 측정 된 OD, t는 수확까지 세포 성장의 시간, t지연은 지연 단계의 기간입니다 (실험실 조건에 따라 달라지며, 경험적으로 정의될 수 있음) 및 tDT는 변형의 두 배 시간입니다. 참고: 지수 상 세포를 분석 할 때, 이 극적으로 여러 후속 세대에 대한 세포 생리학 (LD 함량포함)을 변경으로 precultures가 고정 단계에 도달하지 못하게.</li>
		<li>이미징 날 아침에, 배양이 필요한 것보다 약간 더 높은 OD에 도달하면 (지수 상 세포의 경우), 신선한 YES로 희석하고 LDs의 염색 전에 적어도 두 배 더 배배 동안 배양을 계속하십시오. 염색(섹션 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기하급수및고정단계로 성장하는 S. 세레비시아.
	<ol>
<li>오후에, YPAD 배지의 10 mL을 소량의 신선한 신진 효모 바이오매스로 접종하고 30 °C에서 밤새 교배하여 흔들어 (180 rpm).</li>
		<li>이미징 당일 아침, YPAD 배지의 10 mL에서 OD 0.1로 배양을 희석하고 필요한 OD(예를 들어, 지수 상에 대한 OD 1)로 성장한다. 2.1.2단계에서 설명한 대로 모든 배양 희석을 수행합니다. 염색을 진행합니다(섹션 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 지질 방울 염색
<ol><li>이미지화할 각 샘플에 대해 현미경 커버 슬립을 준비합니다. 수평으로 배치된 파이펫 팁의 긴 면을 사용하여 깨끗한 커버 슬립에 슬라이드 코팅 용액 1 μL을 퍼뜨리십시오. 코팅 용액이 완전히 건조되고 커버 슬립을 먼지가 없는 환경에 보관하십시오. 참고: 필요한 경우 유리 슬라이드와 커버슬립을 사용하기 전에 청소할 수 있습니다. 세척 절차는 식기 세척 세제로 세척하고, 물로 헹구고, 3 % 염산을 하룻밤 동안 담그고, 증류수로 씻는 것으로 구성됩니다. 세척된 슬라이드와 커버슬립은 사용할 때까지 순수 에탄올에 보관됩니다.</li>
	<li>필요에 따라 세포 배양 또는 세포/mL 수를 측정합니다. 유사한 실험 조건을 보장하기 위해 모든 테스트 균주 중 유사한 값에 도달하려고합니다.</li>
	<li>각 세포 배양액의 피펫 1 mL을 1.5 mL 의 미세원원지 튜브로 배양한다. S. 세레비시아만을 위해, 슬라이드 코팅 용액의 5 μL을 추가하고, 소용돌이를 짧게 넣고, 30°C에서 5분 동안 흔들어 서 배양한다.</li>
	<li>지질 염색 용액의 1 μL을 각 배양 알리쿼트 및 소용돌이에 잠시 첨가한다. 그런 다음 세포 경계 시각화 용액의 10 μL을 잠시 추가하고 와류를 짧게 추가합니다. 참고: 이것은 BODIPY 493/503의 형광 담금질로 이끌어 내니까 두 얼룩의 미리 혼합된 해결책을 준비하지 마십시오.</li>
	<li>원심 분리 (1,000 x g, 3 분, RT)로 세포를 수집하고 거의 모든 상월체 (~ 950 μL)를 제거합니다. 나머지 상급의 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>렉틴 코팅 커버 슬립에 조밀 한 세포 현탁액의 피펫 2 μL 깨끗한 현미경 슬라이드에 놓습니다. 세포는 단층을 형성해야합니다. 이미징에서 유물을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 현미경 검사법 (섹션 4)으로 진행하십시오. 한 번에 최대 두 개의 샘플을 처리합니다.</li>
</ol>4. 현미경 및 화상 진찰을 설치하십시오
<ol><li>
이미징 조건을 최적화합니다. 참고: 현미경을 설정하려면 시료에 손상을 입히고 결과를 왜곡할 수 있는 강한 광원에 장시간 노출해야 합니다. 따라서 LD 정량화에 더 이상 사용되지 않는 전용 샘플 슬라이드를 사용하여 이미징 조건을 설정합니다.<ol>
<li>위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트(DIC)를 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다. 참고: 위상 대비 또는 DIC 이미지를 참조하기 위해 촬영할 수 있지만 자동화된 이미지 분석 단계에서는 사용되지 않습니다.</li>
		<li>z 스택 설정을 전체 셀 볼륨에 걸쳐 있도록 설정합니다. 총 수직 거리는 셀 크기에 따라 다릅니다. 광학 슬라이스의 수는 목표의 수치 조리개(z축의 점 분산 함수)에 따라 달라집니다. 중심 초점 평면을 기준으로 이동하도록 포커스를 설정합니다. 참고: 최적의 슬라이스 수는 종종 현미경 제어 소프트웨어에 의해 설정되며 수동으로 계산할 필요가 없습니다. 일반적인 세포 폭은 S. pombe의경우 3-5 μm, S. japonicus의경우 4-7 μm, S. cerevisiae의경우 3-7 μm입니다.</li>
		<li>이미지 LD를 위해, 녹색 채널에서 광 강도 및 노출 시간을 설정합니다(BODIPY의 여기 및 방출 최대값은 각각 493 및 503 nm임). 참고: BODIPY 493/503은 매우 밝은 불소입니다. 그러나, 그것은 지나치게 강한 빛 강도로 급속하 게 표백 얻을 수 있습니다. 또한 LD는 라이브 셀에서 이동하므로 노출 시간을 최소화하고 전체 녹색 채널 z 스택을 먼저 캡처하여 흐리게 아티팩트를 방지합니다. 또한 포화 픽셀을 피하기 위해 신호 강도에 대한 카메라의 선형 범위를 고려하십시오.</li>
		<li>셀 경계를 이미지화하려면 블루 채널에서 광 강도 및 노출 시간을 설정합니다(캐스케이드 블루 덱센의 여기 및 방출 최대값은 각각 400 및 420 nm임). 참고: 블루 채널의 신호 강도는 이미지 세분화에 필요하지만 LD 정량화 자체에는 사용되지 않습니다. 따라서 이 채널의 최적 설정은 분석에 중요하지 않습니다.</li>
		<li>가능하면 현미경 제어 소프트웨어에서 자동화된 실험 워크플로우를 만들어 표준화된 조건하에서 여러 시료를 쉽게 이미징할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징 조건이 최적화되면 정량화에 사용할 이미지 샘플을 사용할 수 있습니다. 4.1단계에서 설명한 대로 셀에 초점을 맞추고 녹색 및 파란색 채널로 이미지화합니다. 참고: 샘플 간 비교를 허용하려면 동일한 설정을 사용하여 모든 이미지를 수집해야 합니다. 샘플당 여러 뷰 필드를 이미지화하여 강력한 대표 데이터를 가져옵니다.</li>
	<li>파란색 및 녹색 채널 z 스택 이미지를 16비트 다층 TIFF 파일(예: 뷰필드당 두 개의 파일)으로 저장합니다. 해당 파일 이름에 "녹색" 또는 "파란색"이라는 단어를 포함합니다. 이미지 분석을 진행합니다(섹션 5).</li>
</ol>5. 이미지 분석
<ol><li>
획득한 이미지의 품질을 시각적으로 확인합니다.
	<ol>
<li>ImageJ29,30 또는 기타 적합한 이미지 분석 소프트웨어에서 현미경 이미지를 엽니다.</li>
		<li>수집 하는 동안 이동 하는 셀의 상당한 수를 포함 하는 모든 이미지 스택을 제거 (따라서 흐리게 아티팩트를 만든).</li>
		<li>청색 채널에서 고도로 형광비세포 입자를 포함하는 모든 이미지 스택을 제거합니다(예: 현미경 슬라이드 또는 커버 슬립의 먼지, 재배 매체의 불순물). 참고: 청색 채널에 있는 아주 밝은 비 세포 객체는 세포 탐지 아티팩트를 만들거나 그들의 부근에 있는 세포의 탐지를 방해할 수 있습니다.</li>
		<li>죽은 세포의 큰 비율을 포함하는 모든 이미지 스택을 제거 (즉, 살아있는 세포에 비해 증가 된 파란색 형광세포). 참고: 견본에 있는 죽은 세포의 작은 비율의 존재는 전형적으로 문제가 되지 않으며 이 세포는 분석 도중 자동적으로 버려지는 동안, 몇몇 죽은 또는 정지한 세포는 때때로 분할 알고리즘에 의해 살아있는 세포로 인식될 수 있고 이렇게 보고된 결과를 왜곡합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MATLAB 소프트웨어에서 이미지를 분석합니다.
	<ol>
<li>기본 폴더를 만들고 모든 MATLAB 스크립트를 이 위치에 복사합니다.</li>
		<li>하위 폴더("pombe", "cerevisiae" 또는 "japonicus")를 만들고 입력 된 TIFF 이미지 파일을 이 위치에 복사합니다.</li>
		<li>MATLAB을 시작하고 MAIN.m을 열고 실행합니다. 메뉴에서 분석할 효모 종을 선택하고 이미지 처리를 시작합니다. 참고: 세포 및 LD 검출에 필요한 매개 변수 중 일부는 특정 종에 대해 미리 설정되어 있으며, 다른 매개 변수는 이미지 처리 중에 자동으로 결정됩니다. 미리 설정된 값은 경험적으로 결정되었으며 객관적인 배율, 카메라 유형 및 감도 및 이미징 설정과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 필요한 경우 사용자는 실험 설정을 더 잘 반영하도록 스크립트 파일을 편집하여 유기체별 사전 설정을 변경할 수 있습니다. 즉, 셀 인식 중에 허용되는 개체 크기는 "minArea" 및 "maxArea" 매개변수에 의해 지정되고 개체 경계 내에서 채워진 볼륨의 최소 분율은 "솔리드티" 매개변수에 의해 지정됩니다. LD 인식의 경우 밝기 임계값은 "th" 매개변수(해당 값은 주로 이미지 비트 깊이 및 형광 신호 강도에 의해 영향을 됨)에 의해 주어지며, 허용되는 최대 LD 크기는 "MaxArea" 매개변수에 의해 제공됩니다.</li>
		<li>스프레드시트 편집기 또는 통계 패키지를 사용하여 필요에 따라 출력 파일을 검사하고 처리합니다. 워크플로는 세미콜론으로 분리된 CSV 파일과 감지된 셀 개체 및 LD가 있는 분할된 TIFF 파일을 생성합니다. 참고: 워크플로는 이미지를 배경 및 셀 개체로 분할하며, 여기서 각 셀 개체는 여러 개의 인접한 셀로 구성될 수 있습니다. 따라서 "xxxx_cells.csv" 파일의 출력은 단일 셀 데이터를 나타내지 않으며 셀 단위 단위 메트릭을 계산하는 데만 사용해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

지질 대사와 그 조절에 대한 이해는 기본적인 생물학, 임상 및 생명 공학 응용 분야 모두에 중요합니다. LD 함량은 세포의 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타내며, 형광 현미경 검사법은 LD 함량 측정에 사용되는 주요 방법 중 하나이다. 제시된 프로토콜은 세 가지 상이하고 형태학적으로 구별되는 효모 종에서 개별 LDs의 자동 검출 및 정량적 설명을 허용합니다. 우리가 알고 있는 것은 핵분열 효모에 대해 유사한 도구가 존재하지 않습니다. 이미지 처리에 필요한 MATLAB 스크립트는 보충 파일로 포함되어 있으며, 이 원고의 모든 원시 및 처리 된 이미지 및 표 데이터와 함께 Figshare 저장소 (DOI 10.6084 / m9.figshare.7745738)에서 사용할 수 있습니다. CSV 출력 파일에 대한 자세한 설명과 다운스트림 데이터 분석 및 시각화를 위한 R 스크립트를 제공합니다. 또한 최신 버전의 MATLAB 스크립트는 GitHub(https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analy...

지질세포 에너지와 탄소 대사, 막 성분 합성, 생리활성 물질 생산에 중요한 역할을 합니다. 지질 대사는 환경 조건, 영양소 가용성 및 세포 주기 단계1에 따라 미세 조정됩니다. 인간에서는, 지질 물질 대사는 비만, 타입 II 당뇨병 및암 2와 같은 질병에 연결되었습니다. 산업에서 효모와 같은 미생물에 의해 생성 된 지질은 재생 가능한 디젤 연료의 유망한 원천을 나타냅니다3. 세포는 소위 지질 방울에 중립 지질을 저장 (LDs). 이러한 진화적으로 보존된 바디는 트리아실글리세롤, 스테릴 에스테르, 외부 인지질 단층 및관련 단백질 1로 구성된다. LDs는 자 구 체 망상에서 유래, 세포 주기 또는 성장 단계 역학을 발휘, 세포 지질 항상성에 대 한 중요한1. LD 수 및 형태는 다양한 성장 조건 하에서 지질 대사를 또는 돌연변이의 패널을 스크리닝할 때 편리한 프록시로 사용될 수 있다. 그들의 동적 특성을 감안할 때, 개별 LDs의 특성을 분석 할 수있는 기술은 지질 대사의 연구에 특히 관심이 있습니다.
다양한 효모 종은 지질 관련 대사 경로 및 이들의 조절을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 또는 흥미로운 화합물 또는 연료를 생산하기 위해 생명 공학에 사용되어왔다1. 또한, 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아 또는 원거리 관련 핵분열 효모 인 Schizosaccharomyces pombe,게놈 전체 결실 균주 라이브러리와 같은 모델 효모의 경우 높은 처리량에 사용할 수 있습니다. 화면4,5. 최근 LD 조성 및 역학은 S. pombe6,7,8,9,지질 대사와 관련된 돌연변이체가 신흥 모델 효모에서 분리되어 설명되어 왔다. Schizosaccharomyces japonicus10.
LD 함량과 역학을 연구하기 위해 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 대부분은 나일 레드 또는 BODIPY 493/503과 같은 친유성 염료를 가진 LDs의 얼룩의 어떤 종류를 채택합니다. 후자는 인지질(membranes)11과반대로 보다 좁은 여기 및 방출 스펙트럼, 및 중성 지질(LDs)을 향한 특이성을 증가시키는 것을 나타낸다. 형광및 유동세포측정법은 저장지질함량12,13,14,15에영향을 미치는 유전자 및 성장조건을 밝히기 위해 다양한 곰팡이종에 성공적으로 사용되어 왔다. 이 방법은 높은 처리량 응용프로그램에 적합하더라도, 성장 조건과 유전형 사이에서 극적으로 다를 수 있는 세포에 있는 개별 적인 LDs의 수 그리고 형태를 측정할 수 없습니다. 코히런트 라만 산란 또는 디지털 홀로그램 현미경 은 LD 수준의 데이터를 산출하는 라벨없는 방법이지만, 전문 고가의 장비16,17,18이필요합니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 일반적으로 이용 가능한 계기 및 심상 분석 소프트웨어 공구를 이용하는 동안, LD 내용에 상세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 여러 분석 워크플로우가 존재하며 이미지 데이터에서 셀/LD 검출에서 다양한 수준의 정교함과 자동화를 특징으로 하며, 큰 LDs19,20을 가진 메타조안 셀과 같은 다양한 세포 유형에 최적화되어 있습니다. , 21, 또는 신진 효모17,22,23. 이러한 방법 중 일부는 2D(예: 최대 프로젝션 이미지)에서만 작동하며, 이는 셀룰러 LD 콘텐츠를 안정적으로 설명하지 못할 수 있습니다. 우리의 지식에, 분열 효모 현미경 데이터에서 LD 내용 그리고 형태학의 측정을 위한 아무 공구도 존재하지 않습니다. 자동화되고 강력한 LD-레벨 분석의 개발은 증가된 감도와 향상된 통계적 힘을 가져다 줄 것이며, 여러 효모 종에서 이상적으로 중성 지질 함량에 대한 풍부한 정보를 제공합니다.
우리는 효모 세포의 3D 형광 현미경 심상에서 LD 내용 분석을 위한 워크플로우를 개발했습니다. 살아있는 세포는 각각 LD를 시각화하고 세포 경계를 결정하기 위해 BODIPY 493/503 및 캐스케이드 블루 덱스터넨으로 염색됩니다. 세포는 유리 슬라이드에 고정되고 표준 epifluorescence 현미경을 사용하여 z 스택 화상 진찰을 행합니다. 그런 다음 통계 분석을 위해 널리 사용되는 (상업적) 패키지인 MATLAB에서 구현된 자동화된 파이프라인에 의해 이미지가 처리됩니다. 파이프라인은 이미지 전처리, 세분화(셀 대 배경, 죽은 셀 제거) 및 LD 식별을 수행합니다. 그런 다음 LD 크기 및 형광 강도와 같은 풍부한 LD 수준 데이터가 주요 스프레드시트 소프트웨어 도구와 호환되는 테이블 형식으로 제공됩니다. 이 워크플로우는 S. pombe24에서지질 대사에 대한 질소 공급원 가용성의 영향을 결정하는 데 성공적으로 사용되었다. 우리는 지금 세포 LD 내용에 영향을 미치는 성장 조건 또는 돌연변이를 사용하여 S. pombe, S. japonicus 및 S. cerevisiae에있는 워크플로우의 기능을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>12비트 단색 CCD 카메라 하마마츠 ORCA C4742-80-12AG</td><td>하마마츠</td><td>&nbsp;</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>아데닌 헤미설페이트 염, &ge; 99%</td><td>머크</td><td>A9126-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td><td>중성 지질 염색을 위한</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td></tr><tr><td>D-(+) - 포도당, &ge; 99.5%</td><td>머크</td><td>G7021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, 음이온성, 라이신 고정성</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>세포의 음성 염색을 위한</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, &ge; 99.5%</td><td>Merck</td><td>D4540</td><td>이상의 순도, 분자체에 무수 유지</td></tr><tr><td>포도당 없이 EMM 국물</td><td>Formedium</td><td>PMD0405</td><td>medium은 개별 구성 요소에서 준비할 수도 있습니다</td></tr><tr>.<td>Fiji/ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>&nbsp;</td><td>또는 이에 상응하는 것; 현미경 데이터의 육안 검사를 위해</td></tr><tr><td>고정밀 커버 글라스, 22 mm x 22 mm, No 1.5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td>은 <td>어떤 # 1.5 커버 글라스</td></tr><tr><td>이미지 처리 도구 상자 MATLAB, 버전 10.0</td><td>Mathworks</td><td>를 사용합니다.</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine max (대두)의 렉틴슬라이드</td><td>의 세포 고정을 위한</td> <td>Merck</td><td>L1395</td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어, 버전 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 26 mm x 76 mm, 1 mm 두께</td>의 <td>니트 유리</td><td>L762601.2</td><td>현미경 스테이지에 맞는 모든 현미경 슬라이드를 사용하고, 세포를 로드하기 전에 철저히 청소하십시오</td></tr>. <tr><td>자동 z축 대물렌즈 이동 기능이 있는 Olympus CellR 현미경</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>펜타밴드 필터 세트</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td><td>명시야, 녹색 및 청색 채널로 충분</td></tr><tr><td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, 버전 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SP 보충제</td><td>Formedium</td><td>PSU0101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MATLAB을 실행할 수 있는 표준 사무용 컴퓨터</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, 버전 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>미생물학을 위한 범용 펩톤 M66</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UPLSAPO 60XO 대물</td><td>렌즈 Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아미노산이 없는 효모 질소 기반</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

지질 대사와 그 조절은 기본 및 응용 생명 과학 및 생명 공학 모두에 관심이 있습니다. 이와 관련하여, 다양한 효모 종은 지질 대사 연구 또는 산업 지질 생산의 모델로 사용된다. 지질 방울은 매우 동적인 저장 체이며, 그들의 세포 함량은 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타낸다. 형광 현미경 검사법은 널리 이용 가능한 장비에 의존하고 개별 지질 방울의 분석을 허용하기 때문에, 세포 지질 방울의 정량분석을 위한 선택의 방법입니다. 또한 현미경 이미지 분석을 자동화하여 전체 분석 처리량을 크게 높일 수 있습니다. 여기에서, 우리는 3개의 다른 모형 효모 종에 있는 개별 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명을 위한 실험및 분석 워크플로우를 기술합니다: 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe 및 Schizosaccharomyces japonicus,그리고 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아. 지질 방울은 BODIPY 493/503으로 시각화되고, 세포 불투과성 형광 덱젠은 세포 경계를 식별하는 데 도움이 되는 배양 배지에 첨가된다. 세포는 녹색과 청색 채널에 있는 3D epifluorescence 현미경 검사법을 복종하고 생성된 z 스택 심자는 MATLAB 파이프라인에 의해 자동적으로 처리됩니다. 이 절차는 주요 스프레드시트 또는 통계 패키지의 다운스트림 분석에 적합한 표 형식으로 셀룰러 지질 액적 함량 및 개별 지질 액적 특성에 대한 풍부한 정량적 데이터를 출력합니다. 우리는 세포 지질 대사에 영향을 미치는 다양한 조건 하에서 지질 방울 함량의 예 분석을 제공합니다.

전체 절차는 핵분열 효모에 대해 그림 1에 요약되어 있으며(신진 효모 워크플로우는 유사함), 아래는 알려진 다양한 조건하에서 3가지 다른 효모 종에서 LD 함량을 연구하는 데 워크플로우가 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 예를 제공합니다. 세포 LD 콘텐츠에 영향을 미칩니다. 각 예는 단일 생물학적 실험을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889fig01v2.jpg"> 그림 1: 실험 및 분석 워크플로우의 회로도. 핵분열 효모에 대한 워크플로우가 예로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59889/59889fig01v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 ...

여기에서, 우리는 핵분열과 신진 효모 세포의 형광 현미경 심상에 있는 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명의 MATLAB 구현을 제시합니다.

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

이 프로토콜은 다양한 효모 종에서 세포 저장 지질 함량의 정량적 소규모 및 대규모 분석을 용이하게하고 편견과 표준화 된 방식으로 그렇게합니다. 이 기술은 현미경 이미지의 신속한 처리를 허용하고 다양한 조건에서 재배된 다양한 돌연변이및 세포와 같은 샘플을 쉽게 비교할 수 있는 상세한 정량적 출력을 제공합니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 염색 솔루션, 배양 미디어 및 셀을 준비합니다.실험을 실행하기 전에 세포가 건강하고 원하는 성장 단계에서 있는지 확인하십시오. 다음으로, 각 시료를 이미지화할 현미경 커버슬립을 준비한다. 슬라이드 코팅 용액 1마이크로리터를 수평 으로 배치된 파이펫 팁의 긴 면을 사용하여 깨끗한 커버슬립에 펴놓습니다.코팅 용액이 완전히 건조한 다음 커버립을 먼지가 없는 환경에 보관할 수 있습니다. 다음으로, 세포 배양의 광학 밀도를 측정하고, 배양이 동일한 성장 단계에서 분석될 수 있도록, 비교 가능한 실험 조건을 보장하기 위해 시험된 모든 배양들 사이에서 유사한 값에 도달하려고 노력한다. 그런 다음, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 세포 배양의 파이펫 1 밀리리터.S.cerevisiae 세포의 경우 슬라이드 코팅 용액 5 마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 그런 다음 모든 미세 원심 분리기 튜브를 잠시 소용돌이쳐 5 분 동안 흔들어섭 30도에서 배양하십시오. 다음으로, 각 배양 알리쿼트에 지질 염색 용액의 마이크로리터 1개를 추가하고 잠시 소용돌이를 가합니다.그런 다음 셀 경계 시각화 용액의 10 마이크로리터를 추가하고 두 번째로 잠시 소용돌이를 가합니다. 실온에서 3분 동안 1, 000배 의 중력으로 원심분리하여 세포를 수집합니다. 회전이 완료되면, 상체에서 950 마이크로 리터를 제거하고 파이펫을 사용하여 나머지 상체에 있는 세포를 다시 중단합니다.다음으로, 조밀한 셀 서스펜션의 피펫 2마이크로리터가 렉틴 코팅 커버슬립에 들어있습니다. 그런 다음, 커버슬립을 깨끗한 현미경 슬라이드에 놓고 세포 단층층을 형성하고 가능한 한 빨리 현미경 검사로 진행하여 이미징의 아티팩트를 최소화합니다. 현미경을 설정하려면 시료에 손상을 입히고 결과를 왜곡할 수 있는 강력한 광원에 긴 노출이 필요합니다.따라서, 지질 적물 정량화에 더 이상 사용되지 않는 전용 샘플 슬라이드를 사용하여 이미징 조건을 설정합니다. 전용 샘플을 위상 대조 또는 차동 간섭 대비 현미경 설정의 단계에 배치하고 세포에 집중합니다. 현미경의 소프트웨어에서 Z 스택 설정을 설정하여 전체 셀 볼륨에 걸쳐 있습니다.총 수직 거리는 셀 크기에 따라 달라지며 광학 슬라이스 수는 목표의 숫자 조리개에 따라 다릅니다. 다음으로 중앙 초점 평면을 기준으로 이동하는 초점을 설정합니다. 지질 방울을 이미지화하기 위해 녹색 채널에서 빛의 강도와 노출 시간을 실험적으로 설정합니다.BODIPY는 빠르게 표백 될 수있는 매우 밝은 불소크롬이기 때문에 이미징 시주의하십시오. 또한 노출 시간을 최소화하여 과포화를 방지합니다. 모바일 지질 방울을 흐리게 하지 않도록 파란색 채널로 전환하기 전에 전체 녹색 채널 Z 스택을 먼저 캡처합니다.셀 경계를 이미지화하려면 파란색 채널에서 광 강도 및 노출 시간을 실험적으로 설정합니다. 가능하면 현미경 제어 소프트웨어에 자동화된 실험 워크플로우를 설정하고 사용하여 표준화된 조건에서 여러 샘플의 이미징을 용이하게 합니다. 중요한 것은 모든 이미지를 동일한 설정을 사용하여 수집해야 샘플을 적절히 비교할 수 있어야 합니다.이미징 조건이 최적화되면 세포에 초점을 맞추고 녹색 채널과 파란색 채널 모두에서 이미지합니다. 샘플당 여러 뷰 필드를 이미지하여 강력하고 대표적인 데이터를 얻습니다. 파란색 및 녹색 채널 Z 스택 이미지를 16비트 다층 TIFF 파일로 저장합니다.해당 파일 이름에 녹색 또는 파란색 단어를 포함해야 합니다. ImageJ에서 현미경 이미지를 열고 획득 하는 동안 이동 하는 셀의 상당수를 포함 하는 이미지 스택을 제거 합니다. 이러한 위치는 개별 Z 섹션의 다른 위치에 나타납니다.다음으로, 파란색 채널에서 형광이 높은 비세포 입자를 포함하는 이미지 스택을 제거합니다. 이것은 수시로 재배 매체에 있는 화상 진찰 표면에 먼지 또는 불순물로 기인하고 그들의 부근에 있는 세포의 검출을 방해할 수 있습니다. 또한 죽은 세포의 큰 비율을 포함하는 이미지 스택을 제거합니다.이러한 이미지는 살아있는 세포에 비해 증가 된 청색 형광을 가진 세포를 표시합니다. 샘플에 있는 몇몇 죽은 세포의 존재는 전형적으로 문제가 되지 않으며 이러한 세포는 분석 도중 자동으로 버려지는 동안, 몇몇 죽은 또는 죽어가는 세포는 때때로 분할 알고리즘에 의해 살아있는 세포로 인식될 수 있고 그러므로 보고된 결과를 왜곡할 수 있습니다. MATLAB에서 분석을 시작하려면 먼저 메인 폴더를 만들고 모든 MATLAB 스크립트를 이 위치에 복사합니다.다음으로 다양한 효모 종의 이름이 있는 하위 폴더를 만들고 각 TIFF 이미지를 이러한 위치에 복사합니다. 이제 MATLAB을 시작하고 스크립트 메인을 엽니다. m, 스크립트를 실행합니다.메뉴에서 분석할 효모 종을 선택하고 이미지 처리를 시작합니다. 스프레드시트 편집기 또는 통계 패키지를 사용하여 필요에 따라 출력 파일을 검사하고 처리합니다. 워크플로는 세미콜론 분리 CSV 파일과 감지된 셀 개체및 지질 물방울이 있는 세그먼트TIFF 파일을 생성합니다.여기에 도시된 야생형 S.pombe 세포는 복잡한 YES 배지 또는 정의된 EMM 배지에서 재배되었다. YES 배지에서 자란 세포에 비해, EMM 배지에서 세포 부피의 단위당 지질 방울과 더 높은 염색 강도가 검출되었다. 더욱이, EMM 배지에서 형성된 개별 지질 방울은 더 크고 총 염색 강도가 증가하였다.이것은 EMM에서 자란 세포에 있는 증가한 저장된 지질 함량의 이전 사실 인정과 일치합니다. 다음으로, 이러한 이미지는 YES 배지에서 자란 기하급수적이고 초기 고정 된 배양에서 S.japonicus 세포를 보여줍니다. 정지 된 단계를 입력 하는 세포 는 볼륨 정규화 된 지질 방울 형광 강도 두 조건 사이 약간 감소 하는 동안 세포 볼륨의 단위 당 지질 물방울의 현저 하 게 감소 수를 보였다.초기 고정 형 지질 물방울은 일반적으로 적당히 크기가 적당히 더 크고 기하급수적으로 성장하는 세포에서 물방울에 비해 적당히 더 높은 총 형광 강도를 가졌다. S.cerevisiae 세포에서 기하급수적으로 성장 하는 세포대 고정 된 단계 대 기하 급하 성장 세포에 비해 부피의 단위 당 다소 적은 지질 방울을 포함. 그러나, 그들의 볼륨 정규화된 물방울 형광 강도는 거의 두 배로 증가했습니다.전반적인 지질 방울 함량의 이러한 급격한 증가는 고정 된 단계에서 개별 지질 방울의 훨씬 더 높은 형광 강도와 부피 때문이었습니다. 이 절차에 따라 출력 데이터를 R과 같은 통계 패키지에 집계하여 요약된 결과 플롯을 만들고 지질 방울 함량의 관찰된 차이점에 대한 통계 테스트를 실행할 수 있습니다. 원칙적으로, 이미지 처리 파이프라인은 다른 미생물의 지질 방울 함량을 분석하거나 다른 점과 같은 세포극 구조를 분석하는 데 사용될 수 있다.

analysis-lipid-droplet-content-fission-budding-yeasts-using-automated

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 조사 스캔 전기 분무 이온화 질량 분광법 (ESI / MS)를 사용하여 효모의 수많은 지질 수종을 식별하기위한 새로운 양적 lipidomics 방법을 설명합니다. 이 방법은 현재 lipids, 감도 및 속도의 다양한 분자 형태를 해결하는 능력 지질 식별 및 부량 사용할 방법을 초과했습니다.

전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

여기, 우리가 셀 높은 처리량 실험에서 경작된에 triacylglycerols의 역학을 공부 하는 지질 작은 물방울 인덱스 (LD)를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. LD 인덱스 분석 결과 BODIPY 493/503을 사용 하는 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 분석 결과 dispendious 지질 추출 또는 현미경 분석 필요 하지 않습니다.

곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

이 프로토콜은 다중 색상 4D (타임 랩스 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광 표지 된 세포 내 구획의 분석을 설명합니다. 이미징 매개 변수는 광손상을 제한하면서 적절한 신호를 캡처하도록 선택됩니다. 사용자 정의 ImageJ 플러그인은 레이블이 지정된 구조를 추적하고 정량적으로 분석할 수 있도록 합니다.

효모의 4D 현미경 검사법

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

여기에서 우리는 간 조직의 지질 액적 특성 분석을 위해 최적화된 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜을 입증합니다. 직교 투영 및 3D 재구성의 사용을 통해 형광단은 미세소포와 대소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 가능하게 하고 간 지방증 평가를 위한 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

본 연구는 온전한 근육 부피를 통해 근육 내 지방 조직(IMAT) 침착을 시각화 및 정량화하고 IMAT를 구성하는 개별 지방 세포의 메트릭을 정량화하기 위한 탈세포화 기반 방법론을 설명합니다.

골격근 지방 침윤의 탈세포화 기반 정량화

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

지방파지(Lipophagy)는 지질 방울의 분해를 포함하는 선택적 형태의 자가포식입니다. 이 과정의 기능 장애는 암 발병과 관련이 있습니다. 그러나 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 자가포식, 지질 대사 및 암 진행 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위한 정량적 이미징 접근 방식을 설명합니다.

Lipophagy를 통한 지질 방울 이화작용의 조절 탐구

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

배우세요 자동 이미지 처리를 사용하여 효모 세포의 지질 방울을 정량 분석하는 방법을. BODIPY 염색과 MATLAB 파이프라인으로 고처리량 데이터를 생성하여 다양한 균주와 성장 조건을 비교할 수 있습니다.

자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석

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