Name: 앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 앵커드 멀티플렉스 PCR과 차세대 염기서열 분석을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 방법을. 임상 종양 샘플에서 진단 및 치료 결정에 필수적인 유전자 융합을 정확하게 식별하는 기술입니다.

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이 작품은 콜로라도 대학의 분자 병리학 공유 자원에 의해 지원되었다 (국립 암 연구소 암 센터 지원 보조금 번호. P30-CA046934) 및 개인 의학콜로라도 센터에 의해.

<ol><li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li>
<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li>
<li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li>
<li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li>
<li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li>
<li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li>
<li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li>
<li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li>
<li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li>
<li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li>
<li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li>
<li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li>
<li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li>
<li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22JCO+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510(2017).</li>
<li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li>
<li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation%3A+Report+of+10+Cases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li>
<li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li>
</ol>

D.L.A.는 바이엘 종양학, 제넨테크, 애브비, 브리스톨 마이어스 스퀴브로부터 컨설팅 비용을 받았습니다. K.D.D.는 ArcherDx로부터 후원 여행을 받았습니다.

고정된 멀티플렉스 PCR 기반 표적 농축 및 라이브러리 준비와 차세대 염기서열 분석이 임상 종양 샘플에서 다중유전자 융합 평가에 적합합니다. 게놈 DNA보다는 RNA 입력에 집중함으로써, 크고 반복적인 인트론을 서열화할 필요가 회피됩니다. 추가적으로, 이 접근은 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 증폭하기 때문에, 새로운 융합은 검출됩니다. 이는 임상 영역에서 중요한 이점이며, 문헌21,22,23,24에보고된 AMP를 통해 확인된 실행 가능한 새로운 유전자 융합의 많은 예가있었다. 25.
분석이 RNA 기반이기 때문에 처리 중에 샘플에서 RNA 품질을 보존하는 것이 중요합니다. ...

단일 전사 엔티티로 2개 이상의 유전자의 융합은 삭제, 복제, 삽입, 반전 및 전좌를 포함한 대규모 염색체 변이의 결과로 발생할 수 있다. 발현된 유전자 생성물의 변질된 전사 제어 및/또는 변경된 기능적 특성을 통해, 이러한 융합 유전자는 암세포에 종양발생 특성을 부여할 수 있다1. 많은 경우에, 융합 유전자는 세포 증식 및 생존 경로를 직접 활성화하여 1 차적인 종양 발생 드라이버로 작용하는 것으로 알려져 있습니다.
암 환자를 위한 유전자 융합의 임상 적 관련성은 먼저 만성 골수성 백혈병 (CML)에서 필라델피아 염색체 및 상응하는 BCR-ABL1 융합 유전자의 발견으로 명백해졌습니다 2. 소분자 억제제 imatinib mesylate는 이러한 융합 유전자를 구체적으로 표적으로 하기 위해 개발되었으며 BCR-ABL1-양성CML 환자3에서현저한 효능을 입증하였다. 종양발생 유전자 융합의 치료적 표적화는 또한 고형 종양에서 성공하였고, 비소세포 폐암에서 ALK 및 ROS1 융합 유전자의 억제가 1차 적인 예로 4,5를수행하고 있다. 최근, NTRK 억제제 라로트렉티닙은 질병 부위 6에 관계없이 NTRK1/2/3 융합양성 고형 종양에 대한 FDA 승인을 받았다. 치료 선택을 넘어, 유전자 융합 검출은 또한 질병 진단 및 예후에서 역할이 있습니다. 이것은 특정 융합의 존재에 의해 진단적으로 정의되는 각종 육종 및 혈액학 악성 아류형에서 특히 널리 퍼져 있고/또는 융합의존재가 예후7,8을 직접 알려줍니다 , 9개 , 10개 , 11.이들은 암 환자를 위한 유전자 융합 검출의 임상 적용의 예에 불과하다.
임상 의사 결정에 중요한 역할을 하기 때문에 임상 샘플에서 정확한 유전자 융합 검출이 매우 중요합니다. 세포유전학 기술, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 신계 혼성화(FISH) 형광 등 융합 또는 염색체 재배열 분석을 위한 임상 실험실에 수많은 기술이 적용되었습니다. 면역막이화학(IHC) 및 5'/3' 발현 불균형 분석(그 외)12,13,14,15. 현재, 암에 있는 실행 가능한 유전자 융합의 급속하게 팽창하는 목록은 동시에 다중 유전자의 융합 상태를 평가할 필요 귀착되었습니다. 따라서, 한 번에 하나 또는 몇 개의 유전자만 쿼리할 수 있는 몇몇 전통적인 기술은 비효율적인 접근이 되고 있습니다, 특히 임상 종양 견본이 수시로 아주 유한하고 몇몇 분석실험 사이에서 분할되는 것을 허용되지 않다는 것을 고려할 때. 그러나 차세대 염기서열 분석(NGS)은 다중 유전자 검사에 적합한 분석 플랫폼이며 NGS 기반 분석실험은 임상 분자 진단 실험실에서 일반화되고 있습니다.
융합/재배열 검출을 위해 현재 사용되는 NGS 분석제는 사용된 입력 물자, 도서관 준비 및 표적 농축을 위해 채택된 화학, 및 분석분석내에서 질의된 유전자의 수에 관하여 변화합니다. NGS 검소는 샘플로부터 추출된 RNA 또는 DNA(또는 둘 다)에 기초할 수 있다. RNA 기지를 둔 분석은 높게 저하된 RNA를 포함하는 임상 견본의 경향에 의해 방해되더라도, DNA 기지를 둔 융합 시험의 표적이 고 수시로 반복적인 인트론을 순서를 정하는 필요를 우회합니다 그러나 NGS를 위해 어려운 것으로 입증되었습니다 데이터 분석16. RNA 기반 NGS 공소시에 대한 표적 농축 전략은 크게 하이브리드 포획 또는 앰플리콘 매개 접근법으로 나눌 수 있다. 두 전략이 융합 검출에 성공적으로 활용되었지만 각각 다른17,18에비해 장점이 있습니다. 하이브리드 포획 분석법은 일반적으로 더 복잡한 라이브러리를 초래하고 대립계 탈락을 감소시키는 반면, 앰플리코 기반 분석법은 일반적으로낮은 입력을 필요로 하고 오프 타겟 시퀀싱이 적은 19를 초래한다. 그러나, 아마도 전통적인 amplicon 기반 농축의 주요 제한은 모든 알려진 된 융합 파트너에 프라이머에 대 한 필요성. 이것은 많은 임상적으로 중요한 유전자가 다른 파트너의 수십와 융합하기 위하여 알려지고 있기 때문에 문제가 되고, 프라이머 디자인이 모든 알려진 파트너의 탐지를 위해 허용되더라도, 새로운 융합 사건은 검출되지 않는 남아 있을 것입니다. 최근에 설명한 기술은 앵커드 멀티플렉스 PCR(또는 짧게 AMP)을 지칭하여 이 제한20을해결한다. AMP에서, '반 기능' NGS 어댑터는 입력 RNA에서 파생되는 cDNA 단편에 결찰된다. 표적 농축은 유전자 특이프라이머와 어댑터에 대한 프라이머 사이의 증폭에 의해 달성된다. 그 결과, 관심 있는 유전자에 대한 모든 융합이 새로운 융합 파트너가 관여하더라도 검출되어야 한다(도 1참조). 이 문서에서는 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합의 검출을 위해 표적 농축 및 라이브러리 준비를 위해 AMP를 사용하는 NGS 기반 분석인 ArcherDx FusionPlex 고형 종양 키트의 사용에 대해 설명합니다(보충 표 1 전체 유전자 목록)을 참조하십시오. 습식 벤치 프로토콜 및 데이터 분석 단계는 임상 실험실 개선 수정안(CLIA) 인증 실험실에서 엄격하게 검증되었습니다.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td><td>IDT</td><td>11-05-01-13</td><td>TNA 희석에 사용</td></tr><tr><td>1M Tris pH 7.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9850G</td><td>라이브러리 풀링에 사용</td></tr><tr><td>분배기가 있는 25mL 시약 저장소</td><td>USA Scientific</td><td>9173-2000</td><td>다중 채널 피펫 및 대용량 시약과 함께 사용</td></tr><tr><td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9700</td><td>thermocycler 단계에 사용되는 플레이트</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 비즈</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>여러 분석 단계 후 정제에 사용</td></tr><tr><td>Agencourt Formapure Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A33343</td><td>TNA 추출에 사용</td></tr><tr><td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td><td>ArcherDX</td><td>AB0005</td><td>이 키트에는 Illumina 염기서열분석을 위한 라이브러리 전처리를 수행하는 데 필요한 대부분의 시약이 포함되어 있습니다(Ion Torrent 염기서열분석용 키트도 사용 가능)Cold</td></tr> <tr><td>block, 96-well</td><td>Light Labs</td><td>A7079</td><td>다양한 단계에서 샘플을 냉각시키는 데 사용</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>DSP-MD.43</td><td>비드 세척에 사용</td></tr><tr><td>Illumina 내부 통제 표준</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4906</td>에 대한 라이브러리 정량화<td>라이브러리 정량화에 사용됨</td></tr><tr><td>라이브러리 정량화 프라이머 및 ROX Low qPCR 믹스</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4973</td><td>라이브러리 정량화에 사용</td></tr><tr><td>라이브러리 정량 표준</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4903</td><td>라이브러리 정량화에 사용</td></tr><tr><td>자석 플레이트, 96웰(N38 등급)</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td>비드 정제 단계에 사용</td></tr><tr><td>MBC 어댑터 세트 B</td><td>ArcherDX</td><td>AK0016-48</td><td>멀티플렉스 염기서열분석을 가능하게 하는 시료별 인덱스를 포함하는 어댑터</td></tr><tr><td>Micro Centrifuge</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td>PCR 튜브를 스핀다운하는 데 사용</td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 웰 플레이트</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4483485</td><td>Pre-Seq QClibrary 정량화에 사용</td></tr><tr><td>Microamp 광학 필름 압축 패드</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312639</td><td>라이브러리 정량화에 사용</td></tr><tr><td>Mini Plate Spinner</td><td></td><td>Labnet MPS-1000</td><td>플레이트 웰 바닥에서 액체를 콜렉싱하는 데 사용</td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v3 (600 사이클)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td>MiSeq 염기서열분석 실행에 필요한 구성 요소 포함</td></tr><tr><td>MiSeqDx 시스템</td><td>Illumina</td><td></td><td>NGS 염기서열</td></tr><tr><td>분석 기기 모델 9700 Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>여러 단계에 사용됩니다. 분석</td></tr><tr><td>뉴클레아제 자유 물</td><td>Ambion</td><td>9938</td><td>일반 희석제로 사용</td></tr><tr><td>광학 ABI 96-well PCR 플레이트는</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4311971</td><td>사전 seq QClibrary 정량 분석에 사용</td></tr><tr><td>PCR 워크스테이션 모델 600</td><td>공기 청정 시스템</td><td>BZ10119636</td><td>이 '데드 에어 박스'에서 수행되는 습식 벤치 분석 단계</td></tr> <tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>1019499</td><td>사용 TNA 추출에서</td></tr><tr><td>PreSeq 및 라이브러리 정량화에 사용되는 QuantStudio</td><td>5</td><td>Applied Biosystems</td><td>LSA28139</td> qPCR 기기</tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td>TNA 샘플의 RNA 농도 측정에 사용</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Fisher</td><td>12-402-178</td><td>작업 영역의 일반 RNase 오염 제거에 사용</td></tr><tr><td>Seraseq FFPE 종양 융합 RNA 참조 물질 v2</td><td>SeraCare</td><td>0710-0129</td><td>분석 양성 대조군으로 사용</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP359-212</td><td>세척 단계 및 염기서열분석 설정에 사용</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>172-5120</td><td>PreSeq QC 분석</td></tr><tr><td>TempAssure PCR 8-튜브 스트립</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>시약 및 샘플 혼합 등에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>템플릿 RT PCR 필름</td><td>USA Scientific</td><td>2921-7800</td><td>96웰 플레이트</td></tr><tr><td>U-하단 96웰 마이크로플레이트</td><td>LSP</td><td>MP8117-R</td><td>비드 정제 시 사용</td></tr></tbody></table>

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

유전자 융합은 많은 다른 유형의 암의 종양 발생 표현형에 자주 기여합니다. 추가적으로, 암 환자에게서 견본에 있는 특정 융합의 존재는 수시로 진단, 예후 및/또는 치료 선택에 직접적인 영향을 미칩니다. 그 결과, 유전자 융합의 정확한 검출은 많은 질병 유형에 대한 임상 관리의 중요한 구성 요소가되었습니다. 최근까지, 임상 유전자 융합 검출은 주로 단일 유전자 검법의 사용을 통해 달성되었다. 그러나, 임상 중요성을 가진 유전자 융합의 계속 증가하는 목록은 동시에 다중 유전자의 융합 상태를 평가하기위한 필요성을 만들었습니다. 차세대 염기서열 분석(NGS) 기반 테스트는 핵산을 대규모 병렬 방식으로 서열화하는 능력을 통해 이러한 요구를 충족시켰습니다. 유전자 표적 농축을 위한 다른 전략을 채택하는 다중 NGS 기지를 둔 접근은 지금 그것의 자신의 강점 및 약점을 가진 임상 분자 진단에서 사용하기 위하여 유효합니다. 이 논문은 임상 고형 종양 표본에서 유전자 융합을 평가하기 위해 NGS에 이어 앵커된 멀티플렉스 PCR(AMP) 기반 표적 농축 및 라이브러리 제제의 사용을 설명합니다. AMP는 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 식별한다는 점에서 앰플리콘 기반 농축 접근법 중에서 독특합니다. 여기에 상세한 임상 샘플에서 정확한 유전자 융합 검출을 보장하는 습식 벤치 및 데이터 분석 단계 모두있습니다.

도 3, 도 4 및 도 5에 도시된 것은 폐 선암 샘플로부터의 결과를 보여주는 분석 사용자 인터페이스로부터의 스크린샷이다. 도3에서 샘플 요약은 강력한 증거 융합이라고 불리는 강력한 증거 융합과 QC 상태(빨간색 원으로 동그라미)를 나열하는 표시(위)입니다. ADCK4-NUMBL 융합(3개의 등소폼이 나열됨)은 영구 전사 판독 이벤트이기 때문에 즉시 무시됩니다(목록 옆에 있는 깨진 원 아이콘으로 표시됨). 그림 3의 하단은 통계 읽기 페이지의 스크린샷입니다. 특히 유익한 지표는 녹색으로 동그라미로 표시됩니다. 샘플의 통과/실패 특성을 결정하는 중요한 QC 메트릭은 빨간색으로 강조 표시됩니다(위의 요약에서 합격/실패 상태를 지시하는 메트릭). 이 값이...

이 기사에서는 임상 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합을 평가하기 위해 차세대 염기서열 분석 뒤에 앵커된 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응 기반 라이브러리 준비 키트의 사용을 자세히 설명합니다. 습식 벤치 와 데이터 분석 단계가 모두 설명되어 있습니다.

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

이 프로토콜은 환자 종양 샘플을 위한 비판적인 유익한 유전자 융합의 검출을 위해 이용됩니다. 수십 개의 유전자의 융합 상태는 단일 분석에서 동시에 평가됩니다. 이 기술의 장점은 공식 고정에 의해 처리된 종양 샘플로부터 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 식별할 수 있다는 것이다.임상 종양 샘플에서 특정 유전자 융합의 검출은 많은 암 유형에서 진단, 예후 및 치료 선택을 직접 알려줍니다. 분석 알고리즘에 의해 호출 되는 많은 융합아티팩트 는 이해 하는 것이 중요 하다. 데이터를 분석할 때 가장 어려운 작업은 아티팩트와 실제 퓨전 호출을 구별하는 것입니다.RNA의 원하는 농도를 달성하기 위해 총 핵산을 희석하여 시작합니다. 각 샘플에 대해, 사전 냉각 된 알루미늄 블록에서 임의의 프라이밍 시약 스트립 튜브로 희석 20 마이크로 리터를 전송하고 6 ~ 8 번 위아래로 파이펫하여 혼합합니다. 샘플을 잠시 회전시키고 전체 부피를 96웰 PCR 플레이트로 옮기고 플레이트 실러 필름으로 밀봉합니다.플레이트를 열순환기에 삽입하고 압축 패드로 덮고 뚜껑을 닫습니다. 섭씨 65도에서 5분간 배양하세요. 인큐베이션 후, 첫 번째 가닥 시약 스트립 튜브에서 임의 프라이밍 제품의 전체 부피를 전송합니다.위아래로 파이프를 섞고 잠시 회전합니다. 전체 볼륨을 96웰 PCR 플레이트로 전송하고 RT 필름으로 씰을 밀봉합니다. 열순환기에 플레이트를 삽입하고 원고 방향에 따라 반응을 실행합니다.두 번째 가닥 cDNA 합성을 수행하고, 원고 방향에 따라 1단계 의 수리 및 결찰 단계를 수행하고 제2 회합 단계로 진행한다. 분자 바코드 또는 MBC 어댑터 스트립 튜브의 번호를 지정하려면 튜브를 뒤쪽에 힌지로 수평으로 배치하고 영구 마커를 사용합니다. 첫 번째 결찰 단계에서 비드 정화 플레이트를 가져 와서 각 샘플의 40 마이크로 리터를 MBC 어댑터 스트립 튜브로 옮기면 비드 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.시약을 파이펫팅하여 혼합하고, 튜브를 회전시키고, 전체 부피를 리딩 단계 2 시약 스트립 튜브로 옮킨다. 샘플을 혼합하고 회전하고 열순환기 블록에 배치합니다. 가열 된 뚜껑을 끄고 5 분 동안 22도에서 온도 순환을 실행하고 섭씨 4도 홀드합니다.다음으로, 그들을 소용돌이와 PCR 스트립 튜브의 새로운 세트에 50 마이크로 리터를 추가하여 결찰 정리 구슬을 준비합니다. 자석에 1 분 동안 배양하고 상체를 폐기하십시오. 자석에서 스트립 튜브를 제거하고 위아래로 파이프팅하여 결찰 정리 버퍼의 50 마이크로 리터에서 구슬을 다시 분리합니다.두 번째 결찰 단계에서 전체 샘플 볼륨을 리딩 정리 비드 스트립으로 옮킨다. 샘플을 혼합하여 10 분 동안 실온에서 둡니다. 배양을 통해 한 번 샘플을 소용돌이.그 후 샘플을 소용돌이쳐 내고, 샘플을 회전시키고, 자석에 1분 동안 배양합니다. 상체를 폐기하고 200 마이크로리터의 신선한 리칭 정리 버퍼를 추가합니다. 소용돌이가 다시 중단하고, 회전하고, 자석에 1분 동안 놓습니다.두 세척 후 버퍼 대신 초순수물을 사용하여 세 번째 세척을 수행합니다. 5밀리미터 의 20 마이크로리터에서 구슬을 재중단하고 샘플을 96웰 PCR 플레이트로 옮기습니다. 플레이트를 압축 패드가 있는 열순환기에 넣고 섭씨 75도에서 10분 동안 실행한 다음 섭씨 4도 를 유지합니다.샘플이 섭씨 4도로 냉각되면 적어도 3분 동안 자석에 접시를 놓고 첫 번째 PCR을 진행합니다. 첫 번째 PCR 시약 스트립의 각 웰에 GSP1 프라이머의 2개의 마이크로리터를 추가하여 PCR 반응을 준비합니다. 제1 PCR 시약 스트립 튜브로 제2 리칭 정리 제품의 18 마이크로리터를 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.샘플을 회전하고 96웰 PCR 플레이트로 옮기습니다. 온도 순환기에 넣고 원고 의 지시에 따라 PCR을 실행합니다. PCR 제품의 마이크로리터 20마이크로리터를 우물당 24마이크로리터로 채워진 U-bottom 플레이트에 첨가하여 비드 정화를 진행한다.파이펫을 위아래로 섞고 실온에서 5분 동안 방치한 다음 자석에 플레이트를 2분 동안 배양합니다. 구슬에서 슈퍼 난자를 버리고 70 %의 200 마이크로 리터로 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 후, 에탄올을 모두 제거하고 2 분 동안 시료 공기를 건조하게하십시오.자석에서 플레이트를 제거하고 10mm Tris-HCl 및 pH 8.0의 24 마이크로 리터에서 구슬을 다시 놓습니다. 자석을 3분 동안 배양한 다음 2분 동안 자석에 다시 접시를 놓습니다. 10mm Tris-HCl에서 두 번째 PCR 제품의 1~5희석을 준비하여 라이브러리 수량을 시작합니다.1:199, 1:199, 20:80의 연속 희석으로 이 것을 10mm Tris-HCl에서 05%의 폴리소르바테로 이에 따라보세요. 광학 96웰 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 6마이크로리터를 추가하고 적절한 희석 또는 표준의 4개의 마이크로리터를 추가하여 키 PCR을 설정합니다. 플레이트를 회전시키고 qPCR 계측기로 로드합니다.원고 의 지시에 따라 qPCR을 수행합니다. 라이브러리 정량화가 완료되면 모든 라이브러리를 10mm Tris-HCl로 두 나노몰러로 희석합니다. 정규화된 각 라이브러리의 10마이크로리터를 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 결합하여 라이브러리 풀을 만드십시오.다음으로, 도서관 풀의 10마이크로리터와 0.2보통나트륨을 결합하고 실온에서 5분간 혼합물을 배양하여 분해된 앰플리콘 라이브러리 또는 DAL 풀을 준비한다. 인큐베이션 후 pH 7.0에 200mm Tris-HCl의 10마이크로리터를 추가하고 HT1 혼성화 버퍼의 970 마이크로리터를 추가합니다. HT1 300 마이크로리터, 20피코몰러 PhiX의 25마이크로리터, DAL 풀의 675마이크로리터를 결합하여 최종 하중 튜브를 만드십시오.시퀀서 시약 카트리지의 샘플웰에 로드 튜브의 전체 부피를 추가하고 카트리지를 시퀀서에 로드합니다. 먼저 양수 제어 샘플을 선택하고 모든 예상 융합 및 온코겐 성 동소형태가 검출되어 강력한 증거 탭에 나열되었는지 확인합니다. 각 샘플에 대해 GSP2 제어 값당 평균 고유 시작 사이트를 검사한 다음 사용자가 개별 퓨전 지원 읽기의 더미에 대한 웹 기반 JBrowse 뷰로 사용자를 안내하는 시각화 링크를 클릭하여 각 잠재적 융합에 대한 지원 판독값을 시각화합니다.판독글은 대부분 불일치가 없는지 확인하지만, 30개 이상의 판독기 염기는 융합 파트너와 일치하며, 유전자와 프라이머 결합 부위 사이의 중단점에 인접한 서열은 삽입 또는 삭제가 없다. 모든 통화 융합이 일반적으로 정렬 불량이 없고 판독값의 상당 부분이 융합 파트너에 정렬되도록 하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 폐 아데노암 샘플에서 유전자 융합 상태를 조사하는 데 사용되었습니다.요약은 강력한 증거 퓨전을 보여 주며 통계 읽기 페이지에는 샘플의 메트릭이 표시됩니다. 이 샘플은 좋은 RNA 품질을 나타내므로 퓨전이 발견되지 않으면 부정적인 결과가 보고될 것입니다. 합법적인 융합 호출에는 많은 수의 지원 읽기, 융합을 지원하는 프라이머의 높은 비율 및 많은 수의 시작 사이트가 있습니다.읽기의 시각화는 융합 파트너의 큰 영역에 좋은 정렬을 보여 줍니다. 반대로, 아티리얼 융합 호출은 파트너와 매핑할 때 지지 지표가 낮고 오류율이 높습니다. 분석 알고리즘에 의해 만들어진 관절 융합 호출은 일반적입니다.환자 샘플에서 실제 유전자 융합을 나타내는지 확인하기 위해 모든 통화를 수동으로 검사하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 치료 관리를 위해 검사해야 하는 분자 바이오마커가 증가함에 따라 빠르고 신뢰할 수 있는 분자 검출 방법의 개발이 촉진되었습니다. 초고속 차세대 염기서열분석(NGS) 접근법을 사용하여 NS-NSCLC 환자에 대한 게놈 변형 평가를 위한 워크플로우를 설명합니다.

비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석

이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 표본에서 유전자 증폭을 시각화하는 재현 가능한 방법을 제공합니다.

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

이 프로토콜은 비소세포폐암(NSCLC) 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 표적 가능한 게놈 변경을 검출하기 위한 자동화된 ISO15189 인증 차세대 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다.

차세대 시퀀싱을 사용한 비소세포폐암의 표적 변화 검출

학습하세요 앵커드 멀티플렉스 PCR과 차세대 염기서열 분석을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 방법을. 임상 종양 샘플에서 진단 및 치료 결정에 필수적인 유전자 융합을 정확하게 식별하는 기술입니다.

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

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