Name: Presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 뉴런 공 문화를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 학습하세요 뉴런 볼 배양과 프리시냅스 주최자 구슬을 이용한 프리시냅스 형성 분석 방법입니다. 이 기술은 수천 개의 시냅스를 동시에 유도하여 축삭에서 단백질 축적 과정을 효율적으로 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 부분적으로 JSPS 과학 연구를위한 원조에 의해 지원된다 (KAKENHI) (C) (번호 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. 사사키). 노기 테루카즈 박사와 네야자키 마키코(요코하마시 립대학)에게 생물학적 LRRTM2 단백질을 친절하게 공급해 주신 것에 감사드립니다. 또한 기술 지원을 해주신 우에치 호나미와 이시이 리에 대해서도 감사드립니다.

이 원고에 기술된 실험은 요코하마시 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 설명된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 매달려 드롭 문화로 뉴런 볼의 준비 (시험관 내 일 (DIV) 0-3)
참고: 뉴런 볼 배양의 제조를 위해 여기에 기술된 절차는 사사키 그룹이 이전에 보고한 방법에 기초하여일부수정9,10. 우리는 또한 해리 문화14에대한 Banker 방법에서 몇 가지 절차를 채택했다.
<ol><li>
해부를 시작하기 전에 다음 확인
	<ol>
<li>필요한 모든 솔루션을 준비하고 사전에 오토클레이브/여과하여 소독하십시오.</li>
		<li>이 피질 뉴런 문화의 각 단계에서 사용되는 모든 악기와 재료를 준비하십시오.</li>
		<li>70% 에탄올로 층류 공기 흐름 캐비닛, 해부 테이블, 스테레오 현미경, 가위 및 집게의 스테이지 플레이트를 스프레이하고 닦으하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2를 적용한 후 마우스를 안락사시키고 복부를 해부하여 E16 배아를 얻습니다.</li>
	<li>포셉의 미세 한 팁의 도움으로 배아에서 두뇌를 조심스럽게 제거하고 HEPES 완충 소금 용액 (HBSS)의 4 mL을 포함하는 60mm 세포 배양 접시로 옮김. 참고 : 해부 매체 HBSS는 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.09 mM Na2HPO4,1.1 mM KH2PO4,5.6 mM D-포도당 및 5.64 μM 페놀 레드를 포함합니다.</li>
	<li>두피를 제거하고 후각 전구를 자르고 스테레오 현미경으로 집게의 미세 한 팁을 사용하여 각 대뇌 반구에서 피신 피질을 분리하고 신선한 HBSS를 포함하는 다른 60mm 접시로 옮김하십시오. 각 별도의 뉴런 볼 배양에 대해 적어도 3-5개의 배아를 사용한다.</li>
	<li>라미나 흐름 세포 배양 후드에 미세 도해 스프링 가위로 작은 조각으로 피질자를 잘라.</li>
	<li>다진 코르티제를 15 mL 튜브로 옮기고 HBSS에서 0.125% 트립신의 4 mL에서 다진 코르티크를 37°C에서 수조에서 4.5분 동안 트립시노이즈합니다. 참고: 이 트립시니화 시간은 증가하는 시간(> 4.5분)이 훨씬 더 죽은 뉴런으로 이어지기 때문에 효율적인 뉴런 문화에 매우 중요합니다.</li>
	<li>멸균 전사 파이펫에 의해 HBSS의 10 mL을 포함하는 새로운 15 mL 튜브로 세포 응집체를 옮기고, 37°C에서 5분 동안 배양한다.</li>
	<li>글루타맥스, B27 보충제(NGB 배지), 0.01% DNase I 및 10% 말 혈청을 함유하는 2 mL의 신경기저 배지를 포함하는 새로운 15 mL 튜브로 세포 응집체를 옮니다.</li>
	<li>트라이시니화 된 코르티케는 불 광택 미세 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 반복적으로 위아래로 (3-5 회) 피펫을 피펫으로 처리합니다. 참고: 불이 연마된 미세 유리 파스퇴르 피펫의 직경은 Banker방법 용지(14)에 기재된 바와 같이 매우 중요하다. 파이펫이 너무 좁아서 코르티티를 통과하지 못하면 2-3개의 다른 크기를 가진 파이펫을 준비하고 더 큰 파이펫을 사용해 보십시오.</li>
	<li>뉴런 볼을 준비하기 위해 위의 셀 서스펜션을 취하고 NGB 배지를 사용하여 세포 밀도를 1 x 106 셀 /mL로 조정하십시오.</li>
	<li>10,000 개의 세포 / 드롭 (1 방울은 10 μL)을 포함하는 매달려 있는 방울로 피질 뉴런을 배양 10cm 배양 요리의 상부 뚜껑 내부.</li>
	<li>배양 요리의 하단 부분에 인산완충 식염수(PBS) 7 mL를 첨가한 다음, 가습된 상태에서 5% CO2로 37°C에서 3일 동안 인큐베이터에 보관하여 뉴런 볼 형성을 허용합니다.</li>
</ol>2. PLL 코팅 유리 커버립 및 문화 유지 보수에 뉴런 공을 배치 (DIV 3-11)
참고 : 유리 커버의 코팅 전에 폴리 L-리신 (PLL)로 입술, 세제를 사용하여 커버 립을 세척하는 것이 중요합니다. 유리 커버슬립은 때때로 신경 배양및 PLL을 가진 균일한 코팅을 위해 이렇게 깨끗하지 않습니다. 비균일 PLL 코팅은 뉴런 볼의 고르지 못한 축색 연장을 초래할 수 있다.
<ol><li>1/20 희석된 중성 비인성 세제에 1-3박 동안 세라믹 랙에 담그세요.</li>
	<li>커버립을 초순수로 8회 세척한 다음 오븐에서 200°C에서 12시간 동안 살균합니다. 참고 : 여기에서 모든 단계는 층류 공기 흐름 세포 배양 후드에서 수행해야합니다.</li>
	<li>구운 커버립을 100mm 접시에 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. 뚜껑과 바닥 접시 사이에 파라필름으로 접시를 밀봉 한 후, 구운 커버 슬립은 장기간 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>(선택 사항) 커버슬립에 파라핀 점을 바하십시오. 점들은 뉴런 볼이 플라스틱 접시에 직접 접촉하여 면역 염색 중에 커버립에서 분리되는 것을 방지하기 위한 공간을 만듭니다. 약 90°C의 온수 욕조에서 적절한 병에 파라핀을 녹입니다. 파저 피펫을 파라핀에 담근 다음 빠르게 터치하여 커버슬립 가장자리 근처에 세 개의 지점을 만듭니다.</li>
	<li>PLL(MW > 300,000)을 PLL 용액(붕산완충제의 15 μg/mL)을 사용하여 60mm 접시에 파라핀 비드 유리 커버슬립을 바르고 CO2 인큐베이터에서 1시간 이상 유지합니다.</li>
	<li>PBS로 4회 세척한 후, PLL 코팅 커버슬립을 각각 350 μL의 NGB 배지를 함유하는 4웰 플레이트로 옮기고 시토신 β-D-아라비노푸라노시드 염산염(AraC, 3 μM)을 배지로 옮겨 분할 세포를 죽이도록 하였다.</li>
	<li>뉴런 볼을 옮기기 전에 37°C에 도달하는 배지의 온도를 보장하기 위해CO2 인큐베이터에 PLL 코팅 커버슬립을 함유하는 이 4웰 플레이트를 적어도 20분 동안 유지한다.</li>
	<li>DIV 3에서 "뉴런 볼"이 아주 잘 형성되면 CO2 인큐베이터에 보관된 4웰 플레이트(5 개의 뉴런 볼/웰) 내부에 PLL 코팅 커버슬립으로 이송합니다.</li>
	<li>48시간 후, 뉴런 볼 배양 배지를 신선한 AraC 프리 NGB 배지로 교체한다. 이 절차 직전에 온도가 37°C에서 준비된 층류 공기 흐름 세포 배양 후드에 핫 플레이트를 사용하십시오. 참고: 배양이 CO2 인큐베이터의 외부에 있는 시간을 줄이기 위해 핫 플레이트상에서 가능한 한 빠르게 변화하는 배지를 수행하여야 합니다.</li>
	<li>이 뉴런 볼 배양체를CO2 인큐베이터에서 최대 DIV 11까지 유지한다. 참고: DIV 11-12에서는 최대 1-2mm의 신경구를 확장하는 뉴런 볼이 실험에 사용됩니다.</li>
</ol>3. 세포체 유무에 관계없이 뉴런 볼 배양에 LRRTM2 비드 적용 (DIV 11-12)
참고 : 뉴런 볼 배양에 LRRTM2 구슬을 적용하기 전에 세포체를 제거하는 것이 좋습니다. 따라서, 처음에는 LRRTM2 비드를 준비한 다음, 세포체를 제거한 다음, 나중에 LRRTM2 비드를 가능한 한 빨리 배양에 적용한다. 바이오티니어 LRRTM2는 노기 그룹(요코하마시 대학)에서 조건부 배지로 제공합니다. 이들은 E로부터의 비오틴 수용자 서열 및 비오틴 리가아제를 포함하는 발현 벡터를 사용한다. 대장균 (비라) 15세 , 도 16은 LRRTM2에 비오틴을 부착하고, 발현 벡터는 Expi293 발현 시스템에 포함된 Expi293F 세포에 형질감염된다. 벡터 정보는 추가 그림1에서 사용할 수 있습니다. 생체면역화된 LRRTM2-컨쥬게이트 스트렙타비딘 비드는 LRRTM2-Fc–컨쥬게이트 단백질 A 비드에 비해 면역염색의 배경을 크게 감소시켰으며,이는 LRRTM2 시스템 8에 사용된다.
<ol><li>
생체 질화된 LRRTM2 구슬의 제조
	<ol>
<li>생체측화 된 LRRTM2를 발현하는 Expi293F 세포의 컨디셔닝 배지에서 과잉 비오틴을 제거하려면, PBS (총 2.5 mL)의 0.8 mL를 혼합한 컨디셔닝 배지의 1.7 mL을 PD-10 겔 여과 컬럼에 적용합니다. PD-10 컬럼은 25 mL의 초순수와 25 mL의 PBS로 사전 조정됩니다.</li>
		<li>3.5 mL의 PBS로 용출하고 LRRTM2 주식으로 흐름을 수집합니다. 참고 : 이 LRRTM2 스톡은 aliquots에 분배하고 장기간 -80 °C에 보관 할 수 있습니다. 생체응화 LRRTM2의 발현 수준은 때때로 로트마다 다양합니다. 따라서, 비드에 컨쥬게이션하는 LRRTM2 스톡의 적정 부피는 뉴런 볼에 충분히 presynapss를 형성하도록 결정되어야 하며, LRRTM2 스톡의 새로운 많은 것이 처음에 사용될 때.</li>
		<li>스트렙타비딘 코팅 된 자기 입자 (직경 : 4-5 μm)의 현탁액에서 미세 원심 분리튜브로 20 μL을 가져 가라. 네오디뮴 영구 자석을 부착한 수제 장치에 구슬을 고정시키고 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 PBS-MCBC 100 μL로 3회 세척합니다. 참고 : PBS-MCBC는 5 mMMgCl 2, 3 mM CaCl2,0.1 % BSA 및 0.1 % 완전 EDTA 프리를 포함한 PBS를 포함합니다.</li>
		<li>구슬에서 완전히 PBS-MCBC를 제거한 후, 세척된 구슬에 LRRTM2 스톡(보통 500-1,000 μL, 참고 3.1.2 참조)의 미리 정해진 부피를 추가합니다. 1-2 시간 동안 4 °C에서 회전을 사용하여 혼합물을 배양합니다.</li>
		<li>비드를 PBS-MCBC 100 μL로 두 번 세척하고 나중에 NGB 배지 100 μL로 세척합니다.</li>
		<li>뉴런 볼 배양에 적용하기 위한 NGB 배지의 50 μL에서 LRRTM2 비드를 재중단한다.</li>
		<li>생체 용 LRRTM2 단백질을 추가하는 것을 제외하고 다른 미세 원심 분리관에서 대조군 비드 (음성 대조군)를 준비하기위한 동일한 절차를 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DIV 11-12에서 뉴런 볼에서 세포 체를 제거하고 LRRTM2 구슬을 적용
	<ol>
<li>4웰 플레이트의 우물을 "세포체(+)"와 "세포체(-)"로 표시합니다.</li>
		<li>이전에 입체 현미경으로 70% 에탄올로 분무한 면도날로 노란색 팁의 결말을 45° 각도로 잘라냅니다(그림1B).</li>
		<li>뉴런 볼의 세포 체 영역에 노란색 팁 끝을 넣고 흡입에의해 세포 체를 제거합니다 (도 1B).</li>
		<li>실험의 각 지정된 조건을 식별하려면 웰을 다시 "LRRTM2 비드" 및 "제어 구슬"로 레이블을 지정합니다.</li>
		<li>LRRTM2를 적용하고 뉴런 볼 배양에 비드를 제어하고, 페릿 자석을 사용하여 1 분 동안 플레이트의 바닥에 침수하여 presynapse 형성을 시작합니다. 이 절차는 모든 구슬을 동시에 터치다운할 수 있도록 합니다. 특히, LRRTM2 비드와 함께 짧은 시간 배양(예를 들어, 30분 및 1시간)에 동기를 두어 효과적일 것이다.</li>
		<li>시간 코스 실험을 수행하려면 각각 0 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 18 시간동안 각각 별도의 라벨을 부착하고 표시된 시간 간격으로 LRRTM2 비드를 적용하십시오.</li>
		<li>LRRTM2 비드를 첨가한 후, 뉴런 볼 배양액을 지정된 시간(0 분 내지 18시간)동안 비드와 배양하여 프리시냅스를 형성한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 면역 염색 및 현미경 검사법
참고 : 축세포가 4 시간 후에 세포체가 없는 상태에서 점차적으로 죽는 경향이 있기 때문에 세포체가 유무에 관계없이 실험 조건에서 LRRTM2 비드로 배양을 통해 4 시간 동안 세포를 수정하십시오. LRRTM2 비드가있는 시간 과정의 경우 지정된 시간에 셀을 수정하십시오.
<ol><li>
LRRTM2 구슬로 presynapse 형성 후 뉴런 볼 배양에서 뉴런을 고정하고 염색
	<ol>
<li>NGB 배지를 제거하고 실온에서 20 분 동안 PBS (250 μL / well)에서 4 % PFA로 뉴런 볼을 고정 한 다음 5 분마다 5 00 μL씩 500 μL로 씻으하십시오.</li>
		<li>고정 된 세포를 TBS (트리스 버퍼링 식염수 : 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.3) 및 150 mM NaCl)으로 5 분 이상 세척하십시오.</li>
		<li>5 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100을 포함하는 TBS로 뉴런 볼 배양세포 / 축세포를 투과시.</li>
		<li>차단 버퍼 (0.1 % 트리톤 X-100 및 TBS에서 5 % NGS (일반 염소 혈청)로 차단하기 위해 세포를 1 시간 유지하십시오.</li>
		<li>1 차적인 항체로 세포를 배양; 항-토끼-vGlut1 (매미 글루타민산수송기 1 (1:4000)) 및 반대로 마우스-Munc18-1 (1:300) 4°C에서 밤새 희석된 항체로 희석하였다.</li>
		<li>면역형광(IF) 완충액(0.1% 트리톤 X-100 및 TBS에서 2% BSA)으로 커버립을 4회 세척하고 형광단(Alexa dye)-2차 항체로 30분 동안 배양한다; 안티 마우스 - IgG-알렉사 555 (1:500), 안티 토끼 IgG-알렉사 488 (1:1000).</li>
		<li>PBS에서 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌레(DAPI, 1 μg/mL)로 5분 동안 뉴런의 세포체의 핵을 염색합니다.</li>
		<li>커버슬립을 PBS로 세 번 씻은 다음 167 mg/mL 폴리(비닐) 알코올과 6 mg/mL N-프로필 갈레이트가 포함된 마운팅 미디어를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다.</li>
		<li>유리 슬라이드를 현미경 검사법까지 -20°C의 냉장고에 보관하십시오. 슬라이드가 -20 °C에 저장될 때 유리 슬라이드의 형광 신호는 적어도 1 년 동안 감지 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 현미경으로 이미지 촬영
	<ol>
<li>60X 오일 침지 렌즈를 사용하여 냉각된 CCD 카메라로 반전된 형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트 및 IF 이미지를 캡처합니다. 이미지 수집 소프트웨어의 경우 소프트웨어 설치 현미경 시스템을 사용합니다. 이미지 J를 이미지 분석 소프트웨어로 사용합니다.</li>
		<li>다음 수식을 사용하여 축축에서 전시냅스에서 IF 강도를 측정합니다. 비드에 관심 영역의 강도 경우 (ROI) – 비드 영역 강도 / 비드에서 20 μm을 따라 축색 강도 오프 – 배경 강도. 이 비율 강도는 단백질축적 지수를 제공한다(도 4A). Image J 소프트웨어를 사용하여 원래 16비트 이미지에서 측정을 수행합니다.</li>
		<li>LRRTM2 비드로 유도된 프리시냅스에서 특정 단백질의 축적 수준을 정량화하려면, 항상 현미경(60X)을 가진 세포체에서 2필드 또는 그 이상 떨어져 있는 영역을 선택한다. 참고 : 조밀 한 축삭이 세포 체 근처에 있고 뉴런 볼의 주변이 단일 축삭을 제공 할 수 있기 때문에 이미징을위한 뉴런 볼의 영역 선택은 매우 중요합니다.</li>
		<li>정확한 측정을 위해 5가지 축색 필드(전체와 유사한 거리)/커버슬립을 선택합니다.</li>
		<li>다른 날과 실험 사이에 동일한 이미징 조건을 유지</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 뉴런 볼 배양을 사용하여 LRRTM2-비드로 자극된 시냅스 형성을 검사하는 새로운 방법을 개발했습니다. 현재, 대부분의 시냅스 형성 분석은 폴리-D-리신(PDL) 코팅된 비드 및 해리된 배양/미세유체챔버(20,21,22)를포함한다. 이 방법의 장점 중 하나는 LRRTM2 비드입니다. LRRTM2는 neurexin과 상호 작용하여 특히11,12,13,PDL-비드는 흥분성 및 억제 presynapses 모두 비특이적으로20을유도합니다. 이 방법에서는, 그 구성원이 10 단백질3이상인 그밖 presynapse 주...

시냅스 형성은 신경 회로 1,2,3의발달 중에 중요한 단계 중 하나입니다. 시냅스 전후로 구성된 전문 구획의 형성은 축삭과 모수석의 적절한 인식, 활성 영역 및 후발성 밀도의 형성, 그리고 적절한 정렬을 포함하는 복잡하고 다단계 과정입니다. 이온 채널 및 신경전달 물질 수용체 1,2. 각 과정에서, 시 냅 스 단백질의 많은 종류는 세포 체에서 시 냅 스 단백질을 수송 하 여 적절 한 타이밍에 이러한 전문 된 구획에 축적 및/또는 구획에 로컬 번역에 의해. 이러한 시 냅 스 단백질 기능 시 냅 스를 형성 하기 위해 조직 된 방식으로 배열 될 것으로 간주 됩니다. 시 냅 스 형성을 포함 하는 일부 시 냅스 단백질의 기능 장애 는 신경 질환 결과 4,5. 그러나, 그것은 불분명 한 방법 시 냅 스 단백질 적절 한 타이밍에 축적.
시 냅 스 단백질 조직 된 방식으로 축적 하는 방법을 조사 하기 위해, 연대순으로 시 냅 스 단백질의 축적을 검사 하는 데 필요한. 일부 보고서는 뉴런의 해리 된 문화에서 시냅스 형성을관찰하기 위해 라이브 이미징을 입증 6,7. 그러나, 그것은 단지 현미경 검사법에서 시 냅 스 형성을 시작 하는 신경 세포를 찾는 시간이 많이 걸립니다. 시 냅 스 단백질의 축적을 효율적으로 관찰 하기 위해, 시 냅 스 형성 연구원이 형성을 유도 하 고 싶은 시간에 시작 해야 합니다. 두 번째 과제는 세포체로부터의 수송 또는 시냅스의 국소 번역으로 인한 시냅스 단백질의 축적을 구별하는 것입니다. 그 목적을 위해, 번역 수준은 세포체에서 시냅스 단백질의 수송을 허용하지 않는 조건하에서 측정될 필요가 있습니다.
뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 새로운 프리시냅스 형성 분석방법을 개발하여 프리시냅스 형성을 유도한다8. 뉴런 볼 배양은 세포체9,10을둘러싼 축색 시트의 형성으로 인해 축색 표현형을 검사하기 위해 개발된다. 우리는 흥분성 presynapssss를 유도하는 시냅스 조이커인 류신 풍부 한 반복 막 간 뉴런 2 (LRRTM2)와 결합 된 자기 구슬을 사용 (그림1A)11,12,13. LRRTM2 비드를 사용하여, 구슬이 적용되는 시점에서 presynapse 형성이 시작됩니다. 즉, presynapse 형성 은 동시에 뉴런 볼의 축축의 수천에서 시작, 따라서 그것은 시 냅 스 단백질의 축적의 정확한 시간 과정을 효율적으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 뉴런 볼 배양은 세포체를 제거함으로써 소마로부터 시냅스 단백질을수송하는 것을 차단하기 쉽다(도1B)8. 우리는 이미 세포체가 없는 축세포가 생존할 수 있고 세포체 제거 후 적어도 4시간 동안 건강하다는 것을 확인했습니다. 따라서, 이 프로토콜은 시냅스 단백질이 유래되는 곳(세포체 또는 축색)과 시냅스 단백질이 조직화된 방식으로 어떻게 축적되는지 를 조사하는 데 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>항체 희석제</td><td>DAKO</td><td>S2022</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-585-151</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-Munc18-1</td><td>BD Biosciences</td><td>610336</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum 무료</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 Alubumin (BSA)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01863-48</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 처리 된 멀티 디쉬 (4 웰 디쉬)</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>완전한 EDTA-free</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>냉각 CCD 카메라</td><td>Andor Technology</td><td>iXON3</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami</td><td>C015001</td><td>크기 : 15mm, 두께 : 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>시토신 &베타; -D-아라비노푸라노시드 (AraC)</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드 (DAPI)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11034-56</td><td></td></tr><tr><td>데옥시리보뉴클레아제 1 (DNase I)</td><td>Wako 순수 화학 물질</td><td>047-26771</td><td></td></tr><tr><td>Expi293 발현 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14635</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>NIS-element AR</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Inverted fluorecent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#143-06561</td><td></td></tr><tr><td>N-propyl gallate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>29303-92</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26126-25</td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(MW > 300,000)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28359-54</td><td></td></tr><tr><td>폴리(비닐 알코올)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>사전 포장된 일회용 PD-10 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>토끼 항소포성 글루타메이트 수송체 1</td><td>Synaptic Systems</td><td>135-302</td><td></td></tr><tr><td>SCAT 20X-N(중성 비인 세제)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>41506-04</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-coated magnetic particles</td><td>Spherotech Inc</td><td>SVM-40-10</td><td>직경: 4-5 &마이크로; m</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>18172-94</td><td></td></tr></tbody></table>

presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 "뉴런 공" 문화를 사용 하 여

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

신경 발달 도중, 시냅스 대형은 신경 회로를 설치하는 중요한 단계입니다. 시 냅 스를 형성 하기 위해, 시 냅 스 단백질 은 미성숙 시 냅 스에서 세포 체 및/또는 로컬 번역에서 전송 하 여 적절 한 순서로 공급 해야 합니다. 그러나, 그것은 완전히 이해 되지 않습니다 어떻게 시 냅 스 단백질 적절 한 순서로 시 냅 스에 축적. 여기서, 우리는 뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 시냅스 전 형성을 분석하여 시냅스 전 형성을 유도하는 새로운 방법을 제시한다. 신경 세포 응집체인 뉴런 볼은 세포체와 모수석에서 멀리 떨어진 축축한 시트를 제공하므로 세포체의 압도적인 신호를 피함으로써 약한 형광 신호가 검출될 수 있습니다. 구슬은 presynapse 대형을 트리거하기 때문에, 우리는 류신이 풍부한 반복 막 간 신경 2 (LRRTM2), 흥분성 presynaptic 주최자와 결합된 구슬을 사용합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 소포성 소포 단백질인 소포성 단백질인 소포성 단백질인 소포체 1(vGlut1)이 활성 영역 단백질인 Munc18-1보다 더 빨리 시냅스로 축적된다는 것을 입증했습니다. Munc18-1 세포 체를 제거 한 후에도 presynapse에 의존적으로 축적 된 번역. 이 발견은 세포체에서 수송되지 않는 축색에 있는 현지 번역에 의하여 Munc18-1 축적을 나타냅니다. 결론적으로,이 방법은 시 냅 스 및 시 냅 스 단백질의 소스에 시 냅 스 단백질의 축적을 분석 하는 데 적합 하다. 뉴런 볼 배양이 간단하고 특수 장치를 사용할 필요가 않기 때문에이 방법은 다른 실험 플랫폼에 적용 될 수 있습니다.

여기서, 우리는 신경 볼 배양액의 축사 시트의 LRRTM2 유도 전시냅스에서 시냅스 전 단백질의 축적의 대표적인 결과를 보여준다. 시냅스 전 단백질로서, 우리는 흥분성 시냅스 소포 단백질 vGlut1 및 활성 영역 단백질 Munc18-1을 분석했다. 우리는 또한 presynapses에 있는 vGlut1와 Munc18-1의 축적의 시간 과정을 검토하고, 세포 바디및 단백질 합성 억제기를 제거하는 축세포를 사용하여 presynapses에 있는 Munc18-1의 근원을 나타내는 결과를 얻었습니다. 최근, 우리는 presynapses8에서 Munc18-1의 축적에 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질(FMRP)의 역할을 조사했다. FMRP는 깨지기 쉬운 X 증후군 (FXS)의 원인이 되는 유전자 생성물이며, 번역17,18,19를억제...

Presynapse 형성은 적절한 순서로 시 냅 스 단백질의 축적을 포함 하 여 동적 과정. 이 방법에서, presynapse 형성은 "뉴런 볼" 배양물의 축축한 시트에 presynapse 조직 단백질과 공액된 구슬에 의해 유발되므로 시냅스 단백질의 축적은 presynapse 형성 동안 분석되기 쉽습니다.

Presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 "뉴런 공" 문화를 사용 하 여

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

이 프로토콜은 전신 단백질이 어디에서 유래하는지 조사하기에 적합합니다: 세포 체 또는 축축. 그리고 시냅스 형성 중에 사전 시냅스 형태로 사전 합성 단백질이 축적되는 방법. 이 기술은 동시에 수천 개의 presynapses를 유도할 수 있으며, 축산기내의 많은 프리시냅스의 형성을 효율적으로 분석할 수 있도록 배양에서 축축을 유지하기 위해 특별한 장치를 사용하지 않는다.대학원생호나미와 함께 이 과정을 시연하는 것은 내 실험실에서 학부생인 리 이시이(Rie Ishii)가 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 안락사로 이 절차를 시작합니다. 복부를 해부하여 E16 배아를 얻습니다.미세 한 양포의 도움으로 배아에서 뇌를 조심스럽게 제거하고 HEPES 완충 염 용액 또는 HBSS의 4 밀리리터를 포함하는 60 mm 세포 배양 요리로 옮기. 수막을 제거하고 후각 전구를 잘라. 스테레오 현미경의 밑에 집게의 미세한 끝을 사용하여 각 대뇌 반구에서 각 코르티스를 분리하고 신선한 HBSS를 포함하는 또 다른 60 밀리미터 접시로 전송합니다.각 별도의 뉴런 볼 배양에 대해 적어도 3~5개의 배아를 사용하십시오. 라미나르 플로우 세포 배양 후드에 미세 한 초세 스프링 가위를 가진 작은 조각으로 코르티코를 잘라. 이제 다진 코르티체를 15밀리리터 튜브로 옮기게 합니다.섭씨 37도의 수조에서 4.5분 동안 HBSS에서 0.125%의 트립신4밀리리터로 다진 코르티스를 트립시비티. 멸균 전달 파이펫에 의해 HBSS의 10 밀리리터를 포함하는 새로운 15 밀리리터 튜브로 세포 응집체를 전송합니다. 이 단계를 한 번 더 반복하기 전에 섭씨 37도에서 5분간 배양하십시오.그런 다음 NGB 배지 2밀리리터, 0.01%DNase I 및 10%의 말 혈청을 포함하는 새로운 15밀리리터 튜브로 셀 응집체를 전송합니다. 시험화 된 코르티체를 반복적으로 피펫으로 세팅하여 불을 닦은 미세 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 3 ~ 5 번 피펫을 피우십시오. 뉴런 볼을 준비하기 위해, NGB 배지를 사용하여 밀리리터 당 백만 세포로 세포 현탁액의 세포 밀도를 조정합니다.문화 요리의 하단 부분에 PBS의 일곱 밀리리터를 추가합니다. 10센티미터 배양 접시의 상부 뚜껑 안쪽에 10, 000 세포를 포함하는 10 마이크로리터 매달려 방울로 피질 뉴런을 배양합니다. 뉴런 볼 형성을 허용하기 위해 가습 된 조건에서 5 %의 CO2와 3 7섭씨 37도에서 3 일 동안 인큐베이터에 요리를 보관하십시오.폴리-L-리신 또는 PLL을 파라핀 구슬 유리 커버에 60mm 접시에 코팅하여 산염 버퍼에서 밀리리터 PLL 용액당 15마이크로그램을 사용합니다. 섭씨 37도에서 CO2 인큐베이터에서 최소 한 시간 동안 보관하십시오. PBS로 4회 세척한 후, PLL 코팅 커버 슬립을 NGB 배지 350마이크로리터가 들어 있는 4웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 3개의 마이크로몰러 AraC를 장착합니다.아라C는 분할 세포를 죽일 미디어에 추가됩니다. CO2 인큐베이터에서 PLL 코팅 커버 슬립을 포함하는 4웰 플레이트를 적어도 20분 동안 배양하여 중간 크기의 온도가 섭씨 37도에 도달하도록 한 후 뉴런 볼을 이송합니다. DIV 3에서는 뉴런 볼이 잘 형성되면 PLL 코팅 커버 슬립으로 옮긴다.4웰 플레이트 안에는 웰당 5개의 뉴런 볼을 추가합니다. DIV 11에서 20 마이크로리터를 스트렙타비딘 코팅 자기 입자의 현탁액에서 마이크로센트심리후지 튜브로 이송한다. 비드를 네오디뮴 영구 자석으로 부착한 수제 장치에 고정하고 1.5밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브에 PBS-MCBC 100마이크로리터로 세 번 세척한다.구슬에서 PBS-MCBC를 완전히 제거한 후, 세척된 구슬에 미리 정해진 볼륨의 LRRTM2 스톡을 추가합니다. 1 ~2 시간 동안 섭씨 4도에서 회전기를 사용하여 혼합물을 배양합니다. 인큐베이션에 이어 PBS-MCBC의 100마이크로리터로 구슬을 두 번 씻으실 수 있습니다.그런 다음, NGB 배지의 100 마이크로 리터로 구슬을 세척합니다. 뉴런 볼 배양에 적용하기 위해 NGB 배지 50마이크로리터로 LRRTM2 구슬을 재중단한다. 이제 스테레오 현미경 아래 면도날로 노란색 팁의 끝을 45도 각도로 잘라냅니다.뉴런 볼의 세포 체부위에 노란 팁 끝을 넣고 흡입에 의해 세포 체를 제거한다. LRRTM2를 적용하고 뉴런 볼 배양에 구슬을 제어합니다. 그런 다음 페릿 자석을 사용하여 1 분 동안 뉴런 볼 배양의 플레이트의 바닥에 구슬을 잠급하여 시냅스 형성을 시작합니다.이 절차를 통해 모든 구슬을 동시에 터치 다운할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 구슬을 가진 사전 시냅스 형성 후 뉴런 볼 배양에서 뉴런을 수정하고 얼룩지게 한다. 60X 오일 침지 렌즈를 사용하여 냉각된 CCD 카메라로 반전된 형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트 및 면역 형광 이미지를 캡처합니다.축사내의 시냅스에서 면역형광 강도를 측정합니다. 구슬에 관심 영역의 면역 형광 강도를 사용합니다. 비드에서 20 미크론을 따라 축축 강도로 나누어 오프 구슬 영역 강도를 빼는.배경 강도를 뺀 값입니다. 이 비율 강도는 단백질 축적 지수를 제공합니다. LRRTM2 구슬로 유도된 프리시냅스에서 특정 단백질의 축적 수준을 정량화하려면, 항상 세포 체체와 는 별개로 두 가지 시야 이상의 영역을 선택한다.정확한 측정을 위해 커버슬립당 5개의 다른 축축필드를 선택하십시오. 여기에 비프 11뉴런 볼 배양에 LRRTM2 구슬의 적용이 뉴런 볼의 축록스의 사전 시냅스에서 문크18-1의 유도 축적이다. 뉴런 볼의 축하에 구슬은 위상 현미경 이미지에서 볼 수 있습니다.그리고 전시냅스 단백질의 축적은 면역 형광 심상에 의해 관찰된다. 세포체를 제거한 축산에서도, 문크18-1의 축적은 구슬 아래에서 관찰되었으며, 이는 세포체를 가진 뉴런 볼의 축축과 유사하게. 축산 시트의 주변 영역이 높은 배율 목표 렌즈에 의해 분석되었을 때, vGlut1 및 Munc18-1은 세포 체의 유무에 관계없이 축축의 프리시냅스에서 명확하게 축적되었다.시간 과정 실험은 프리시냅스에서 vGlut1의 축적이 30분에서 크게 증가했다는 것을 보여주었습니다. 한편, 문크18-1 누적은 2시간 만에 크게 증가하기 시작했고 4시간 만에 고원에 도달했다. 이러한 데이터는 시냅스 소포 단백질 vGlut1이 활성 영역 단백질 Munc18-1보다 일찍 프리시냅스에서 축적되었음을 나타낸다.Fmr1-KO 뉴런의 사전 시냅스에서 문크18-1 축적은 야생 형보다 1.5 배 증가하여 문크18-1 축적에서 FMRP의 참여를 나타냅니다. 단백질 합성 억제제, 애니소마이신은 세포 체의 유방부에서 문크18-1 축적을 현저히 억제하였다. 이것은 축적이 단백질 합성에 의존한다는 것을 나타냅니다.불을 연마한 미세 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 트립시화 된 코르티체를 피펫팅하는 것은 중요한 단계입니다. 실험자는 2~3개의 서로 다른 직경으로 불을 닦은 파이펫을 준비하고 적절한 직경의 파이펫을 선택했습니다. 이 절차를 사용하여 LRRTM2 구슬에 의해 유도된 프리시냅스에서 시냅스 방출을 라이브 이미징으로 측정합니다.이 추가 방법은 축산기에서 단백질 합성시 냅 스 방출의 규칙에 관련 된 여부에 대답 할 것 이다. 이 방법을 사용하여, 연구원은 사전 시냅스 단백질이 조직된 방식으로 presynapses에서 어떻게 축적되는지, 뿐만 아니라 사전 시냅스 단백질의 근원의 위치를 검사합니다.

presynapse-formation-assay-using-presynapse-organizer-beads-neuron

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

이 동영상은 행잉 드롭 배양 기법을 사용하여 뉴런 볼을 생성하는 과정을 보여줍니다. 매달린 방울 내에서 세포는 바닥을 향해 이동하여 3차원 구조로 자체 조립되어 신경생물학 연구에 사용할 수 있는 뉴런 볼을 형성합니다.

Hanging Drop Culture 기법을 이용한 뉴런 볼(Neuron Ball) 개발

이 비디오는 미세 유체 장치 및 미세 조작을 사용하여 뉴런의 빠른 시작 및 확장과 대상 뉴런과의 새로운 연결을 생성하는 기술을 보여줍니다. 이것은 외상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 신경 회로를 다시 연결하는 것을 목표로 하는 치료법에 사용될 수 있습니다.

빠른 신경관 확장 및 형성 시작기능적 신경 세포 연결

이 비디오는 재활용된 시냅스 소포의 광학 분석을 위해 배양된 뉴런을 준비하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 시냅스 소포 단백질의 형광 태깅과 면역 염색을 포함하여 뉴런 내의 재활용된 소포를 라벨링하고 시각화합니다.

Preparing Cultured Neurons for Optical Analysis of Recycled Synaptic Vesicles(재활용된 시냅스 소포의 광학 분석을 위한 배양 뉴런 준비)

개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

이 절차는 신경 돌기를 유도하는 마이크로 피펫에 고정 된 폴리 -D- 라이신 - 코팅 된 비드를 사용하여 마이크로 유체 챔버에서 조직화 된 신경을 신속하게 개시, 연장 및 연결하는 방법을 설명합니다.

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

바로 사용할 수있는 냉동 뉴런은 시냅스 기능을 평가하기위한 강력한 도구입니다. 여기에서는 96웰 플레이트를 사용하여 냉동 재고에서 쉽게 추출한 저밀도 1차 배양을 소개합니다.

배아 해마 뉴런의 냉동 재고를 사용한 쉽고 재현 가능한 저밀도 1차 배양

학습하세요 뉴런 볼 배양과 프리시냅스 주최자 구슬을 이용한 프리시냅스 형성 분석 방법입니다. 이 기술은 수천 개의 시냅스를 동시에 유도하여 축삭에서 단백질 축적 과정을 효율적으로 연구할 수 있습니다.

Presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 "뉴런 공" 문화를 사용 하 여

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