Name: 무척 추 병리학 연구를 향한 Rhipicephalus 마이크로 플러스 진드기에 Metarhizium 발 파 포자의 혈 림프 수집 및 접종을 공개 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 Rhipicephalus microplus 진드기에 Metarhizium 균 포자를 접종하고 혈림프를 수집하는 방법을. 이 기술은 진드기 면역 반응과 병원체 상호작용 연구에 필수적인 정보를 제공합니다.

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이 연구는 브라질, 금융 코드 001에서 Coordenacão 드 아 페로 멘토 드 Pessoal 드 Nível 우수한 (망 토)에 의해 부분적으로 재정 되었다. 케이프는 A.F. 마 르 치아 노에 대 한 박사 학위 장학금을 제공 했습니다. J. 피 오 로티에 대 한 박사 학위 장학금을 제공 하기 위해 브라질의 과학 기술 개발 (CNPq)에 대 한 국가 협의회에 감사 드립니다. 이 연구는 또한 리오 데 자네이로 (F공포증) 및 CNPq의 국가의 연구를 위한 카를로스 샤 가스 Filho 재단의 보조금에 의해 지원 되었다. V.R.E.P. 비 텐 코트는 CNPq 연구원 이다.

본 연구에서 사용 되는 진드기는 척추 동물 동물 (CEUA/UFRRJ #037/2014)의 사용에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 된 리오 데 자네이로의 연방 농촌 대학에서, 인공 식민지 로부터 얻어 졌다.
1. 진드기를 안은 여성
<ol><li>진드기 채집 후, 수돗물을 사용 하 여 암컷을 세척 하 고 500 mL 유리 비 커 수용자에 3 분 동안 0.5%의 차 아 염소 산 나트륨 용액에 담가 두고, 큐티 클 위생을 위해 (그림 1) 멸 균 페이퍼 타월을 사용 하 여 모든 여성을 건조 시키십시오 (그림 2).</li>
	<li>여성을 동종의가 중 그룹 (각각 20 여 명의 여성)으로 나눕니다: 1 개의 대조 군에는 아무런 처리도 없이, 0.1%의 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 모노로 에이트 수 용액 (v/v)을 5 µ로 접종 하 고, 1.0 x 10에서 5 µ L을 접종 하 고 1 개 감염 기 7 블로 투 포자 mL-1 참고: 치료 되지 않은 진드기만 부피 및 혈액 세포 농도에 사용 되었다. 각 그룹에 대 한 3 개의 반복이 수행 되었습니다.</li>
</ol>2. 흠집과 카피의 병원 균 접종
참고: 본 연구에서는,도 토모 병원 성 진 균 현 탁 액을 일례로 사용 하였다.
<ol><li>0.1% 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 모노로 에이트 수 용액 (v/v)의 1 mL에 곰 팡이 발 포 포자를 일시 중단 하 고 최종 농도의 1.0 × 107 배도 포자 mL-1로 조절 한다. 5 µ L Metarhizium 의 배 반 포자를 추가 합니다 (그림 3) 플라스틱 파라핀 필름의 표면에 현 탁 액을 첨가 한다. 참고: 노이 바 우 어 ´ s 챔버를 사용 하 여 조정 된 발 포 포자 현 탁 액. 접종 과정을 가속화 하기 위해, 다중 버블은 5 µ L에 대응 하는 각 버블, 플라스틱 파라핀 막 표면에 첨가 될 수 있다.</li>
	<li>1 mL 초 미세 인슐린 주사기와 0.3 mm 바늘을 사용 하 여 현 탁 액을 당기고 진드기에 접종 하십시오. 사용 하기 전에 주사기에서 모든 공기를 꺼내 잊지 마십시오.</li>
	<li>스 쿠 툼과 카피 자리 사이의 진드기 암컷으로 진 균 현 탁 액의 5 µ L 접종. 균 류 없이 0.1%의 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 수 용액 (v/v)을 5 µ L의 대조 군 으로부터 암컷 접종. 참고: 바늘을 삽입 한 후에 혈 림프 작은 양이 있을 수 있습니다. 공기를 접종 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
</ol>3. 다리 허벅지와 진드기 여성의 몸 사이에 토모 병원 성 진 균의 접종
<ol><li>암컷은 0.3 mm 바늘에 결합 된 1 mL 초 미세 인슐린 주사기 를 사용 하 여 다리 tigh와 여성의 몸 사이에 곰 팡이 현 탁 액 (5 µ l 1.0에서 107blasto포자 mL-1)으로 여성을 접종 합니다. 0.1% 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 모노 롤 레이트 수 용액 (v/v)의 5 µ L을 사용 하 여 대조 군 으로부터 암컷을 접종 한다. 참고: 다리 tigh와 진드기 여성의 신체 사이에서 수행 되는 양 발 포 포자 접종 시, 소량의 혈 림프 바늘 삽입 후 tigh에 존재할 수 있다. 공기를 접종 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
</ol>4. 등 쪽 혈 림프 컬렉션
<ol><li>날개 달린 주입 세트의 고무 부분, 0.3 mm 모 세관 튜브 및 필터링 된 팁을 사용 하 여 혈 림프 컬렉션을 수행 하십시오.</li>
	<li>0.3 mm 바늘을 사용 하 여 여성 등 쪽 큐티 클을 파괴 하십시오.</li>
	<li>중단 후, 진드기 몸체의 앞쪽 부분에 완만 한 압력을가 하십시오. 붕괴 부위를 잡아당기면 서 거의 투명 한 액체가 관찰 됩니다. 날개 달린 주입 세트의 고무 부분에 결합 된 필터 팁과 0.3 mm 모 세관을 통해 액체를 흡입 하 여 혈 림프를 수집 한다. 주:이 중간 장을 방해 하 고 혈 림프을 오염 시킬 수 있기 때문에 진드기의 몸을 고정 하는 동안 거의 누르지 마십시오. 부드러운 압력이 오염 없이 유체를 추방 할 수 있을 때까지 기다리십시오.</li>
</ol>5. 진드기의 다리에서 혈 림프 컬렉션
<ol><li>진드기를 움직이지 않게 하 고, 앞 다리의 한 조각을가 위 한 쌍으로 자릅니다. 주: 하나 이상의 다리를 절단 할 수 있을 뿐만 아니라 동일한 다리를 한 번 이상 절단할 수 있습니다.</li>
	<li>진드기의 후부 몸통 부분에 부드러운 압력을가 합니다. 4.3 단계에서 설명한 바와 같이 절단 부 위에 표시 되는 투명 한 액체 버블을 관찰 하 고 모 세관 튜브로 수집 합니다. 주:이 중간 장을 방해 하 고 혈 림프을 오염 시킬 수 있기 때문에 진드기의 몸을 고정 하는 동안 거의 누르지 마십시오. 부드러운 압력이 오염 없이 유체를 추방 할 수 있을 때까지 기다리십시오.</li>
</ol>6. 혈 림프 처리
<ol><li>혈 림프 수집 후, 이전에 30 µ L 프로 테아 제 칵테일 및 82 µ L 염 수 완충 액으로 채워진 1.5 mL 마이크로 튜브에 보관 하십시오. 혈 림프 컬렉션 전체에 마이크로 튜브를 얼음 위에 보관 하십시오.</li>
	<li>원심 분리기 샘플 (4 ° c에서 3 분 500 x g ). 혈 림프 원심 분리 후에 혈 세포의 부드러운 펠 렛이 형성 됩니다. 주: 혈 림프 정량화의 경우, 마이크로 튜브 내부의 총 부피를 세어 얻은 혈 림프 부피를 정량화 하 고 프로 테아 제 칵테일 및 염 분 완충 액의 부피를 할인 합니다.</li>
	<li>상 등 액 (무 세포 혈 림프)을 조심 스럽게 제거 하십시오. 예를 들어, 라이 보 비 츠의 L-15 배양 액을 pH 7.0-7.2로 조정 하 여 세포를 부드럽게 소생 시켰다. 재현 탁 혈 세포의 10 µ L을 노이 바 우 어 챔버에 배치 하 여 혈 세포를 정량화 합니다.</li>
</ol>7. 혈액 모 세포 샘플링 슬라이드 준비
<ol><li>한 쌍의가 위를 사용 하 여 진드기의 앞쪽 다리를 자릅니다.</li>
	<li>진드기의 후부 몸통 부분에 부드러운 압력을가 합니다. 절단 부 위에 나타나는 투명 한 액체 버블을 관찰 하십시오.</li>
	<li>깨끗 한 현미경 슬라이드에 직접 혈 림프 방울을 바르 십시오, 그 후에, 세포를 염색 하기 위하여 충당 된 방법을 사용 하십시오.<ol>
<li>Giemsa를 사용 하 여 혈 색을 염색 하기 위해, 슬라이드 상에 서 혈 림프를 30 분간 공기 건조 하 고, 상 온에서 3 분간 메탄올을 이용 하 여 실 온에서 30 분간, Giemsa 용액 (1:9의 완충 용액, pH 7.2)에서 얼룩을 고정 시켰다. 과량의 염료를 제거 하 고, 슬라이드를 공기 건조 하 고, 광학 현미경으로 400x에서 세포를 평가 하기 위해 흐르는 물로 슬라이드를 씻으십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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병원 균의 접종은 병원 균이 숙주 내에 있다는 것을 보장 하기 때문에 실험에 있어서 미생물의 생체 내 작용을 조사 하는 것을 목적으로 연구를 하는 것이 유용 하다. 이 기술은 또한 RNA 간섭 (RNAi)과 같은 예방 접종 분자에 적용 될 수 있다. 스 쿠 툼과 카피 수 사이에 접종 하는 것은 수행 하기가 더 쉽지만, 종종 계란 생존 율12를저해 하는 게 나의 기관을 손상 시킵니다. Genéum은 해부학 적으로 카피 톨의 앞쪽 부분 가까이에 위치 하 고 있으며 진드기에 대 한 중요 한 기관입니다. 따라서, 다리 tigh와 여성의 몸 사이에 접종 하는 것이 더 적합 하다 연구는 여성의 생물학적 매개 변수의 관찰을 필요로 하는 경우 때문에 ' 게의 장기는 부상 하지 않습니다. 다리 허벅지와 진드기의 몸 사이에 접종 방법은 더 어렵고 쉽게 손상 또는 진드기 내부 장기를 노출에도 불구 하 ...

가축 진드기, Rhipicephalus 마이크로 플러스, 열 대 지역에서 가축에 엄청난 부정적인 영향을 미치는 적혈구. 이 진드기는 직접적인 혈액 공급 손상과 결합 하 여 우유와 육류 생산을 감소 시키고, 빈 혈을 일으키고 궁극적으로 사망을 유발할 수 있는 babesia 우 황, babesia비에 미 나, 그리고 anaplasma 마르지 오와 같은 병원 성 대리인의 벡터입니다. 이 ectoparasite에 기인한 손실은 브라질1에 있는 32억4000만 달러에서 해마다 추정 되었습니다. 지속 가능한 방법은 요구 되 고,도 토모 병원 성 대리인의 사용은 화학 살 비제의 사용을 감소 시키기 위하여 유망한 대 안으로 고려 됩니다2,3,4.
곤충 병원 성 진 균, 예컨대 Metarhizium 의 미생물은 진드기를 포함 한 절지동물의 자연 적 이며, 일부 분리는 바이오 컨트롤러로 서 사용 될 수 있다. 이 병원 체는 표 피를 통해 호스트를 활발 하 게 감염 시키고 그들의 바디2,5,6를 식민지 화 합니다. 감염이 발달 함에 따라, 세포 및 체액 반응은 진드기 면역 계통에 의해 중재 됩니다. 진드기 혈 림프의 분석은 병원 균7,8에 도전 한 후 면역 반응을 평가 하는 유용한 도구로 보고 된다.
절지동물의 면역 반응은 체액 성 및 세포 반응으로 나뉩니다. 체액 성 반응은 hemagglutination 과정 및 항균 단백질/펩 티 드의 생산을 포함 하는 반면, 세포 면역 반응은 혈액 세포를 통해 수행 됩니다. 이 세포는 모든 절지동물에서 혈 림프에 존재 하며 식 균 작용 및 캡슐화 과정과 직접적으로 관련 되어 있기 때문에 타고 난 면역 반응9를 포함 하는 연구에서 표현 역할을 개발 하는 것으로 보고 됩니다. 따라서, 혈 세포에 대 한 연구는 죽음 통로를 조사 하 고 자동 포식, 세포 사 멸 및 괴 사와 같은 과정을 이해 하는 것을 도울 수 있습니다. 이중 밸브로 서 일부 무척 추 동물에서, 혈 세포의 수집은 세포 파괴, 낮은 혈 림프 부피 및 회복 된 세포의 낮은 농도와 같은 한계를 직면 하 게 된다10. 매우 자주 적용 되는 방법론에 따라 세포의 농도가 감소 하 여 세포 정량화 및 분석에 직접적으로 영향을 미칩니다.
혈 림프에서 순환 하는 혈 세포의 수는 다른 절지동물 들 사이에서 가변적 이며 성, 나이 및 절지동물의 발달 단계11과 같은 상이한 생리 적 단계 들로 인해 동일한 종에서 변할 수 있다. 혈 세포는 또한 몇몇 기관에 고착 하 고 감염 과정11직후에 회람으로 풀어 놓을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대부분의 연구 보고 사용 곤충, 진드기 남아 그들의 생리학 및 병리학에 대 한 탐구. 진드기에 있는 병원 체 접종 그리고 혈 림프 수집은 적게 사용 된 기술에도 불구 하 고, 표준 방법을 확립 하는 것은 더 정확한 연구의 발달을 돕습니다.
본 연구의 목적은 병원 균의 혈 림프 수집 및 접종을 위한 가장 많이 사용 되는 방법을 r. 마이크로 플러스 틱에 비교 하 여 혈 림프 획득 및 혈 세포 농도에서의 효능을 평가 하는 것 이었습니다.

<table><tbody><tr><td>알칼리성 차아염소산염 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>유연한 고무</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa 얼룩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기 (바늘)</td><td>BD</td><td>SKU:&nbsp; 324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 배양 매체&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브</td><td>브랜드</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>노이바우어 챔버&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>트윈 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

무척 추 병리학 연구를 향한 rhipicephalus 마이크로 플러스 진드기에 metarhizium 발 파 포자의 혈 림프 수집 및 접종을 공개

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

진드기는이 빈 혈, 체중 감량, 동물의 감가 상각을 유발 하 고 또한 여러 병원 체의 벡터로 작용할 수 있기 때문에, 적 혈 기생충 및 Rhipicephalus 마이크로 플러스 는 수의학에서 매우 중요 하다. 이러한 기생충을 제어 하는 엄청난 비용으로 인해, 화학 살 비제 부적절 하 게 사용 하 여 발생 하는 환경에 대 한 손상, 전통적인 parasiticides에 대 한 저항성 증가, 진드기의 대체 제어, 사용 병원 성 진 균은 예를 들어, 흥미로운 접근법으로 간주 되어 왔다. 그럼에도 불구 하 고, 진드기의 면역 체계가이 병원 균을 싸우는 것을 어떻게 작용 하는지 몇몇 연구 결과는 보여주었습니다. 따라서,이 프로토콜은 혈 림프 수집 및 혈 세포 채취에 사용 되는 두 가지 기술, 튀 여성에 게 토모 병원 균 접종에 사용 되는 두 가지 방법을 보여줍니다. 진드기 여성의 몸에서 다리 삽입 시 병원 균의 접종은 종종 제의 기관을 손상 시키는 스 쿠 툼과 카피 수 사이의 접종과는 달리 여성 생물학 매개 변수를 평가할 수 있습니다. 등 쪽 혈 림프 컬렉션은 다리를 통해 수집 보다 더 높은 볼륨 복구를 산출. 진드기 혈 림프 수집 및 처리의 몇 가지 제한 포함 i) 혈 세포의 붕괴의 높은 속도, ii) 혈 림프 오염 된 미드 창 및 iii) 낮은 혈 림프 볼륨 복구. 혈 림프이 다리 절단을 통해 수집 될 때, 혈 림프는 다리 개 구 부에 축적 되어 응고 과정을 선호 하는 데 시간이 걸립니다. 또한, 첫 번째 방법이 수행 되기 쉬운 것으로 간주 되더라도, 등 쪽 컬렉션에 비해 다리를 통해 수집에서 얻어진 혈 세포 수가 적습니다. En토모 병원 성 에이전트에 의해 매개 된 진드기에 있는 면역 반응을 이해 하는 것은 그들의 병 인을 공개 하 고 진드기 통제를 위한 새로운 표적을 개발 하는 것을 돕습니다. 여기에 설명 된 접종 과정은 매우 낮은 기술 자원이 필요 하며 병원 성 미생물에 진드기를 노출 시키는 데에만 사용할 수 있습니다. 유사 하 게, 틱 혈 림프의 수집은 많은 생리 적 연구를 위한 첫 번째 단계를 나타낼 수 있다.

이 문서에서는 틱에 적용 된 접종 및 혈 림프 수집 방법에 접근 합니다. 다리 허벅지와 진드기 여성의 몸 사이에 접종 후, 일부 유체 (혈 림프) 과정 동안 분 비 될 수 있다; 그러나 접종이 완료 되 면 바늘 끝 이나 접종 현장에 액체 나 조직이 존재 하지 않아 곰 팡이 현 탁 액이 완전히 접종 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 접종 과정이 올바르게 수행 되 면, 바늘 삽입은 암컷 ' 죽음 ' 진드기를 일으키지 않았다. 한편, 진드기는 병원 성 곰 팡이를 접종 한 후 약 48 h를 죽 었 다. 다리 허벅지와 진드기 여성의 몸 사이를 접종 하는 것은 미드 장 및 말 피 관 세관과 같은 진드기 인턴 장기를 손상 시킬 수 있으며, 유전자의 장기 손상은 스 쿠 텀과 카피 수 사이에 접종 하는 동안 발생 합니다.
진드기 중간 장은 지 느 러 미 혈 림프 수집 도중 ...

진드기 혈 림프의 분석은 몇몇 병원 체가 질병을 일으키는 원인이 되는 방법에 대 한 정보의 중요 한 근원 및 어떻게 진드기 면역 학적으로이 감염에 반응 하는지 나타냅니다. 본 연구는 곰 팡이 propagules 접종 하 고 rhipicephalus 마이크로 플러스 튀 여성에서 혈 림프를 수집 하는 방법을 보여줍니다.

무척 추 병리학 연구를 향한 Rhipicephalus 마이크로 플러스 진드기에 Metarhizium 발 파 포자의 혈 림프 수집 및 접종을 공개

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

진드기는 조혈 균 국 외 항문, Rhipicephalus microplus, 널리 가축 진드기로 알려진 열대 지역에서 가축에 엄청난 부정적인 경제적 영향을 미칠. 또한, 화학적 카카르티드의 부적절한 사용과 전통적인 기생충에 대한 진드기 집단의 저항증가로 인한 환경 상태 및 공중 보건 에 대한 우려가 증가하고 있으며, 내모병원성 균류의 사용과 같은 대체 제어 방법에 대한 연구를 자극하고 있다. 이 내모 병원균은 적극적으로 절지동물 호스트를 감염, 그들의 큐티클을 통해 자신의 몸을 식민지.절지동물은 곰팡이 감염에 다른 반응을 가질 수 있습니다. 절지동물 면역 체계는 유머와 세포 반응으로 나뉩니다. 유머 반응은 헤마글루티네이션 공정과 항균 분자의 생산을 포함하지만, 혈구세포는 세포 면역 반응을 중재합니다.절지동물 면역 반응에 대한 대부분의 연구는 곤충을 사용하여 보고되는 반면 진드기 반응은 덜 탐구된 채로 남아 있습니다. 또한, 병원균 접종과 진드기 혈청량 수집은 절지동물의 면역 반응을 더 잘 이해하는 데 필요한 기술이 거의 널리 퍼져 있지 않다. 따라서,이 비디오 주소 기술 \접종, 혈청량 수집 및 처리를 촬영하는 데 사용.진드기 혈류량 수확은 세포 중단, 낮은 혈청계 값 획득 및 회복 된 세포의 낮은 농도와 같은 몇 가지 한계에 직면하기 때문에. 세포 구성 및 분석에 직접 감염됩니다. 진드기 수집 후, 여성을 씻어.수돗물을 사용하고 500 밀리리터 유리 비커 수신자에 3 분 동안 0.5 %의 나트륨 hypochlorite 용액에 담급하십시오. 큐티클 위생을 위해, 20 명의 여성과 동질적인 그룹으로 여성을 분할합니다. 각 그룹의 세 복제가 수행되었습니다.메타리슘 로버츠이 발아 과정에서 사용하였다. 플라스틱 파라핀 필름 표면에 5개의 마이크로리터 메타리슘 블라스트포레스 서스펜션의 액체에 추가합니다. 접종 과정을 가속화하기 위해 플라스틱 파라핀 필름 표면에 여러 기포를 추가할 수 있으며, 각 기포는 5개의 마이크로리터에 해당한다.1밀리미터 초미세 인슐린 주사기와 0.3 밀리미터 바늘을 사용하여 서스펜션을 넣고 진드기에 접종하십시오. 그것을 사용하기 전에 주사기에서 모든 공기를 꺼내는 것을 기억하십시오. 비골과 카피쿨룸 사이의 진드기 여성에게 곰팡이 서스펜션 5 마이크로리터를 접종하십시오.소량의 혈몰리프는 바늘 절개 후 프레임에 존재할 수 있다. 공기를 접종하지 않도록주의하십시오. 0.3 밀리미터 바늘에 결합 된 1 밀리리터 초미세 인슐린 주사기를 사용하여 다리 허벅지와 여성의 몸 사이에 곰팡이 현탁액을 가진 여성을 접종합니다.전이균 블라스트포스포라접종이 다리 허벅지와 진드기 여성의 몸 사이에 수행되면 바늘 삽입 후 허벅지에 소량의 혈류가 존재할 수 있다. 공기를 접종하지 않도록주의하십시오. 날개 달린 주입세트의 고무 부분을 사용하여 0.3 밀리미터 모세관 튜브와 필터 팁을 사용하여 혈굴량 수집을 수행합니다.0.3 밀리미터 바늘을 사용하여 여성 등쪽 표피를 방해하십시오. 중단 후 진드기 몸체의 동맥 부분에 부드러운 압력을 적용합니다. 중단 현장에서 거의 투명한 액체풀링을 관찰하십시오.날개 달린 주입 세트의 고무 부분과 0.3 밀리미터 모세관 튜브에 결합 된 필터 팁을 통해 액체를 빨아 서 혈류를 수집합니다. 이 미드 구트를 방해하고 혈굴을 오염 시킬 수 있기 때문에 그것은 고정 하는 동안 거의 진드기의 시체를 누르지 마십시오. 부드러운 압력이 오염없이 유체를 추방 할 때까지 기다립니다.진드기를 고정합니다. 앞다리 조각을 잘라냅니다. 하나 이상의 다리를 절단 할 수 있을 뿐만 아니라 동일한 다리는 한 번 이상 절단 될 수 있습니다.진드기의 후방 신체 부위에 부드러운 압력을 가하십시오. 투명 액체 거품이 절단 측에 나타나모세피 튜브로 수집합니다. 진드기의 몸을 거의 누르지 마십시오, 그것은 중구를 방해하고 혈우경을 오염 시킬 수 있기 때문에 동원하는 동안.부드러운 압력이 오염없이 유체를 추방 할 때까지 기다립니다. 혈굴량 수집 후, 이전에 30 마이크로 리터 프로테아제 칵테일과 82 마이크로 리터 식염수 버퍼로 가득 1.5 밀리터 마이크로 튜브에 입금. 혈굴량 컬렉션 전체에 걸쳐 얼음에 마이크로 튜브를 유지합니다.혈청량 원심 분리 후 원심분리기 샘플과 혈구의 부드러운 펠릿이 형성될 것이다. 혈청량 정량화를 위해 마이크로튜브 내부의 총 부피를 계산하고 프로테아제 칵테일및 식염수 버퍼의 양을 할인하여 얻은 혈류량을 정량화하십시오. 상체 세포없는 혈청을 조심스럽게 제거하고 세포를 부드럽게 다시 중단하십시오.노이바우어 챔버에 다시 매달린 혈구 10마이크로리터를 배치하여 혈청을 정량화한다. 세포재현수의 경우 배양배지가 사용되었다. 진드기의 앞다리를 자르고, 진드기의 후방 신체 부위에 부드러운 압력을 가하고, 컷 부위에 투명한 액체 거품이 보이는 것을 관찰합니다.깨끗한 현미경 슬라이드에 직접 혈류 강하를 적용합니다. 그 후 세포를 얼룩에 적절한 방법을 사용합니다. 다리 허벅지와 진드기 여성 몸 사이의 접종은 또한 미드구트와 말피기안 튜블러와 같은 진드기 내부 장기를 손상시킬 수 있습니다.진드기 미드구트가 등막혈수집에서 바늘에 의해 중단되면 얻어진 유체는 빨간색이며 투명하지 않습니다. 이는 잘못된 혈몰리프 컬렉션을 나타냅니다. 이 경우 혈모 림프는 오염된 대로 폐기되어야 합니다.혈굴림 오염은 진드기가 높은 병원체에 자연적으로 감염될 때, 또는 접종된 병원체에 기인한 죽음 과정 후에 마지막 단계에서 관찰될 수 있습니다. 등쪽 컬렉션 후 얻은 혈청량은 다리를 통해 컬렉션에서 얻은 부피보다 높다. 오염의 용이함에도 불구하고 첫 번째 수집 방법에서 더 높다.혈구 농도도 등대 수집에서 상당히 높았다. 올바른 혈구 수집이 수행되면 좋은 얼룩을 얻을 수 있으며 염색 후 다른 혈구를 구별 할 수 있습니다. 이 비디오는 병원균, 특히 내모 병원성 곰팡이를 진드기로 접종하고 혈류를 수집하는 방법에 대한 정보를 제공했습니다.여기에서 제시된 기술은 진드기 생리학, 진드기 병리학 및 진드기의 면역 반응에 관하여 연구를 위한 우리의 고전적인 단계에 있는 아주 낮은 기술 자원을 요구합니다. 절지동물 세포의 올바른 수확과 세포없는 혈청은 후속 연구를위한 신뢰할 수있는 정보를 제공하는 데 중요합니다. 이러한 이유로 이러한 기술의 실행에서 관찰되는 가장 일반적인 실수를 인식하는 것도 중요합니다.또한, 이 연구의 제안은 얻어진 부피의 차이와 오염 확률을 고려하여 다리를 변형하거나 절단하여 혈청량 수집에 더 적합한 부위를 결정한다.

disclosing-hemolymph-collection-inoculation-metarhizium-blastospores

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

감염된 진드기의 hemolymph, 침샘, 그리고 타액의 컬렉션 병원균이 질병을 일으킬 방법 진드기 매개로 공부하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는 먹이로부터 hemolymph과 침샘을 수집하는 방법을...

Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

전기 천공은 Rickettsia 속에 외인성 DNA를 도입하기 위해 빠르고 광범위하게 채택 된 방법입니다. 이 프로토콜은 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아의 형질 전환에 유용한 전기 천공 방법을 제공합니다.

Rickettsia spp.를 Tick 세포주에서 형광 단백질 발현 셔틀 벡터로 형질전환하기 위한 전기천공 방법

우리는 후속 분석을 위해 작은 절지동물에서 정량화 가능한 혈림프를 효율적으로 수집하는 방법을 설명합니다.

작은 절지동물에서 체림프를 수집하기 위한 정확하고 정량화 가능한 방법

이 기사에서는 임상 연구를 위해 인간을 유충 Ixodes scapularis 에 노출시키는 방법을 제시합니다. 이 기술은 비교적 간단하고 연구 지원자가 견딜 수 있으며 실험적 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 인간 피험자를 대상으로 하는 이러한 연구는 해당 규제 당국이 승인한 임상 연구 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다.

유충 Ixodes scapularis 진드기에 대한 인간의 실험적 노출을 위한 모델

여기에서는 먹이를 먹인 개별 진드기를 해부한 후 타액, 혈림프, 침샘 및 중장을 수집하여 진드기 매개 병원체의 조직 특이적 국소화를 연구하여 벡터 능력 및 병원체-미생물군집 상호 작용에 대한 이해를 높이는 프로토콜을 제시합니다.

개별 진드기(Acari: Ixodidae)에서 타액, 혈림프, 침샘 및 중장 추출

이 방법은 3D 프린팅 챔버와 실험실에서 제작한 실리콘 막을 통합한 시험관 내 진드기 혈액 공급 시스템 개발을 개략적으로 설명합니다. 이 시스템은 진드기 인공 먹이를 가능하게 하여 다양한 먹이 단계에서 쉽게 샘플링할 수 있고, 혈액량도 적어 이조디드 진드기 연구에 매우 유용한 도구가 됩니다.

Ixodid 진드기 연구에서 3D 프린팅된 챔버의 인공 막을 통해 진드기 혈액을 공급하는 모습

배우세요 Rhipicephalus microplus 진드기에 Metarhizium 균 포자를 접종하고 혈림프를 수집하는 방법을. 이 기술은 진드기 면역 반응과 병원체 상호작용 연구에 필수적인 정보를 제공합니다.

무척 추 병리학 연구를 향한 Rhipicephalus 마이크로 플러스 진드기에 Metarhizium 발 파 포자의 혈 림프 수집 및 접종을 공개

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