앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

이 프로토콜은 환자 종양 샘플을 위한 비판적인 유익한 유전자 융합의 검출을 위해 이용됩니다. 수십 개의 유전자의 융합 상태는 단일 분석에서 동시에 평가됩니다. 이 기술의 장점은 공식 고정에 의해 처리된 종양 샘플로부터 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 식별할 수 있다는 것이다.

임상 종양 샘플에서 특정 유전자 융합의 검출은 많은 암 유형에서 진단, 예후 및 치료 선택을 직접 알려줍니다. 분석 알고리즘에 의해 호출 되는 많은 융합아티팩트 는 이해 하는 것이 중요 하다. 데이터를 분석할 때 가장 어려운 작업은 아티팩트와 실제 퓨전 호출을 구별하는 것입니다.

RNA의 원하는 농도를 달성하기 위해 총 핵산을 희석하여 시작합니다. 각 샘플에 대해, 사전 냉각 된 알루미늄 블록에서 임의의 프라이밍 시약 스트립 튜브로 희석 20 마이크로 리터를 전송하고 6 ~ 8 번 위아래로 파이펫하여 혼합합니다. 샘플을 잠시 회전시키고 전체 부피를 96웰 PCR 플레이트로 옮기고 플레이트 실러 필름으로 밀봉합니다.

플레이트를 열순환기에 삽입하고 압축 패드로 덮고 뚜껑을 닫습니다. 섭씨 65도에서 5분간 배양하세요. 인큐베이션 후, 첫 번째 가닥 시약 스트립 튜브에서 임의 프라이밍 제품의 전체 부피를 전송합니다.

위아래로 파이프를 섞고 잠시 회전합니다. 전체 볼륨을 96웰 PCR 플레이트로 전송하고 RT 필름으로 씰을 밀봉합니다. 열순환기에 플레이트를 삽입하고 원고 방향에 따라 반응을 실행합니다.

두 번째 가닥 cDNA 합성을 수행하고, 원고 방향에 따라 1단계 의 수리 및 결찰 단계를 수행하고 제2 회합 단계로 진행한다. 분자 바코드 또는 MBC 어댑터 스트립 튜브의 번호를 지정하려면 튜브를 뒤쪽에 힌지로 수평으로 배치하고 영구 마커를 사용합니다. 첫 번째 결찰 단계에서 비드 정화 플레이트를 가져 와서 각 샘플의 40 마이크로 리터를 MBC 어댑터 스트립 튜브로 옮기면 비드 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.

시약을 파이펫팅하여 혼합하고, 튜브를 회전시키고, 전체 부피를 리딩 단계 2 시약 스트립 튜브로 옮킨다. 샘플을 혼합하고 회전하고 열순환기 블록에 배치합니다. 가열 된 뚜껑을 끄고 5 분 동안 22도에서 온도 순환을 실행하고 섭씨 4도 홀드합니다.

다음으로, 그들을 소용돌이와 PCR 스트립 튜브의 새로운 세트에 50 마이크로 리터를 추가하여 결찰 정리 구슬을 준비합니다. 자석에 1 분 동안 배양하고 상체를 폐기하십시오. 자석에서 스트립 튜브를 제거하고 위아래로 파이프팅하여 결찰 정리 버퍼의 50 마이크로 리터에서 구슬을 다시 분리합니다.

두 번째 결찰 단계에서 전체 샘플 볼륨을 리딩 정리 비드 스트립으로 옮킨다. 샘플을 혼합하여 10 분 동안 실온에서 둡니다. 배양을 통해 한 번 샘플을 소용돌이.

그 후 샘플을 소용돌이쳐 내고, 샘플을 회전시키고, 자석에 1분 동안 배양합니다. 상체를 폐기하고 200 마이크로리터의 신선한 리칭 정리 버퍼를 추가합니다. 소용돌이가 다시 중단하고, 회전하고, 자석에 1분 동안 놓습니다.

두 세척 후 버퍼 대신 초순수물을 사용하여 세 번째 세척을 수행합니다. 5밀리미터 의 20 마이크로리터에서 구슬을 재중단하고 샘플을 96웰 PCR 플레이트로 옮기습니다. 플레이트를 압축 패드가 있는 열순환기에 넣고 섭씨 75도에서 10분 동안 실행한 다음 섭씨 4도 를 유지합니다.

샘플이 섭씨 4도로 냉각되면 적어도 3분 동안 자석에 접시를 놓고 첫 번째 PCR을 진행합니다. 첫 번째 PCR 시약 스트립의 각 웰에 GSP1 프라이머의 2개의 마이크로리터를 추가하여 PCR 반응을 준비합니다. 제1 PCR 시약 스트립 튜브로 제2 리칭 정리 제품의 18 마이크로리터를 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

샘플을 회전하고 96웰 PCR 플레이트로 옮기습니다. 온도 순환기에 넣고 원고 의 지시에 따라 PCR을 실행합니다. PCR 제품의 마이크로리터 20마이크로리터를 우물당 24마이크로리터로 채워진 U-bottom 플레이트에 첨가하여 비드 정화를 진행한다.

파이펫을 위아래로 섞고 실온에서 5분 동안 방치한 다음 자석에 플레이트를 2분 동안 배양합니다. 구슬에서 슈퍼 난자를 버리고 70 %의 200 마이크로 리터로 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 후, 에탄올을 모두 제거하고 2 분 동안 시료 공기를 건조하게하십시오.

자석에서 플레이트를 제거하고 10mm Tris-HCl 및 pH 8.0의 24 마이크로 리터에서 구슬을 다시 놓습니다. 자석을 3분 동안 배양한 다음 2분 동안 자석에 다시 접시를 놓습니다. 10mm Tris-HCl에서 두 번째 PCR 제품의 1~5희석을 준비하여 라이브러리 수량을 시작합니다.

1:199, 1:199, 20:80의 연속 희석으로 이 것을 10mm Tris-HCl에서 05%의 폴리소르바테로 이에 따라보세요. 광학 96웰 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 6마이크로리터를 추가하고 적절한 희석 또는 표준의 4개의 마이크로리터를 추가하여 키 PCR을 설정합니다. 플레이트를 회전시키고 qPCR 계측기로 로드합니다.

원고 의 지시에 따라 qPCR을 수행합니다. 라이브러리 정량화가 완료되면 모든 라이브러리를 10mm Tris-HCl로 두 나노몰러로 희석합니다. 정규화된 각 라이브러리의 10마이크로리터를 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 결합하여 라이브러리 풀을 만드십시오.

다음으로, 도서관 풀의 10마이크로리터와 0.2보통나트륨을 결합하고 실온에서 5분간 혼합물을 배양하여 분해된 앰플리콘 라이브러리 또는 DAL 풀을 준비한다. 인큐베이션 후 pH 7.0에 200mm Tris-HCl의 10마이크로리터를 추가하고 HT1 혼성화 버퍼의 970 마이크로리터를 추가합니다. HT1 300 마이크로리터, 20피코몰러 PhiX의 25마이크로리터, DAL 풀의 675마이크로리터를 결합하여 최종 하중 튜브를 만드십시오.

시퀀서 시약 카트리지의 샘플웰에 로드 튜브의 전체 부피를 추가하고 카트리지를 시퀀서에 로드합니다. 먼저 양수 제어 샘플을 선택하고 모든 예상 융합 및 온코겐 성 동소형태가 검출되어 강력한 증거 탭에 나열되었는지 확인합니다. 각 샘플에 대해 GSP2 제어 값당 평균 고유 시작 사이트를 검사한 다음 사용자가 개별 퓨전 지원 읽기의 더미에 대한 웹 기반 JBrowse 뷰로 사용자를 안내하는 시각화 링크를 클릭하여 각 잠재적 융합에 대한 지원 판독값을 시각화합니다.

판독글은 대부분 불일치가 없는지 확인하지만, 30개 이상의 판독기 염기는 융합 파트너와 일치하며, 유전자와 프라이머 결합 부위 사이의 중단점에 인접한 서열은 삽입 또는 삭제가 없다. 모든 통화 융합이 일반적으로 정렬 불량이 없고 판독값의 상당 부분이 융합 파트너에 정렬되도록 하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 폐 아데노암 샘플에서 유전자 융합 상태를 조사하는 데 사용되었습니다.

요약은 강력한 증거 퓨전을 보여 주며 통계 읽기 페이지에는 샘플의 메트릭이 표시됩니다. 이 샘플은 좋은 RNA 품질을 나타내므로 퓨전이 발견되지 않으면 부정적인 결과가 보고될 것입니다. 합법적인 융합 호출에는 많은 수의 지원 읽기, 융합을 지원하는 프라이머의 높은 비율 및 많은 수의 시작 사이트가 있습니다.

읽기의 시각화는 융합 파트너의 큰 영역에 좋은 정렬을 보여 줍니다. 반대로, 아티리얼 융합 호출은 파트너와 매핑할 때 지지 지표가 낮고 오류율이 높습니다. 분석 알고리즘에 의해 만들어진 관절 융합 호출은 일반적입니다.

환자 샘플에서 실제 유전자 융합을 나타내는지 확인하기 위해 모든 통화를 수동으로 검사하는 것이 중요합니다.