Name: MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 배우세요 소형 RNA 시퀀싱 및 오픈 소스 바이오인포매틱스 도구를 활용한 microRNA 분석 방법을. 겔 정제를 통해 microRNA를 정확히 수집하고 질병 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 앤드류 화재와 마크 케이의 실험실의 구성원에게 지침과 제안에 감사드립니다.

동물 실험은 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
작은 RNA 라이브러리 준비
1. RNA 격리
<ol><li>표준 RNA 격리 시약 또는 마이크로RNA를 농축하는 키트를 사용하여 생물학적 공급원으로부터 RNA를 분리합니다. 조직의 경우 액체 질소에서 스냅 냉동 시료로 시작하여 미리 냉각 된 모르타르와 유봉을 사용하여 분말로 분쇄하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>RNA를 정량화하고 RNA 무결성 번호(RIN)를 제공할 수 있는 기기에서 각 샘플의 RNA 무결성을 측정합니다. Rin은 >7이어야 합니다.</li>
</ol>2. 3' 어댑터 결찰
<ol><li>PCR 스트립 튜브에서 결찰 반응을 준비: RNA 11 μL (1-3 μg, 각 샘플에 대해 동일한 양을 사용), 1.5 μL의 10x T4 RNA 리가제 반응 완충제, ATP 무료, 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG) 1 μL, 및 0.5 μL의 3'링커 (100m 00ml 커)를 참조하십시오. 참고: ATP가 없으면 miRNA를 풍부하게 하고 mRNA 분해 제품의 복제를 최소화할 수 있습니다. PEG는 분자 군중 에이전트의 역할을, 성공적인 결찰을 강화. 범용 miRNA 클로닝 링커는 5' 말단에서 RNA에 대한 자가 결찰, 순환화 및 결찰을 방지하기 위해 3' 차단기(amine)를 가지고 있다.</li>
	<li>샘플을 30-40초 동안 열자전거에 95°C에서 가열합니다. 1 분간 얼음에 냉각. T4 RNA ligase 2의 1 μL을 추가하고 2 시간 동안 실온에서 배양하십시오. 참고 : 실온에서 의 인큐베이션은 링커 링커 결찰을 방지하는 데 도움이됩니다. 우리는 또한 성공적으로 T4 RNA 리가제 1을 사용했습니다.</li>
	<li>8 M 우레아 (20x20 cm 젤의 경우)와 15 % 폴리 아크릴 아미드 젤의 30 mL을 준비 : 14.4 g의 요소, 10 x 트리스 완충제 에틸렌디아 미네 테 아세트산 (TBE),11.2 mL 의 40 % 19 : 1아크릴아미드, H 20. 용액은 42°C에서 가장 잘 용해됩니다. 주조 직전에, 중합을 위해 10% 황황산 암모늄(APS)과 테트라메틸틸렌디아민(TEMED)의 30 μL을 첨가합니다.</li>
	<li>플라스틱 주조에 0.8mm 분리 된 유리 판을 붓고 빗을 삽입하십시오. 겔이 고화되면 (약 20 분), 0.5 x TBE를 탱크에 넣고 활발하게 파이펫팅하여 잔류 우레아의 우물을 씻습니다.</li>
	<li>우레아가 젤에 들어갈 수 있도록 샘플없이 25 분 동안 일정한 375 V에서 젤을 미리 실행한 다음 우물을 다시 씻으십시오. 참고: 사용되는 전원 공급 장치 및 전기 동공 시스템의 유형에 따라 전압양을 줄여야 할 수 있습니다.</li>
	<li>시료가 결찰이 완료되면, 15 μL의 아크릴아미드 로딩 염료를 샘플에 추가한 다음(1:1 비율의 경우), 열순환기에서 95°C에서 5분 동안 변성합니다.</li>
	<li>한 부분아크릴아미드 로딩 염료로 희석한 37 및 44bp 크기의 마커 25ng/μL을 준비합니다. 시퀀스는 표1에 나열됩니다.</li>
	<li>폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 로드하여 각 샘플 사이에 적어도 하나의 레인을 남깁니다. 젤 방향을 추적하기 위해 비대칭 패턴으로 적어도 두 세트의 마커를 20 μL로드하십시오.</li>
	<li>처음 15분 동안 일정한 375V에서 겔을 실행한 다음 나머지 실행에 대해 일정한 425V로 증가시다. 브로모페놀 블루가 바닥에서 약 1-4cm가 될 때까지 달리면 약 2시간이 걸립니다. 참고: 필요한 경우, 브로모페놀 블루가 바닥에서 약 1-4cm가 될 때까지 더 낮은 일정한 전압으로 겔을 실행할 수 있다.</li>
	<li>플레이트 세퍼레이터를 사용하여 유리 판에서 젤을 제거하고 플라스틱 페이지 보호기 위에 젤을 놓습니다. 증류수 500 μL에서 에티듐 브로마이드 5 μL을 희석하고, 피펫을 상단 연한 파란색 마커 바로 위에 있는 마커 레인에 대십시오(그림 1A참조). 주의: 에티듐 브로마이드에 장갑을 사용하고 현지 규정에 따라 폐기물을 폐기하십시오. 5분 동안 앉습니다.</li>
	<li>자외선(UV) 빛 아래에서 깨끗한 면도날을 사용하여 각 레인의 마커를 위에서 아래로 잘라냅니다(그림 1A참조). 실험실 밀봉 필름의 4 x 4cm 사각형으로 옮김을 옮은 다음 약 4 컷으로 젤을 가로로 3 개 자르고 수직으로 3 개를 잘라 12 개의 작은 사각형을 생성합니다 (그림 1B참조).</li>
	<li>피펫 400 μL 의 0.3 M NaCl을 밀봉 필름 정사각형에, 및 1.5 mL 실리콘 튜브로 깔때기 겔 조각(도 1C참조). 밤새 4°C에서 영양기에서 샘플을 교반합니다. 참고: 다른 저보유1.5mL 튜브는 실리콘 튜브로 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>4 °C에서 적어도 12 시간 의 교반 후, 샘플을 회수하고 100 % 에탄올의 원엽 튜브와 함께 얼음에 넣습니다.</li>
	<li>400 μL의 상구체를 새로운 튜브로 옮은 다음 1 00% 에탄올 1 mL과 15 mg/mL 글리코겐 응침제 1 μL을 추가합니다. 4 °C에서 회전하고 필요에 따라 더 많은 파이펫팅, 가능한 한 많은 상급을 수집해야합니다. 1시간 동안 -80°C, 2시간 이상 -20°C에 놓습니다. 글리코겐 응침제는 펠릿 가시성과 회복을 향상시킵니다.</li>
	<li>20-30 분 동안 17,000 x g에서 4 °C에서 회전하십시오.</li>
</ol>3. 5' 링커 결찰
<ol><li>6.5 μL의 뉴클레아제 없는 물에 파이펫팅하여 펠릿을 다시 현탁시합니다. 펠릿을 먼저 몇 분 동안 물에 담그면 다시 서스펜션에 도움이 됩니다.</li>
	<li>펠릿을 회전시키고 물에 다시 일시 중단한 후 0.5 μL의 100 μM 5'-링커(바코드 사용; 표 1참조), T4 RNA 리가제 완충제 1μL, 10 mM ATP 1μL, PEG 1 μL을 추가합니다. 90°C에서 30초 동안 가열한 다음 얼음 위에 놓습니다. T4 RNA 리가제 1μL을 넣고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>400 μL의 0.3 M NaCl을 추가하고 400 μL의 산 페놀 / 클로로포름을 넣습니다. 소용돌이 30 s - 1 분 (용액은 흐린 것처럼 보입니다),다음 미세 원심 분리기에서 최대 속도로 10-15 분 동안 4 °C에서 회전합니다 (~17,000 x g). 상단 층을 끄고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치합니다. 주: 아래쪽 도면층 중 어느 쪽도 파이펫팅하지 마십시오.</li>
	<li>클로로폼, 와류 350 μL을 짧게 추가한 다음 4°C에서 최대 속도(~17,000 x g)로 10분 동안 회전합니다. 나중에 상단을 끄고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치하십시오. 글리코겐 응침제 1.5 μL과 100% 에탄올 1 mL를 첨가합니다. 참고: 다시, 바닥 레이어 중 어느 쪽도 파이펫팅하지 마십시오.</li>
	<li>소용돌이를 짧게, 적어도 1 시간 동안 -80 °C, 또는 -20 °C 하룻밤 동안 놓는다.</li>
</ol>4. 역전사 (RT)
<ol><li>42°C 의 열 블록을 켭니다. 샘플을 4°C에서 ~ ~17,000 x g에서 20-30 분 동안 돌립니다.</li>
	<li>8.25 μL의 뉴클레아제 없는 물에 펠릿 샘플을 다시 일시 중단한 다음, cDNA 합성 키트에서100 μM RT 프라이머(표 1)의 0.5 μL 및 2x RT 반응 믹스5 μL을 첨가합니다. 42°C에서 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 샘플에 1.5 μL의 10x RT 효소를 넣고 열전자전거에서 30분 동안 42°C에서 배양합니다. -20°C에 두거나 가수분해 및 중화를 계속하십시오. 참고: 단계 4.2 및 4.3에 여러 RT 키트를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>알칼리성 가수분해 및 중화 수행: 1mL의 1mL의 수산화칼륨(KOH) 용액(1M KOH 150 μL, 1 M Tris Base pH 7.5, 830 μL 의H2O) 및 1mL의 1mL(HCl 15L 및 H5L 의 HCl) H2O)의</li>
	<li>시료에 첨가하기 전에 KOH 용액을 중화하는 데 필요한 HCl의 양을 결정합니다. 일반적으로, HCl의 약 20-24 μL은 KOH의 25 μL을 중화시킬 것이다. pH 스트립의 조합을 확인하여 올바른 범위(pH 7.0 ~ 9.5)에 있는지 확인합니다.</li>
	<li>150 mM KOH 용액의 25 μL을 첨가하여 샘플을 가수 분해하고 95 °C에서 10 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4.4단계에서 결정된 150 mM HCl의 양을 첨가하여 샘플을 중화시키고, 7.0 및 9.5 사이의 최종 샘플 pH를 얻었다.</li>
</ol>5. PCR 증폭
<ol><li>중화 후, PCR 반응을 준비: 물 29.5 μL, 10x Taq 버퍼의 5 μL, dNTP의 1 μL,2 μL의 2 μL 25 μM 앞으로 프라이머 (표 1), 2 μL의 2 μL 의 2 μL (표1),Taq의 0.5 μL, 및 역전사 cDNA의 0.5 μL .</li>
	<li>다음 의 PCR 반응을 실행: 94°C 에 대 한 2 분, 다음 20 사이클 94°C의 94 s에 대 한 45 s, 50 °C 75 s에 대 한 그리고 72°C 60 s에 대 한.</li>
	<li>5.2단계에서 5 μL의 제품을 사용하여 약 2-4사이클의 두 번째 PCR 반응을 실행한다. 혼합: 물 34.8 μL, 10x Taq 완충제 의 5 μL, dNTP의 1 μL, 25 μM 전진 프라이머의 1 μL (표1),25 μM 역프라이머의 1 μL (표1),및 0.2 μL의 Taq 폴리머라제. 5.2단계에서 설명한 것과 동일한 열자전거 매개변수를 따릅니다. 참고: 두 개의 PCR 반응을 수행하는 목적은 20사이클에 대한 첫 번째 와 2-4주기에 대한 두 번째 - 증폭된 cDNA의 양이 동적 범위(즉, 포화 양이 아님)에 있는지 확인하는 것입니다.</li>
</ol>6. 아가로즈 젤 정제
<ol><li>저용해 아가로즈를 가진 4% 아가로즈 젤을 준비합니다. 로딩 염료와 함께 40 μL 이상의 PCR 제품을 젤에 적재하십시오. 100bp 및 25bp 크기 마커를 로드합니다. 참고 : 25 bp 사다리는 링커 링커 결찰 제품에서 증폭 된 제품을 구별하는 데 도움이됩니다. 저용융 아가로즈 젤은 기존의 아가로즈 젤보다 더 세게 주조해야 하므로 제조업체의 지침을 철저히 따라야 합니다.</li>
	<li>젤 추출의 경우 젤에 표시되지만 포화되지 않은 주기 번호를 선택합니다(일반적으로 22-24사이클). 여러 샘플을 실행할 때 비슷한 강도 밴드를 선택합니다.</li>
	<li>125bp 대역 위에 있는 밴드를 잘라냅니다(25bp 래더의 어두운 밴드; 그림 1D참조). 젤 추출 키트를 사용하여 4% 젤을 기반으로 완충액을 추가하기 위한 제조업체의 지침을 따르고 흔들어 실온에서 완충액으로 아가로즈를 녹입니다. 참고: 55°C에서 용해되면 링커-링커 결찰의 가능성이 높아진다.</li>
	<li>제조업체의 젤 추출 지침을 따르고 용출 완충제 또는 물 30 μL로 용출하십시오. 제품이 젤에 약해 보였다면 용출을 20 μL로 줄입니다.</li>
	<li>민감한 기술을 사용하여 cDNA 농도를 측정하고 시퀀싱을 위한 샘플 라이브러리를 준비합니다. 준비는 사용되는 시퀀싱의 유형에 따라 달라집니다. 참고: 시퀀싱 라이브러리에 대한 최소 요구 사항은 일반적으로 10 μM 제품의 10 μL 부피입니다. 농도가 너무 낮으면, 풀과 에탄올은 원하는 농도로 라이브러리를 가지고 샘플을 침전.</li>
	<li>사용 가능한 장비를 사용하여 샘플을 순서를 정합니다. 일반적인 예는 50bp 단일 읽기용 키트를 사용하여 샘플을 실행하여 FASTQ 출력 형식으로 약 15-25백만 개의 읽기를 가져오는 것입니다.</li>
</ol>작은 RNA 서열 정렬 및 생물 정보학
7. 데이터 업로드
<ol><li>각 시퀀싱 실행에서 생성된 FASTQ 파일을 다운로드합니다. miRbase.org 8,9,10에서마이크로RNA 헤어 핀 시퀀스 목록을 다운로드합니다.</li>
	<li>www.usegalaxy.org 갤럭시 계정을 생성하고 이 계정에 읽는 순서의 FASTQ 파일을 업로드합니다.</li>
	<li>텍스트 파일로 사용할 수 있는 barcodes.txt와 같은 바코드 시퀀스의 텍스트 파일을 Galaxy 계정에 업로드합니다(보충표1).</li>
	<li>miRBase.org 같은 데이터베이스에서 갤럭시 계정에 마이크로 RNA 헤어 핀의 FASTA 파일을 업로드합니다. 마우스(mousehairpins.fa) 또는 인간(humanhairpins.fa) microRNA 전구체의 예는 보충표 2 및 보충표3에 제공된다.</li>
</ol>8. 어댑터 제거, 바코드 정렬 및 트림
<ol><li>왼쪽 탭에서 게놈 파일 조작 > FASTA/FASTQ > 클립 어댑터 시퀀스로이동합니다.</li>
	<li>FASTA 또는 FASTQ형식의 입력 파일에서 드롭다운 목록에서 FASTQ 파일을 입력합니다. 최소 시퀀스 길이를 18로 변경합니다. 사용자 지정 시퀀스를입력하려면 소스를 변경합니다. CTGTAGGC를입력합니다. 다른 모든 기본 매개 변수를 유지합니다. 실행을클릭합니다. 참고: 18개 뉴클레오티드보다 짧은 서열 판독은 마이크로RNA에 고유하게 매핑하기 어렵고 많은 분해 생성물을 함유한다.</li>
	<li>왼쪽 탭에서 게놈 파일 조작 > FASTA/FASTQ > 바코드 스플리터로이동합니다. 참고: Galaxy 함수와 헤더는 주기적으로 업데이트되므로 검색 기능이 동등한 도구 또는 해당 위치를 찾는 데 필요할 수 있습니다. 인덱싱된 프라이머를 사용하는 상용 키트는 이미 바코드별로 정렬되는 경우가 많습니다. 따라서 상용 키트로부터 시작하는 경우 이 단계와 바코드 트림 단계가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>바코드를 사용하려면 barcodes.txt를 가리킵니다. 라이브러리를 분할하려면이전 단계에서 생성된 데이터 파일에 대한 클립을 사용합니다. 허용된 불일치수에서 1을입력합니다. 실행을클릭합니다.</li>
	<li>처음 4 개의 뉴클레오티드를 트리밍 : 텍스트 조작으로 이동 > 선행 또는 후행 문자를잘라. 입력 데이터집합의 경우 데이터 집합 모음인 폴더 아이콘을 클릭합니다. 데이터에 바코드 스플리터레이블이 포함된 샘플의 일괄 처리 파일을 선택합니다. 이 위치까지 처음부터 트림에서 5를입력합니다. 에서 입력 데이터 집합FASTQ 형식으로? 실행을클릭합니다. 실행은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
</ol>9. 마이크로RNA에 대한 읽기 정렬
<ol><li>갤럭시에서, 유전체학 분석으로 이동 > RNA-Seq > 돛새치 성적 증명서 정량화11.</li>
	<li>질문의 경우 기록에서 참조 전사체를 선택하거나 기본 제공 인덱스를 사용합니까? 기록에서 하나를 선택합니다. 드롭다운 목록에서 업로드된 파일 마우스헤어핀스.fa를 입력합니다. FASTA/Q 파일에서 폴더 아이콘을 클릭하여 데이터 집합 컬렉션을 사용하고 컬렉션에트림이 포함된 파일을 선택합니다. 실행을클릭합니다. 실행은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>오른쪽의 히스토리 탭에서 19개의 아이템이 있는 목록인 컬렉션의 돛새치를 클릭합니다. 각 개별 파일을 클릭하고 디스크 아이콘을 클릭하여 로컬 컴퓨터에 저장합니다. 개별적으로 다운로드한 파일은 먼저 압축해제해야 합니다. 또한 스프레드시트로 가져오기 위해 .txt 확장으로 다시 저장해야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>각 스프레드시트 파일을 열고 NumReads 열의 이름을 치료 조건으로 다시 지정합니다. 열을 함께 병합하여 첫 번째 열에서 microRNAs 행렬을 생성하고 후속 열의 조건당 읽기 횟수를 계산합니다.</li>
	<li>각 치료 조건에 대해 차별화된 발현 된 microRNAs를 계산하려면 DESeq212와같은 프로그램에 대한 입력으로 raw microRNA 읽기 카운트가있는 파일을 사용합니다. DESeq2는 유전체학 분석 > RNA-seq > DESeq2 탭에서 은하계에 존재한다.</li>
	<li>원시 읽기를 정규화된 microRNA 읽기 개수로 변환합니다. 카운트는 다음 계산을 통해 라이브러리의 라이브러리 서열 깊이로 정규화됩니다: [(원시 읽기/총 microRNA 읽기) * (1,000,000 – 계산된 microRNAs 수) + 1]. 참고: 이 계산은 데이터 집합 및 생물학적 조건 간에 비교할 수 있는 백만(RPM) 매핑된 microRNAs당 정규화된 판독을 제공합니다. 출력은 탭으로 구분된 파일입니다. 돛새치는 tpm 출력 열을 제공하지만 이 값은 microRNA 헤어핀 길이로 정규화되지만 이 컨텍스트에서는 필요하지 않습니다.</li>
	<li>관련성이 있는 경우 사용자 지정 입력 시퀀스(예: 벡터)와 정렬을 반복하여 shRNAs와 같은 전달된 구문에 해당 맵을 읽는 것을 식별합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

20 년 전13년 전 microRNAs의 확인에도 불구하고, microRNA 시퀀싱의 과정은 힘든 남아 있고 전문 장비를 필요로, 일상적으로 사내 프로토콜을 채택에서 실험실을 방해14. 그밖 기술은 microRNA 마이크로어레이 및 다중화한 표현 패널 같이 microRNA를 동시에 평가할 수 있습니다; 그러나, 이러한 접근법은 그들의 프로브 세트에 존재하는 microRNAs만 정량화한다는 점에서 제한된다. 이 때문에, 그들은 새로운 microRNA의 식별과 같은 작은 RNA 시퀀싱의 중요한 특징을 놓치고, 마이크로 RNA 이소폼 -중요한 생물학적 기능을 가질 수있는 뉴클레오시드 변화 6,7,15 .
새 실험을 시작할 때 상용 공급...

1993년에 처음발견된 1, 현재 거의 2000개의 마이크로RNA가 인간 게놈2에존재하는 것으로 추정된다. MicroRNAs는 전형적으로 21-24 뉴클레오티드 긴 작은 비코딩 RNA입니다. 그(것)들은 단백질 발현을 억압하고 mRNA를 저하시키기 위하여 표적 유전자의 3-번역되지 않은 지역 (3-UTR)에 있는 상보적인 사이트에 수시로 결합하는 유전자 발현의 사후 전사 조절자입니다. 마이크로RNA를 정량화하면 유전자 발현에 대한 귀중한 통찰력을 제공할수 있으며 이 목적을 위해 여러 프로토콜이 개발되었습니다 3.
당사는 작은 RNA 시퀀싱을 위한 정의되고 재현 가능하며 오래 지속되는 프로토콜을 개발했으며, 오픈 소스 생물정보학 도구를 사용하여 정규화된 판독을 분석했습니다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 내인성 microRNAs와 외인성 으로 마이크로RNA 와 같은 종을 생성하는 생성물 모두를 동시에 식별할 수 있게 하는 동시에, 리보솜 RNA를 포함한 다른 작은 RNA 종에 대한 지도를 최소화하는 동시에 ( rRNA), RNA 유래 작은 RNA(tsRNAs), 반복 유래 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물을 전달한다. 다행히, microRNAs는 5-인산화 및 2-3 하이드록시레이트4,이러한 다른 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물로부터 이들을 분리하는 데 활용할 수 있는 특징이다. 종종 멀티플렉스에 더 빠르고 쉽게 마이크로RNA 복제 및 시퀀싱을 위한 몇몇 상업적인 선택권존재; 그러나 키트 시약의 독점적 특성과 빈번한 수정으로 인해 샘플 실행을 비교하기가 어렵습니다. 우리의 전략은 아크릴아미드와 아가로즈 젤 정제 단계를 통해 정확한 크기의 마이크로RNA만 수집을 최적화합니다. 이 프로토콜에서는 오픈 소스 도구를 사용하여 시퀀스 읽기를 microRNAs에 정렬하는 절차도 설명합니다. 이 지침 세트는 라이브러리 준비 방법또는 상용 방법이 사용되는지 여부에 관계없이 초보자 정보학 사용자에게 특히 유용합니다.
이 프로토콜은 여러 출판 된 연구에서 사용 되었습니다. 예를 들어, Dicer 효소가 줄기 루프 구조의 내부 루프로부터 2개의 뉴클레오티드의 거리에서 작은 헤어핀 RNA를 절단하는 메커니즘을 식별하기 위해사용되었다 - 소위 "루프 카운팅 규칙"5. 우리는 또한 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 (rAAv)에서 발현된 전달된 작은 머리핀 RNAs (shRNA)의 상대적인 풍부를 확인하기 위하여 이 방법을 따랐습니다, 간 이전에 용납될 수 있는 shRNA 발현의 임계값을 확인하기 위하여 과잉 shRNA 발현과 관련된 독성6. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 또한 microRNA-122의 부재에 반응하는 간에서 microRNA를 확인했습니다 - 고도로 발현된 간microRNA - 또한 이 microRNA 7의 분해 패턴을 특성화하는 동안. 우리는 수많은 실험에서 우리의 프로토콜을 일관되게 사용했기 때문에, 우리는 종로적으로 견본 준비를 관찰하고, 확인할 수 있는 배치 효력이 없다는 것을 볼 수 있었습니다.
이 프로토콜을 공유하는 우리의 목표는 사용자가 저렴한 장비 및 시약, 무료 생물 정보학 도구를 사용하여 거의 모든 조직 또는 세포주에서 microRNAs의 고품질, 재현 가능한 정량화를 생성 할 수 있도록하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>100 bp DNA ladder</td><td>NEB</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>19:1 비스-아크릴아미드</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>25 bp DNA 스텝 래더</td><td>Promega</td><td>G4511</td><td></td></tr><tr><td>산성 페놀/클로로포름</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드 RNA 로딩 염료</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>Biorad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 기기</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>RNA 품질 및 농도 평가용</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(100%)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>겔 로딩 버퍼 II</td><td>ThermoFisher</td><td>AM8547</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9516</td><td>파란색은 펠릿 HCl 시각화에 도움이 됨</td></tr><tr><td>시</td><td>그마</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>맥시 수직 젤 상자 20 x 20cm</td><td>Genesee</td><td>45-109</td><td></td></tr><tr><td>miRVana microRNA 분리 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>miSeq 시스템</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>작은 RNA 염기서열 분석 데이터</td></tr> <tr>생성용<td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Nusieve 저융점 아가로스</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>파라필름(실험실 밀봉 필름)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>폴리-에틸렌 글리콜 8000</td><td></td><td>NEB M0204</td><td></td></tr><tr><td>ProtoScript II에 포함됨 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트</td><td>NEB</td><td>E6560S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td>: <td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 형광측정기</td>, <td>ThermoFisher</td><td>Q33226</td>, <td>DNA 농도 정량화용</td></tr><tr><td>큐비트 RNA HS 어세이 키트</td>, <td>ThermoFisher</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>실리콘화 저잔량 1.5ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-331</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 1</td><td>NEB</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 2, 절단된 K227Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>RNA 품질 및 농도 평가용</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td></td><td>NEB M0273X</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Biorad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Tris 염기 pH 7.5</td><td>시그마</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Universal miRNA cloning linker</td><td>NEB</td><td>S1315S</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr></tbody></table>

micrornas를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

모든 인간 적인 전사체의 반은 microRNAs에 의해 통제되기 위하여 생각됩니다. 따라서 microRNA 발현을 정량화하면 질병 상태의 기본 메커니즘을 밝히고 치료 대상 및 바이오마커를 제공할 수 있습니다. 여기서는 마이크로RNA를 정확하게 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 간단히 말해서, 이 방법은 microRNAs를 분리하고, 고처리량 시퀀싱에 적합한 어댑터에 합착하고, 최종 제품을 증폭하고, 샘플 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이어서, 얻어진 시퀀싱 읽기를 마이크로RNA 헤어핀에 정렬하고, 정량화, 정규화 및 차등 발현을 계산하는 방법을 설명한다. 다재다능하고 견고한 이 결합된 실험 워크플로우와 생물정보학 분석을 통해 사용자는 조직 추출을 시작하고 microRNA 정량화로 마무리할 수 있습니다.

라이브러리 준비와 관련된 단계의 회로도 작은 RNA 추출, 시퀀싱 및 정렬의 전반적인 회로도는 그림2에 설명되어 있습니다. 1마리의 수컷 마우스와 1마리의 암컷 마우스로부터의 간 샘플을 수집하고 액체 질소로 냉동 스냅하였다. 총 RNA를 추출하고 품질 및 농도에 대해 평가하였다.
작은 RNA 시퀀싱은 시퀀싱을 위한 충분한 RNA를 산출합니다. 2개의 독립적인 RNA 추출으로부터 3 μg의 RNA를 작은 RNA 염기서열 분석의 시작 물질로서 사용하였습니다. 샘플을 아크릴아미드 겔상에서 실행하고 RNA의 17-28 nt에 해당하는 크기 마커사이를 잘라냈다(도 1A). 샘플을 RNA 단리...

여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

우리는 작은 RNA 시퀀싱및 오픈 소스 생물 정보학 도구를 사용하여 정규화 된 읽기를 분석하기위한 정의, 재현 가능, 오랜 프로토콜을 개발했습니다. 우리의 전략의 주요 장점은 젤 정화를 통해 microRNA를 정확하게 수집하고 생물 정보학 분석은 microRNA수집 방법에 관계없이 적용될 수 있다는 것입니다. microRNA의 높은 처리량 순서는 질병 기계장치에 대한 통찰력을 드러낼 수 있습니다, microRNA의 처리, 및 작은 RNA를 전달하는 유전자 치료 접근의 정확한 정량화.RNase 무료 환경에서 작업하고 절차 전반에 걸쳐 모든 RNA 제품을 얼음에 보관하십시오. 젤 절삭 단계를 시각화하면 시청자가 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 제품의 정확한 크기를 식별하는 데 도움이 됩니다. 3개의 프라임 어댑터 결찰의 경우, 11마이크로리터의 RNA와 ATP 무료 10X T4RNA 리구아제 반응 버퍼, 폴리에틸렌 글리콜1마이크로리터, 3개의 프라임 링커의 0.5 마이크로리터를 결합한다.시료를 온도 순환기에서 섭씨 95도에서 30~40초 동안 가열한 다음 1분간 얼음 위를 냉각합니다. T4RNA 리간슬 2의 마이크로리터 1개를 추가하고 실온에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 시료가 인큐베이팅되는 동안 플라스틱 주조에 0.8mm 분리 유리 판 사이에 15% 폴리아시릴마이드 젤을 붓고 빗을 삽입합니다.젤이 고화되면 탱크에 0.5 5X TBE를 넣고 파이펫을 적극적으로 추가하여 잔류 우레아의 우물을 씻으실 수 있습니다. 375볼트에서 25분 동안 폴리아크릴아미드 젤을 사전 실행한 후 샘플을 적재하여 각 샘플 사이에 적어도 하나의 레인을 남깁니다. 겔 방향을 추적하고 일정한 375 볼트에서 젤을 실행하기 위해 비대칭 패턴으로 적어도 두 세트의 마커 20 마이크로리터를 적재합니다.15 분 후, 실행의 나머지 부분에 대한 일정한 425 볼트로 증가하고 약 2 시간 동안 젤을 실행합니다. 실행의 끝에서, 유리 판에서 젤을 제거하고 플라스틱 페이지 보호자에 젤을 배치 플레이트 분리기를 사용합니다. 증류수 500마이크로리터에 에티듐 브로마이드 5마이크로리터를 희석하고 상단 라이트 블루 마커 바로 위에 있는 마커 레인에 염료를 추가합니다.다음으로, 깨끗한 면도날을 사용하여 자외선 아래 각 차선의 상부에서 아래 마커로 젤을 자르고 조각을 실험실 밀봉 필름의 4센티미터 사각형으로 옮춥니다. 약 3개의 컷으로 젤을 수평으로 자르고 2개의 컷을 수직으로 잘라 12개의 작은 사각형을 생산합니다. 밀봉 필름에 0.3 개의 어금니 나트륨 염화 나트륨 400 마이크로 리터를 추가하고 젤 조각을 1.5 밀리리터 실리콘 튜브로 안내합니다.하룻밤 사이에 4도에서 영양가에 샘플을 동요. 다음 날 아침, 각 상체의 400 마이크로리터를 새로운 튜브로 옮킨다. 1밀리리터 100%에탄올과 15밀리리터당 1밀리리터를 튜브당 글리코겐 공동 침전제를 넣으세요.그런 다음 튜브를 영하 80도에서 1시간 동안 보관합니다. 5개의 프라임 링커 결찰의 경우 먼저 해동된 샘플을 스핀다운하고 물 에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다음으로, 100 마이크로몰라 5개의 프라임 링커, T4RNA 리구아제 버퍼 1개, 10밀리몰러 ATP의 마이크로리터 1개, 각 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 1개의 마이크로리터를 0.5 마이크로리터를 추가합니다.반응을 섭씨 90도에서 30초 동안 가열한 후 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 각 튜브에 T4RNA 리갈아제 1마이크로리터를 추가하고 실온에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 역전사의 경우, 원심분리에 의해 샘플을 수집하고 뉴클레아제 자유물의 8.25 마이크로리터에서 공기 건조 펠릿을 재연한다.보완 DNA 합성 키트에서 100 마이크로몰라 역 전사 프라이머와 2X 역 전사 반응 믹스의 5 개의 마이크로 리터의 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 42도에서 3분 후, 각 샘플에 10X 역전사 효소 1.5마이크로리터를 넣고 온도순환기에서 섭씨 42도에서 30분 간 배양합니다. 중화 후, 29.5 마이크로리터의 물, 10X 타크 버퍼5개, 뉴클레오시드 삼위상염 1마이크로리터, 25마이크로몰러 포워드 프라이머 25마이크로리터, 25마이크로몰라 역프라이머 25마이크로리터, taq 폴리머및 10개의 미량리터를 사용하여 PCR 반응을 준비한다.그런 다음 두 개의 PCR 반응을 실행합니다. 아가로즈 젤 정제를 위해, 4%아가로즈 젤을 낮은 녹는 아가로즈로 준비하고 40 마이크로리터 이상을 적재하여 염색염과 100개의 베이스 페어 및 25개의 베이스 쌍 크기 마커를 젤에 적재한다. 젤을 실행한 후 125개의 베이스 페어 밴드 위에 밴드를 자르고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하십시오.적절한 장비를 사용하기 전에 실온에서 젤 밴드를 버퍼로 녹여 최종 시퀀스 라이브러리를 정량화합니다. 그런 다음 적절한 오픈소스 생물정보학 도구를 사용하여 서열 데이터를 분석합니다. 이러한 대표적인 PCR 반응에서 저융 아가로즈 젤에 대한 반응에서는, 얻어진 링커 링커 제품 및 포화 시료 대비 불포화에 비해 올바른 복제 제품의 획득을 관찰할 수 있다.인간 microRNA 헤어핀에 정렬 한 후, 각 복제에서 microRNA 판독 카운트 사이의 강한 일치를 관찰 할 수 있습니다. 총 306개의 마이크로RNA 종은 마이크로RNA 122에 매핑하는 가장 많은 수의 판독으로 검출되었다. microRNA의 정확한 복구를 가능하게 하기 위하여 적당한 크기로 젤을 잘라내는 것을 기억하는 것이 중요합니다.microRNAs를 시퀀싱한 후, 사용자는 생물정보학 분석을 적용하여 관심 있는 조직 내에서 microRNA의 분포를 특성화할 수 있습니다. 이 기술은 microRNA가 어떻게 처리되는지 그리고 특정 암에서 어떤 microRNA 세트가 변경되는지 를 확인하기 위하여 이용되었습니다. 에티듐 브로마이드를 다룰 때와 자외선 아래에서 젤을 볼 때주의하십시오.

a-complete-pipeline-for-isolating-sequencing-micrornas-analyzing-them

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

우리는 증폭 없이 생물학적 기질에서 분자를 바코딩하고 계수하여 유전자 발현을 정량화하는 multiplexed high-throughput 유전자 발현 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 과민성 대장 증후군이 있거나 없는 피험자의 전혈에서 microRNA(miRNA) 발현을 정량화했습니다.

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

여기 우리가 폐 식 평가 하는 방법을 설명 예측 하는 miRNAs의 염증 유전자를 조절 하기 위해 마우스를 사용 하 여 오존에 노출 또는 estrous 주기의 여러 단계에서 공기를 필터링.

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

업데이트된 식물 miRNA 기준과 철저한 알고리즘을 갖춘 생물정보학 파이프라인, 즉 miRDeep-P2(짧은 경우 miRDP2)는 식물의 microRNA 전사체, 특히 복잡하고 큰 게놈이 있는 종의 경우 정확하고 효율적으로 분석할 수 있습니다.

식물의 MicroRNA 전사체를 정확하고 효율적으로 분석하는 생물정보학 파이프라인

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

여기에서는 1) 알려진 miRNA와 새로운 miRNA를 보다 정확하게 식별할 수 있고 2) 완전히 자동화되어 자유롭게 사용할 수 있는 새롭고 완전히 자동화된 miRNA 파이프라인인 mirMachine을 제시합니다. 이제 사용자는 간단한 제출 스크립트를 실행하여 완전히 자동화된 mirMachine 파이프라인을 실행할 수 있습니다.

미르머신: 식물 miRNA 주석을 위한 원스톱 상점

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

단일 셀의 순서는 고해상도 게놈 변화를 해결하기위한 점점 인기 액세스 도구입니다. 우리는 하나의 셀에 복사 번호 변경을 식별하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 사용하는 프로토콜을 제공합니다.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

배우세요 소형 RNA 시퀀싱 및 오픈 소스 바이오인포매틱스 도구를 활용한 microRNA 분석 방법을. 겔 정제를 통해 microRNA를 정확히 수집하고 질병 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

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