Name: 루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 배우세요 BIRFLU 이중 리포터 시스템을 이용한 인플루엔자 A 바이러스 감염의 실시간 이미징 및 정량화 방법을. 이 기술은 형광과 생물발광을 동시에 검출하여 항바이러스 효능 및 면역 반응 평가에 활용됩니다.

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LM-S 실험실에 있는 인플루엔자 바이러스에 대한 연구는 부분적으로 뉴욕 인플루엔자 우수 센터 (NYICE)에 의해 투자됩니다 (NIH 272201400005C), 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수성의 NIAID 센터의 회원 (CEIRS) 계약 번호. HHSN272201400005C (NYICE) 및 국방부 (DoD) 동료 검토 의학 연구 프로그램 (PRMRP) 교부금 W81XWH-18-1-0460.

저자는 공개 할 것이 없다.

연구원은 바이러스 복제 및 병인의 현재 이해를 이해하고 확장하는 중요한 분자 도구로 재조합 기자 발현 바이러스에 의존했다26,27,28, 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34세 , 35세 , 36세 , 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 54. 가장 일반적으로 선호되는 리포터 유전자는 루시퍼라제와 형광 단백질이며, 주로 식별의 기술 발전, 개선 된 변이체 개발 및 이미징 기술에 의한 검출으로 인한 것입니다43 , 44세 , 45세 , 46세 , 47세 , 48. 재조합 기자 바이러스는 종종 바이러스 학적 검사를 가속화하고, 시험관 내 및 생체 내 바이러스의 역학을 연구하고, 현재 승인 또는 새로운 백신 및 치료 접근법의 효과를 테스트하기 위해26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. 불행하게도, IAV의 경우, 과거 연구는 26,27,28,29를 수행 할 수있는 연구의 유형을 방해 단일 기자 유전자의 발현에 국한되었다 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34세 , 35세 , 36세 , 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 54. 이러한 제한을 피하기 위해, 우리는 Nluc 루시퍼라제 및 비너스 형광 단백질 (BIRFLU)을 발현하는 복제 유능한 이중 리포터 IAV를 생성했습니다.
이 보고서에서, 우리는 비르플루의 시험관 내 특성화 및 비르플루를 사용하여 IAV 감염의 마우스 모델을 사용하여 생체 내 바이러스 감염을 추적하는 실험적 접근법을 기술한다. BIRFLU Nluc 및 금성 발현은 바이러스 성 역가와 상관관계가 있습니다. 또한, BIRFLU는 안정적으로 유지되었고 감염된 마우스의 폐로부터 회수된 후에도 두 리포터 유전자를 계속 발현하였다. 이 접근법은 연구원에게 IAV 감염의 처리를 위한 새로운 치료 대안의 확인 그리고 개발을 포함하여 배양된 세포 및 동물 모형에 있는 IAV를 공부하는 좋은 기회를 제공합니다.
BIRFLU는 PR8의 백본을 사용하여 생성되었지만, 다른 유형, 아류형 또는 바이러스 성 변형 백본을 사용하여 다른 재조합 IAV는 동일한 실험 접근법을 사용하여 생성 될 수있다. 마찬가지로, 이 보고서에서는 IAV의 마우스 모델에서 BIRFLU를 사용하기 위한 실험 절차를 설명했습니다. 그러나 BIRFLU는 다른 동물 모델에서 IAV 감염을 평가하는 귀중한 기술이 될 수 있습니다.

인플루엔자 A 바이러스(IAV)는 정형재증소비리대 패밀리 1,2,3의단일 가닥 네거티브 센스 분할 RNA 바이러스이다. 세계보건기구(WHO)는 연간 3~500만 건의 인플루엔자 발생과 전 세계적으로 250,000명 이상의 사망자를 추정하고 있으며, 4,5,6. 특히 인플루엔자에 취약한 그룹은 노인, 면역손상개인, 어린이7,8,9,10,11을포함한다. 백신을 사용할 수 있고 바이러스 감염에 대한 가장 일반적이고 효과적인 개입을 나타내지만, IAV는 급속하게 진화하고 기존의 면역을탈출 할 수 3,12,13, 14세 , 15. 2009 년 전염병 H1N1 균주의 재출현과 병원성 IAV의 출현은 전 세계적으로 인간의 공중보건에 대한 지속적인 위협을 반복4,16.
전염병이나 전염병 동안 새로 고립 된 바이러스의 병원성과 투과성을 신속하게 결정하는 것이 중요합니다. 현재 바이러스를 검출하기 위해 이용 가능한 기술은 시간이 많이 걸리고 때로는 이러한 분석17,18,19,20의완료를 지연시킬 수 있는 힘든 접근법의 사용을 필요로 한다. 더욱이, 현재 바이러스성 희소한 안산은 발발의 사건 도중 필요할 수 있던 확장하기 어렵습니다. 마지막으로, 마우스, 기니 피그 및 페렛과 같은 감염의 검증된 동물 모델의 사용은 일상적으로 사용되며 인플루엔자 감염, 면역 반응 및 새로운 백신 및/또는 항바이러스제의 효능을 연구하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 이 모형은 실시간으로 바이러스성 역학을 관찰하는 무능력 때문에 제한적입니다; 이것은 바이러스 성 감염의 정적 화상 진찰에 연구 한계21,22,23,24,25. 이러한 공소사에 사용되는 동물은 또한 바이러스 하중을 결정하기 위해 안락사되고, 따라서 이러한 연구를 완료하는 데 필요한 동물의 수를 증가시킨다26. 이러한 모든 한계를 우회하기 위해 많은 연구자들은 바이러스 학적 검사를 가속화하고 생체 내 바이러스 부하 및 보급을 실시간으로 감지 할 수있는 재조합 복제 유능한 리포터 표현 IAV의 사용에 의존합니다26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. 중요한 것은, 이러한 리포터 발현 IAV는 감염33,42의세포 배양 및 동물 모델에서 야생형(WT) IAV와 유사하게 복제할 수 있다.
형광 및 생물 발광 단백질은 감도, 안정성 및 사용 용이성으로 인해 연구원이 일반적으로 사용하는 두 가지 리포터 시스템입니다. 또한 형광 및 생물 발광 단백질 검출 기술 43,44,45,46,47,48에 대한 엄청난 지원과 발전이 있습니다. . 형광 단백질과 루시퍼라제는 빛을 발할 수 있는 다른 성질을 가지며, 특히 흥분된 상태가생성되는 방식과 방출이 검출되는 방식이 43,44,45, 46,47,48. 형광 단백질은 먼저 에너지를 흡수함으로써 흥분되며, 이는 분자가 더 낮은 에너지 상태(43)로감소함에 따라 상이한 파장에서 빛으로 방출된다. 한편, 생물발광은 빛을 생성하기 위해 기질, 산소 및 때로는 ATP를 수반하는 화학적 열성반응으로부터 유래된다(45). 리포터 단백질의 이 2가지 모형의 변화하는 속성 때문에, 관심의 연구 결과에 따라 다른 것보다 어쩌면 더 유리한 것. 형광 단백질은 세포 국소화를 관찰하기 위해 널리 사용되는 반면,41,생체 내 신호는 부적절한 강도를 가지며 종종 살아있는 조직49에서자가형광에 의해 가려집니다. 따라서 연구자들은 살아있는 유기체에서 바이러스 역학을 평가하기 위해 luciferases에 의존하지만, 형광 단백질은 생체 내 연구50,51,52,53에선호될 수 있다. 형광성 단백질과 는 달리, 루시퍼라제는 생체 내 연구에 더 편리하며 비침습적 접근법26,27,28,29,30에 더 적합합니다. , 31세 , 32세 , 33세 , 34세 , 35세 , 36세 , 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 54. 궁극적으로, 연구의 유형에 따라, 연구원은 기능과 감도의 절충에 자신의 연구를 과목, 심각하게 자신의 판독으로 형광 또는 루시 퍼라제 기자 단백질중 하나를 선택해야합니다 재조합 리포터 바이러스의 유용성을 제한합니다. 더욱이, 형광 또는 루시퍼라제 시스템 및 바이러스성 복제 또는 보급을 이용한 다른 리포터 유전자의 발현 간의 상관관계에 관한 우려가 있으며, 이는 획득한 데이터의 해석을 위태롭게 할 수 있다. 리포터 표현 IAV.
우리는 동일한 바이러스 게놈55에서 형광 및 루시퍼라제 단백질 둘 다에 대해 인코딩하는 재조합 복제 유능한 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 생성함으로써 이러한 한계를 극복하였다(도 1). 여기서, 나노루크 루시퍼라제(Nluc)는 작고 밝은 생물발광 단백질(48)으로, 인플루엔자 A/푸에르토리코/08/1934 H1N1(PR8)24,33, 40,55,56,57. 또한, 자주 사용되는 단색 형광 단백질인 비너스는 비구조적(NS) 바이러스 분절32,33, 36,41,55에삽입하였다. BIRFLU는 형광 및 루시퍼라제 리포터 유전자 모두에 대해 인코딩하기 때문에, 리포터 단백질 신호는 시험관 내 또는 생체 내 바이러스 복제 및 보급을 결정하기 위해 판독으로 사용될 수 있다55. BIRFLU의 생성 및 생체외 또는 생체내 특성화에 관한 추가 정보는 최근 간행물55에서확인할 수 있다. BIRFLU는 새로운 형광-및 생물발광 계 미세중화 분석법55를통해 항바이러스 약물의 효과를 테스트하거나 항체를 중화시키는 데 사용될 수 있다. 더욱이, BIRFLU는 또한 감염(55)의 마우스모델에서 바이러스 역학을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 원고에서, 우리는 생체외에서 BIRFLU55를 특성화하는 절차와 생체 내 발광 이미징 시스템을 사용하여 마우스에서 BIRFLU 감염을 연구하는 방법을 설명합니다.
분자 생물학, 동물 연구 및 이미징 기술에 있는 최첨단 기술의 조합은, 바이러스 호스트 상호 작용의 연구 결과, 바이러스 감염의 역학을 포함하여 IAV 연구를 위해 BIRFLU를 사용하는 유일한 기회를 연구원을 제공합니다; IAV 감염의 치료 적 치료 또는 다른 병원체 감염의 치료를위한 백신 벡터로서의 IAV의 잠재적 사용에 대한 새로운 백신 접근법의 개발.

<table><tbody><tr><td>12웰 세포 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>이 소프트웨어는 3.1.10에서 사용됩니다. 및 4.4.7</td></tr><tr><td>Bovin Albumin solution (BA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Store at 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Bovin 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>세포 배양 접시 100mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 이미징 시스템</td><td>BioRad</td><td></td><td>이 기기는 4.4.7</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C581-100</td>에서 사용됩니다. <td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinders</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td> <td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Store at 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>-20 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>5-7주 된 암컷 BALB/c 마우스</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>이 기기는 생체 내 이미징에 사용됩니다(4.2 및 4.3)</td></tr><tr><td>IX81 전동 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 4.7.2 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>이 기기는 생체 내 이미징 (4.2 및 4.3)</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td>에 사용됩니다. 이 <td>기기는 루시페라제 활성을 정량화하는 데 사용됩니다 (3.2.6)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 상피 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항체 항-NP 인플루엔자 A 바이러스 HB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase 분석 시약</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>이 시약은 Nluc 활성을 측정하는 데 사용됩니다. -20 &deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>Neutral Buffered Formalin 10%</td><td>EMD</td><td>65346-85</td> RT Nunc MicroWell 96-Well <td>Microplates에 보관</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>-20 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394 카메라</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>스캐너</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>텍사스 레드 결합 안티 마우스 -토끼 2차 항체</td><td>Jackson</td><td>715-075-150</td><td>-20 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) 처리 트립신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>RT Vmax</td></tr><tr><td>Kinetic 플레이트 리더</td><td>매장 분자 장치</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 중요한 건강 및 경제적 결과와 관련된 인간의 호흡기 질환을 일으킵니다. 다른 바이러스와 마찬가지로, IAV를 공부하는 것은 감염된 세포 및 / 또는 감염의 동물 모델에서 바이러스의 존재를 감지하기 위해 힘든 보조 접근법의 사용을 필요로한다. 이러한 제한은 최근 쉽게 추적 가능한 형광 또는 생체 발광(luciferase) 리포터 단백질을 발현하는 재조합 IAV의 생성과 함께 우회되고 있다. 그러나, 연구자들은 외래 서열을 포함하는 IAV 게놈의 제한된 용량으로 인해 형광 또는 루시퍼라아제 리포터 유전자를 선택하도록 강요받았다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 생체외 및 생체 내에서 IAV 감염을 용이하게 추적하기 위해 형광및 루시퍼라제 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 재조합 복제 유능한 바이-리포터 IAV(BIRFLU)를 생성하였다. 이를 위해, 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/34 H1N1(PR8)의 바이러스 성 비구조적(NS) 및 헤마글루티닌(HA) 바이러스 성 세그먼트는 각각 형광 성 금성 및 생물 발광 나노 루시퍼라아제 단백질을 인코딩하도록 변형되었다. 여기서, 우리는 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 IAV 감염의 마우스 모델에서 BIRFLU의 사용 및 두 리포터 유전자의 검출에 대해 설명한다. 특히, 우리는 기자와 바이러스 복제 의 식 사이의 좋은 상관 관계를 관찰했다. 분자 생물학, 동물 연구 및 이미징 기술의 최첨단 기술의 조합은 연구원에게 바이러스 호스트 상호 작용 및 역학의 연구를 포함하여 인플루엔자 연구를 위해이 도구를 사용할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 바이러스 감염. 중요한 것은, 다른 바이러스 세그먼트에서 2개의 외국 유전자를 발현하기 위하여 바이러스 게놈을 유전으로 변경하는 타당성은 이 접근을 사용하는 기회를 열어줍니다: (i) 새로운 IAV 백신의 발달, (ii) 재조합 IAV의 생성 다른 인간 병원체 감염의 치료를 위한 백신 벡터로 사용될 수 있다.

시험관 내 BIRFLU의 생성 및 특성화(그림 1 및 그림 2)
두 개의 상이한 리포터 유전자(BIRFLU)를 발현하는 재조합 복제-유능한 IAV는 최첨단 분자 생물학 및플라스미드 계 역유전학 기술을 사용하여 시공되었다(도 1). 여기서, 우리는 그것의 작은 크기, ATP 독립성, 더 큰 강렬 및 최적화된 기판48,60을포함하여 그밖 luciferases에 비해 몇몇 이점 때문에 Nluc를 사용하기로 결정했습니다. Nluc는 Ha의 개방 판독 프레임(ORF) 앞에서 돼지 테초바이러스(PTV) 2A 절단 부위(2A)를 이어서 IAV PR8의 HA세그먼트로 복제하였다(도 1). HA의 ORF는 원래의 포장 신호를 제거하고 가능한 재조합을 피하기 위해 자동 돌연변이를 포함했다. 완전한 HA 패키징 신호는 동일한 바이러스 RNA 세그먼트로부터의 비리온 및 Nluc 및 HA 발현에 변형된HA 세그먼트의 적절한 혼입이 허용되도록 Nluc 의 앞에 추가되었다(도 1). 또한, 형광 단백질 비너스는 단일 전사체32, 36,41,54에서두 개의 바이러스 성 단백질 NS1 및 NEP를 인코딩하는 변형된 IAV PR8 NS 세그먼트로 복제되었다. 57. 이를 위해, 비너스는 NS1의 C 단말에 융합되었고 전체 신천ORF는 NS1-비너스와 신천시 서열 사이에 배치된 PTV 2A분열 부위의 하류를 복제하였다(도 1). 궁극적으로, 이들 2개의 변형된 HA 및 NS 바이러스 성 플라스미드 컨스트럭트들은 BIRFLU를 생성하기 위해IAV PR8 역유전학 플라스미드의 나머지 부분과 조합하여 사용되었다(도 1). BIRFLU의 생체외 및 생체내 특성화는 이전에55에기재되어 있다.
도2에서, 우리는 형광 및 간접 면역형광 접근법을 사용하여 금성, Nluc 및 NP 발현 수준을 결정함으로써 시험관 내 BIRFLU을 특징으로 한다(도2A,B). MDCK 세포의 동시 단층은 WT 또는 BIRFLU PR8 바이러스로 모의 감염 또는 감염(MOI 0.1)을 하였고, 감염 후 18시간에서, 금성 발현은 형광 현미경 검사법을 사용하여 직접 평가하였다(도2A,B). Nluc(도 2A)및 NP (도2B)발현은 각 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 간접 면역 형광에 의해 가시화되었다. 예상대로, 비너스 및 Nluc 발현은 WT PR8 바이러스에 의해 감염된 세포가 아닌 BIRFLU에 감염된 세포에서만 검출되었다. 또한, 간접 면역형광 현미경 검사법은 WT 및 BIRFLU PR8 감염 세포 모두에서 NP 발현을 밝혀냈습니다. 모의 감염 세포에서 예상대로 금성, Nluc 또는 NP의 발현이 검출되지 않았다(도A,B).
시험관내에서 Nluc 발현 수준을 평가하기 위해, MDCK 세포는 WT 또는 BIRFLU PR8 바이러스와 Nluc 활성을 감염시키고 조직 배양 서식탄에서 24, 48,72 및 96h 감염 후(도 2C)로 평가하였다. BIRFLU에 감염된 MDCK 세포의 조직 배양 과장제에서 Nluc활성만 검출되었다(도 2C). 조직 배양 에서의 Nluc 활성은 96 h 후 감염에서 더 높은 발현 수준으로 감염 후 24 시간 초기에 검출되었으며, 아마도 바이러스 감염 방출 중에 유도된 세포병증 효과(CPE)가 Nluc 단백질을 유지했기 때문일 것입니다. 셀안으로 들어갑니다. 배양된 세포에서 BIRFLU의 적합성을 평가하기 위해, WT 및 BIRFLU PR8 바이러스의 성장 역학도 평가하였다(도2D)조직 배양 에 감염성 바이러스의 존재는 면역 초점 분석(도2D)에 의해 결정되었다. ). 특히, BIRFLU 복제 역학은 WT PR8 바이러스의 그것과 비교되었다, BIRFLU 복제는 약간 지연되고 WT PR8와 같은 바이러스 성 역가에 도달하지 않았지만. 그러나, BIRFLU는 5 x 107 PFU/mL(도2D)의역가에 도달할 수 있었고, 이는 바이러스 게놈에서 두 개의 리포터 유전자의 발현이 MDCK 세포에서 BIRFLU 복제를 현저하게 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
마우스에서 BIRFLU 감염 추적(그림3 및 그림 4)
도 3은 IAV 감염의 마우스 모델에서 BIRFLU 역학의 평가를 위한 개략적 흐름 도표이다. 5-7주령 암컷 BALB/C 마우스는 1x PBS로 모의 감염되었거나 비르플루의 1 x 106 PFU에 감염되었다. 감염 후 3일에서, 마우스는 이소플루란으로 마취한 다음, Nluc 기판을 레트로 궤도로 주입하였다. 모든 마우스를 IVIS 계측기에 즉시 배치하고 Nluc 신호를 IVIS를 사용하여 생체 내에서 평가하였다. 다음으로, 마우스를 안락사시키고 폐를 수확하였다. 절제된 폐는 생체 내 이미저를 사용하여 생체 내 발현을 통해 형광 강도를 결정하기 위해 생체 내 생체 내를 분석한 후 분석되었다. 마지막으로, 마우스 폐를 균질화하고, 바이러스 성역자 및 안정성은 플라크 분석에 의해 결정되었다. 플라크는 금성의 직접적인 형광에 의해, Nluc에 특이적인 항체를 사용하여 면역 염색및 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 평가되었다.
이전에 설명된 복제 유능한 리포터-발현 IAv는 바이러스 감염 및 복제를 위한 대리로서 형광 또는 생물 발광 단백질 중 가장 빈번하게 단일 리포터 유전자를 발현한다. 그러나, BIRFLU는, 바이러스 감염 시 두 가지 유형의 리포터 유전자를 발현할 수 있다. BIRFLU 감염 후 생물 발광 (생체 내 이미징)과 형광 (생체 내 이미징) 사이의 상관 관계를 평가하기 위해, 5-7 주 된 여성 BALB / c 마우스는 1x PBS로 모의 감염되거나 BIRFLU (106 PFU)로 접종했습니다. . Nluc 활성(도4A)은생체내 이미징 기기를 사용하여 감염 후 3일째에 레트로 궤도에서 주사된 Nluc 기판을 투여하여 평가하였다. 우리는 이전 연구 결과에 의하여 IAV 복제가 PR8를 포함하는, 일 2와 4 감염 후24,54사이에서 피크를 표시했기 때문에 3 일째에 생물 발광을 평가하기로 결정했습니다. 생물 발광을 모니터링하고 (도4A,상단) 평균 총 플럭스 (플럭스 (로그10 p/s)(도4A,하단)를 계산하는 데 사용하였다. 예측된 바와 같이, BIRFLU로 접종된 마우스는 높은 생물 발광 활성을 보였지만 모의 감염된 마우스에서는 신호가 검출되지 않았다. 그 후, 감염된 마우스의 폐를 수확하고 금성 발현을 생체내 영상(도4B,상단)을 사용하여 평가하였다. 더욱이, 형광 평균 복사 효율을 계산하였다(도4B,하단). 절제된 마우스 폐는 또한 생체 내에서 BIRFLU의 바이러스 적시 및 유전적 안정성을 결정하기 위해 균질화되었다(도4C,D). BIRFLU의 유전적 안정성은 마우스 폐 및 형광 현미경 검사법(비너스, 상부), 면역 염색(Nluc, middle) 및 크리스탈 바이올렛 염색(아래)으로부터 분리된 바이러스를 이용하여 플라크 분석법을 통해 분석하였다. 비르플루는 마우스 폐로부터 회수하여 플라크를 형성할 수 있었고두 리포터 유전자를 안정적으로 발현하였다(도 4C). 특히, 우리는 바이러스 복제와 생물 발광과 형광 신호 사이의 좋은 상관 관계를 관찰.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> 도 1: IAV PR8 WT 및 BIRFLU 비리온 구조 및 게놈 세그먼트의 개략적 표현. IAV는 헤마글루티닌(HA; 검정) 및 뉴라미니다아제(NA; 블루)를 함유하는 지질 이중층으로 둘러싸여 있다. IAV는 8개의 단일 가닥, 음의 감각, RNA 세그먼트(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS)를 포함합니다. 각 바이러스 성 세그먼트는 3'및 5'끝 (블랙 박스)에서 비 코딩 영역 (NCR)을 포함합니다. 또한 바이러스(v)RNA의 3' 및 5' 말단에는 포장 신호가 있으며, vRNA를 초기 비리온(흰색 상자)으로 효율적으로 캡슐화합니다. IAV PR8 HA 및 NS 바이러스 성 세그먼트 및 제품은 검은색으로 표시됩니다. Nluc, 금성 및 PTV 2A의 시퀀스는 각각 빨간색, 녹색 및 줄무늬 상자로 표시됩니다. 비르플루에서 각각 Nluc 및 금성으로 표현되는 변형된 HA 및 NS 세그먼트의 개략적 표현도 표시된다. 이 수치는 노갈레스 외55에서적응되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> 그림 2: 비르플루의 체외 특성화. (A, B) 직접 형광 및 면역 형광에 의한 단백질 발현 분석. MDCK 세포는 PR8 WT 또는 BIRFLU 바이러스로 모의 감염 또는 감염(MOI 0.1)하였다. 감염된 세포는 직접 형광 현미경검사법에 의해 금성 발현을 직접 시각화하고 Nluc(A)및 바이러스 성 NP(B) 특이적 항체 및 간접 면역형광을 사용하여 발현을 시각화하기 위해 감염 후 18시간에서 고정하였다. 핵을 DAPI로 염색시켰다. 대표 이미지(20배 배율)가 표시됩니다. 배율 막대 = 100 μm. (C, D) PR8 WT 및 BIRFLU의 성장 역학. Nluc 활성(C) 및 바이러스 적시 (D) WT 및 BIRFLU PR8 바이러스를 감염된 MDCK 세포로부터의 조직 배양 장신구 (MOI 0.001)에서 감염 후 표시된 시간에 평가하였다. 데이터는 삼중분의 평균 ± SD를 나타낸다. 바이러스 성 적규자는 면역 초점 분석 (FFU / mL)에 의해 결정되었다. 점선은 검출 한계(200 FFU/ml)를 나타냅니다. 이 수치는 노갈레스 외55에서적응되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> 도 3: 마우스에서 BIRFLU의 연구를 위한 개략적 표현. Nluc 및 금성 리포터 유전자의 발현은 VIVFLU의 1 x 106 PFU에 감염된 마우스에서 생체 내 또는 생체내 영상을 사용하여 평가하였다. 간단히, 1일째, 5~7주령암컷 BALB/c 마우스를 모의 감염(1x PBS) 또는 비르플루의 1 x 106 PFU로 접종하였다. 감염 후 3일째에, 마우스는 이소플루란을 사용하여 경미하게 마취되었고, Nluc 기질은 레트로 궤도로 주입하였다. Nluc 신호는 생체 내 이미징을 사용하여 직접 평가되었다. 이미징 직후, 마우스를 안락사시키고 전체 절제된 폐에서 금성의 발현을 생체 내 이미징을 사용하여 분석하였다. 회수된 마우스 폐는 플라크 분석에 의한 바이러스 복제 및 안정성을 평가하기 위해 균질화되었다. 화살표는 형광 (금성), 면역 염색 (Nluc) 및 크리스탈 바이올렛 염색 사이의 상관 관계를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> 도 4: 생체 내 생물 발광 및 형광 발현. 암컷 5-7주 된 BALB/c 마우스는 모의 감염(1x PBS) 또는 비르플루의 1 x 106 PFU를 접종하였다. 감염 후 3일째에, 전체마우스에서 Nluc 활성(A)을 결정하였다. 광도 척도(p/sec/cm2/sr)를 보여주는 단일 마우스의 대표 이미지입니다. 생물 발광 광채 값은 정량화되었고 평균 총 플럭스가 도시됩니다(Flux(Log10 p/s). Nluc 화상 진찰 후에, 폐는 생체내 화상 진찰을 위해 수확되었습니다 (B). 전체 폐의 대표 사진이 표시됩니다. 금성 발현을 정량화하기 위해, 관심 영역(ROI)의 평균 값을 모의 감염된 마우스로부터 폐 자동 형광으로 정규화하고 배 변화변화를 계산하였다. VIVFLU의 생체 내 유전적 안정성을 분석하기 위해, 마우스 폐에서 회수된 바이러스는 형광 현미경 검사법(금성, 상부), 면역 염색(Nluc, middle) 및크리스탈 바이올렛 염색(아래)을 사용하여 플라크 분석법으로 분석하였다. 한 마우스의 대표 이미지가 표시됩니다. 바이러스 복제를 평가하기 위하여는, 전체 폐는 화상 진찰 후에 균질화되고 MDCK 세포를 감염시키고 플라크 분석(PFU/mL)에 의해 바이러스성 적규를 결정하기 위하여 이용되었습니다 (D). 화살표는 형광 (금성), 면역 염색 (Nluc) 및 크리스탈 바이올렛 염색 사이의 상관 관계를 나타냅니다. 바는 폐 바이러스 적수의 평균 ± SD를 나타낸다. 이 수치는 Logales 외55에서적응되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>조직 배양 배지 및 솔루션</td>
			<td>구성</td>
			<td>보관소</td>
			<td>사용</td>
		</tr>
<tr>
<td>
조직 배양 배지: 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM), 10% 태아 소 세럼(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민(PSG)(DMEM 10% FBS 1%PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, FBS 50 mL 및 100x PSG의 5 mL.</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>MDCK 세포의 유지 보수</td>
		</tr>
<tr>
<td>
감염 후 미디어: DMEM 0.3% 소 알부민 (BA), 1 % PSG (DMEM0.3 % BA 1 %PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4.2 ml의 35 % BA 및 100x PSG의 5 ml</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>바이러스 감염 후 MDCK 세포의 유지 보수</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x 인산염 완충식염수(PBS)</td>
			<td>NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2HPO4.7H2O, KH2PO4의 11.5 g. ddH2O최대 1L. pH를 7.3으로 조정 추가</td>
			<td>실온</td>
			<td>1x PBS를 준비하려면</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>ddH2O로 10x PBS 희석</td>
			<td>실온</td>
			<td>세척 셀</td>
		</tr>
<tr>
<td>
감염 매체: 1x PBS, 0.3% BA, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (PS)(PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS 멸균, 35% BA의 4.2 mL 및 100x 1% PS(100 U/mL) 5ml</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>바이러스 성 감염</td>
		</tr>
<tr>
<td>
고정 /투과 용액 : 4 % 포름알데히드, 0.5 % 트리톤 X-100은 1 x PBS에서 희석됩니다.</td>
			<td>400 mL 중립 완충 포르말린 10%, 트리톤 X-100 5 ml 및 1x PBS 595 mL</td>
			<td>실온</td>
			<td>MDCK 세포의 수정 및 투과.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
차단 솔루션 : 1 x PBS에서 2.5 % 소 혈청 알부민 (BSA).</td>
			<td>1x PBS의 97.5 mL에서 BSA 2.5 g</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>면역 형광 및 플라크 분석법에 대한 차단 솔루션.</td>
		</tr>
<tr>
<td>항체 희석 액 (1 x PBS에서 1 % BSA)</td>
			<td>1x PBS의 99 mL에서 BSA 1 g</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>1 차 및 이차 항체의 희석.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1% 크리스탈 바이올렛 용액</td>
			<td>메탄올 400 mL에 크리스탈 바이올렛 1 g. ddH2O 600 ml 추가</td>
			<td>실온</td>
			<td>플라크 어세이에서 MDCK 세포의 염색.</td>
		</tr>
<tr>
<td>토실설포닐 페닐라닐 클로로메틸 케톤(TPCK) 처리 트립신</td>
			<td>ddH 2O에서 1 mg/mL에서 1,000x 스톡 솔루션 준비</td>
			<td>-20 °C</td>
			<td>바이러스 감염.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 조직 배양 배지 및 솔루션.

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 연간 전염병과 간헐적 인 전염병을 일으키는 전염성 호흡기 병원체입니다. 여기서, 우리는 새로운 재조합 루시퍼라제 및 형광 발현 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 사용하여 생체 내에서 바이러스 감염을 추적하는 프로토콜을 기술한다. 이 접근법은 연구원에게 생체 내에서 IAV를 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 제공합니다.

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

연구원은 이전에 형광 또는 생물 발광 단백질 리포터중 하나를 표현하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 생성했습니다. 인플루엔자 바이러스에 있는 기자 유전자의 우리의 단 하나 발현의 일부는 실험에 있는 그것의 사용을 가혹하게 제한합니다. 우리의 프로토콜은 형광 및 생물 발광 기자 유전자를 모두 표현하는 bireporter 인플루엔자 바이러스의 사용을 설명하고, 따라서 그것의 한계를 극복합니다.이 기술의 주요 장점은 시험관 내 및 생체 내 연구를 위한 단일 재조합 인플루엔자 바이러스의 사용입니다. 이 기술을 수행 할 때, 기판이 신속하게 대사되기 때문에 루시파라기 기판과 마우스 처리의 적절한 계획의 신속한 주입이 중요하다. 또한, 생암발신호의 검출을 개선하기 위해 마우스의 면도가 권장된다.마우스를 감염시키기 위하여는, 1X PBS에 있는 BIRFLU를 준비하여 시작합니다. 예방 접종까지 얼음에 바이러스를 유지합니다. 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하여 마우스가 마취되었는지 확인하고 준비된 BIRFLU 희석으로 인트라나틱하게 접종하십시오.모든 마우스가 케이지로 돌아오기 전에 제대로 호흡하고 있는지 확인하십시오. 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를 누은 다음 이미징에 사용되는 매개 변수를 설정합니다. BIRFLU에 감염된 마우스를 모니터링하려면 가슴을 면도하여 생물 발광 신호의 검출을 개선합니다.마우스가 마취되면 22 게이지 바늘을 사용하여 22 게이지 바늘을 사용하여 PBS에서 1-10까지 희석된 Nluc luciferase 기판100 마이크로리터를 레트로 궤도로 투여합니다. 주사 직후, 동물을 격리 챔버에 놓고 가슴이 위를 향합니다. 그런 다음, 이미징 기기에 격리 챔버를 놓고 문을 닫고 이미지를 수집합니다.이미징 후 마우스를 케이지로 돌려보내 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 이미징 소프트웨어 ROI 도구를 사용하여 관심 영역을 지정하고 측정을 클릭하여 획득한 생물 발광 데이터를 분석합니다. 마우스 폐의 전 생체 내 이미징을 수행하려면 원고 방향에 따라 폐를 수집하고 이미지 수집 소프트웨어를 시작하고 이미징을 위한 매개 변수를 설정합니다.기계가 초기화되면 폐를 검은 색 배경 트레이에 놓고 조직이 서로 분리되었는지 확인합니다. 트레이를 이미저에 소개하고 문을 닫고 이미지를 수집합니다. 이미징 후, 샘플을 같은 날 처리할 경우 조직을 즉시 제거하고 섭씨 4도에서 얼음에 보관하십시오.나중에 처리될 경우 드라이 아이스의 튜브에 빠르게 얼리고 섭씨 80도에 보관하십시오. 이미지를 처리하려면 ROI 도구를 선택하고 각 개별 폐 주위에 관심 영역을 그리고 측정을 클릭합니다. BIRFLU는 감염된 세포에서 금성, Nluc 및 NP 발현 수준을 결정함으로써 시험관내에서 특징지어지고 있다.금성과 Nluc 발현은 BIRFLU에 의해 감염된 세포에서만 검출되며, NP는 야생형 PR8 및 BIRFLU 감염 세포 모두에서 발현된다. 모의 감염된 세포에서는 발현이 관찰되지 않습니다. 더욱이, Nluc 활동은 24, 48, 72 및 96 시간 감염 후 조직 배양 초월제에서 측정되었습니다.감염 후 24시간 일찍 검출되고, 발현 수준은 96시간으로 증가한다. 또한 BIRFLU의 복제 역학이 야생 형 PR8 바이러스와 비교할 수 있음을 입증 할 수 있습니다. BIRFLU는 형광 및 생물 발광 기자 유전자를 모두 발현할 수 있는 능력을 가지며, 둘 사이의 상관관계는 마우스 폐의 생체 내 및 전 생체 이미징을 사용하여 평가될 수 있다.BIRFLU에 감염된 마우스의 폐는 생체 내 의 높은 생체 발광및 형광 전 생체 내의 비보를 표시하였다. 생체 내에서 BIRFLU의 바이러스 성 티터 및 유전 적 안정성도 결정되었습니다. 마우스 폐에서 바이러스에 플라크 분석 바이러스플라인 플라크는 바이러스가 플라크를 형성하고 기자 유전자를 모두 표현할 수 있음을 보여주었다.BIRFLU는 또한 인플루엔자에 대하여 항 바이러스 및 중화 항체의 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 이 에세이의 출력은 모두 서로 상관 관계가 있었고 빠르고 쉽게 할 수 있습니다.

a-luciferase-fluorescent-reporter-influenza-virus-for-live-imaging

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

소설로 루시 페라 제 및 생체 이미징 시스템 (IVIS)에서를 활용하면 임상 개발가 발생하기 전에 질병 끝점을 식별 할 수 의미합니다. IVIS은 우리가 미래 연구를위한보다 정확한 질병 모델을 제공 실시간으로 여러 일 동안 encephalitic 바이러스의 침입을 시각화 할 수 있습니다. 또한 우리는 신속하게 현재 활용 동물 모델보다 antivirals과 백신의 잠재적 인 보호 기능을 식별 할 수 있습니다. 여러 시간 지점을 통해 개인 동물을 활용하는 기능은 감소 동물의 요구 사항, 비용, 질병 연구의 더 인간적 더 과학적인 수단을 확보 활용 동물 전반적인 질병을 보장합니다.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

역가 측정을 위해 루시페라아제 발현 바이러스(여기서는 VSV∆51-Fluc를 예로 듦)가 포함된 시료를 확보하여 96-웰 플레이트로 옮긴다. 또는 96-웰 조직 배양 플레이트에서 감염을 수행하고 상층액을 직접 사용한다. 표준 곡선을 포함시키기 위해 두 개 열은 처리하지 않고 둔다. 96-웰 플레이트에서 직접 실험을 수행하는 경우, 실험 종료 시점(감염 후 40시간)에 역가를 측정하거나 -80 °C에 보관했다가 추후에 역가를 측정한다.

루시퍼레이즈 기반 바이러스 정량을 위한 시료 준비

이 비디오는 재조합 루시페라아제와 형광 단백질 발현 바이리포터 인플루엔자 A 바이러스를 사용하여 마우스 모델에서 바이러스 감염을 추적하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 생체 내 및 생체 외 연구를 모두 가능하게 하여 연구자가 바이러스 역학 및 중재의 효과에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.

바이러스 감염을 추적하기 위한 Luciferase-Fluorescent Reporter 인플루엔자 바이러스

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

이 논문은 자동 및 수동 액체 처리기를 사용하여 다양한 RNA 및 DNA 바이러스를 적정하는 고처리량 루시페라제 발현 기반 방법을 제시합니다.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

이 프로토콜은 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하는 데 필요한 2차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 루시페라아제 및 형광 발현 재조합 (r)SARS-CoV-2 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하는 바이러스 감염의 역학을 기술한다.

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

배우세요 BIRFLU 이중 리포터 시스템을 이용한 인플루엔자 A 바이러스 감염의 실시간 이미징 및 정량화 방법을. 이 기술은 형광과 생물발광을 동시에 검출하여 항바이러스 효능 및 면역 반응 평가에 활용됩니다.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

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