Name: 종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 학습하세요 종양 세포와 대식 세포 간 상호 작용을 평가하는 시험관 내 분석법을. 이 방법은 개인 맞춤형 암 치료 개발에 필수적인 종양 미세환경 연구에 활용됩니다.

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교부금 지원: Z. An은 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단, 미국 뇌종양 협회, NIH T32CA108462 및 획기적인 생물 의학 연구 프로그램으로부터 지원을 받았으며, 이는 부분적으로 샌드러 재단에 의해 지원됩니다. W. 와이즈는 NIH 보조금 R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103에 의해 지원되었다; 새뮤얼 G. 왁스만 암 연구 재단; 그리고 에블린과 매티 앤더슨 의자.

1. 중간 준비
<ol><li>
무혈청 줄기세포 배지의 제조
	<ol>
<li>50x B27 보충제, 표피 성장 인자(EGF, 20 μg/mL에서 0.1% BSA) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF, 20 μg/mL 를 0.1% BSA로 10 mM 아세트산)를 해동하였다.</li>
		<li>EGF 500 μL(최종 농도 20 ng/mL), FGF 500 μL(최종 농도 20 ng/mL), 덜베코의 수정된 이글 미디엄/영양소 혼합물 F-12(DMEM/F12) 및 5 mL의 FGF(최종 농도 20 ng/mL), 50mL의 FGF(최종 농도 20 ng/mL), 10 mL을 추가합니다. 병을 4-6회 반납하고, 500 mL 0.1 μm 여과 컵을 통해 걸러내다. 병에 표시하고 4 °C에서 저장합니다. 참고: 배지는 4°C에서 최대 한 달 동안 사용하는 것이 좋다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MV-4-11 배양 배지 준비: 이스코브의 변형된 덜베코 배지(IMDM)의 500 mL에 태아 소 혈청(FBS) 50mL를 추가합니다. 병을 4-6회 반납하고, 500 mL 0.1 μm 여과 컵을 통해 걸러내다. 병에 표시하고 4 °C에서 저장합니다. 참고: 배지는 4°C에서 최대 한 달 동안 사용하는 것이 좋다.</li>
	<li>종양 세포 유지 매체를 준비: Dulbecco의 변형 된 독수리 매체 (DMEM)의 500 mL에 FBS의 50mL를 추가합니다. 병을 4-6회 반납하고, 500 mL 0.1 μm 여과 컵을 통해 걸러내다. 병에 표시하고 4 °C에서 저장합니다. 참고: 배지는 4°C에서 최대 한 달 동안 사용하는 것이 좋다.</li>
</ol>2. 세포 준비
1일차:
<ol><li>종양 세포를 해동</li>
	<li>종양 세포 유지 매체(단계 1.3에 기재된 바와 같이)를 37°C 수조에서 20분 동안 예열하였다.</li>
	<li>액체 질소 탱크에서 냉동 U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII 및 U87:EGFR+EGFRvIII 세포를 가져 가라. 37°C 수조에서 세포를 2분 동안 해동합니다. 주의: 액체 질소 탱크에서 세포를 복용할 때주의하십시오. 필요에 따라 열 보호 및 안전 고글이 달린 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>조직 배양 후드 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70% 에탄올을 닦아냅니다.</li>
	<li>세포와 중간 병에 70 % 에탄올을 함유 한 극저온 바이알을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70 % 에탄올을 닦아 조직 배양 후드로 가져 오십시오.</li>
	<li>피펫 5 mL 의 종양 세포 유지 보수 배지를 15 mL 멸균 원심분리튜브내로 하였다. 종양 세포를 함유하는 튜브를 4-6회 혼합하여 반전시. 모든 세포를 15 mL 원심분리기 튜브내로 피펫. 원심분리기 튜브를 4-6회 반전시 혼합한다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인.</li>
	<li>인산완식염(PBS)의 10 mL로 세포를 세척합니다. 4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인.</li>
	<li>종양 세포 유지 배지의 12 mL에서 세포를 재중단시다(단계 1.3에 기재된 바와 같이). 파이펫을 위아래로 3-5회 섞어 섞으세요. 세포를 T75 세포 배양 플라스크로 옮김으로 옮김을 전달한다.</li>
	<li>5% CO2로 37°C 인큐베이터에서세포를 성장시다. 종양 세포 유지 보수 배지를 다시 4°C 냉장고에 넣습니다.</li>
</ol>2일차:
<ol start="2"><li>현미경의 밑에 세포를 검사하십시오. 필요한 경우 미디어를 변경합니다. 세포는 배양에서 단층에서 성장해야 한다.</li>
</ol>3일차:
<ol start="3"><li>해동 MV-4-11 셀
	<ol>
<li>MV-4-11 배양 배지(단계 1.2에 기재된 바와 같이)를 37°C 수조에서 20분 동안 예열하였다. 참고: MV-4-11은 특정 연구의 필요성에 따라 1차 대식세포 또는 다른 대식세포 세포주로 변경될 수 있다.</li>
		<li>액체 질소 탱크에서 냉동 된 MV-4-11 세포를 가져 가라. 37°C 수조에서 세포를 2분 동안 해동합니다. 주의 사항: 액체 질소 탱크에서 세포를 복용 할 때주의하십시오. 필요에 따라 열 보호 및 안전 고글이 달린 장갑을 착용하십시오.</li>
		<li>조직 배양 후드 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70% 에탄올을 닦아냅니다.</li>
		<li>세포와 중간 병에 70 % 에탄올을 함유 한 극저온 바이알을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70 % 에탄올을 닦아 조직 배양 후드로 가져 오십시오.</li>
		<li>MV-4-11 배양 배지의 피펫 5 mL(단계 1.2에 기재된 바와 같이)을 15 mL 멸균 원심분리기 튜브내로 하였다. 종양 세포를 함유하는 튜브를 4-6회 혼합하여 반전시. 모든 세포를 15 mL 원심분리기 튜브내로 피펫. 원심분리기 튜브를 4-6회 반전시 혼합한다.</li>
		<li>4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인.</li>
		<li>PBS의 10 mL에서 세포를 세척하고 4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인.</li>
		<li>MV-4-11 배양 배지의 12 mL에서 세포를 재중단(단계 1.2에 기재된 바와 같이). 부드럽게 위아래로 3-5 회 피펫을 섞어 주세요. 세포를 T75 세포 배양 플라스크로 옮김으로 옮김을 전달한다.</li>
		<li>5% CO2로 37°C 인큐베이터에서세포를 성장시다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 세포 분할
	<ol>
<li>혈청이 없는 줄기 세포 배지(단계 1.1에 기재된 바와 같이)를 37°C 수조에서 20분 동안 데우다.</li>
		<li>조직 배양 후드 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70% 에탄올을 닦아냅니다. 냉장고에서 셀 분리 용액을 가져 가라. 배지 및 세포 분리 용액 병에 70 % 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70 % 에탄올을 닦아 조직 배양 후드로 가져 오십시오. 참고: accutase 세포 분리 용액을 미리 따뜻하게하지 마십시오.</li>
		<li>인큐베이터로부터 종양 세포 배양을 조직 배양 후드로 옮김을 전달한다. 배지를 흡인하고, 플라스크에 2 mL의 세포 분리 용액을 추가합니다. 참고: accutase를 추가하기 전에 PBS로 헹구는 것은 선택 사항입니다.</li>
		<li>후드에 플라스크를 설정합니다. 종양 세포가 매 분마다 반올림하는지 확인하십시오. 일단 종양 세포가 위로 반올림하면, 부드럽게 플라스크의 측을 두드려 세포가 플라스크에서 분리하는 것을 돕습니다.</li>
		<li>피펫 8 mL의 무혈청 줄기 세포 배지를 플라스크내로 넣고, 피펫을 3회 위아래로 혼합하고, 세포를 15 mL 멸균 원심분리기로 옮김을 전달한다. 4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인.</li>
		<li>PBS의 10 mL에서 세포를 세척합니다. 파이펫을 위아래로 3-5회 섞어 섞으세요. 4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인. 참고: 이 단계는 선택 사항입니다.</li>
		<li>혈청이 없는 줄기 세포 배지의 10 mL에서 세포를 다시 중단합니다(1.1단계에서 설명한 대로). 파이펫을 위아래로 3-5회 섞어 섞으세요. 세포의 10 μL을 가지고 10 μL의 Trypan Blue 용액과 혼합하십시오. 혼합물의 피펫 10 μL을 계수 슬라이드내로, 자동 셀 카운터를 사용하여 살아있는 셀 번호를 정량화한다.</li>
		<li>세포 밀도를 무혈청 줄기 세포 배지(단계 1.1에 기재됨)로 2.5 x 105 세포/mL로 조정하고, 세포의 종자 2 mL을 6웰 세포 배양 플레이트의 각각의 웰내로 조절한다. 세포의 각 유형에 대해, 시드 3 웰 (트리플 리케이트 샘플). 동시에 무혈청 줄기 세포 배지 (세포 없음)만 2 mL로 6 개의 우물을 준비하십시오. 참고: 이러한 샘플은 1) 음의 대조군으로 사용되고 2) 세포 수에 기초하여 조절된 중간 체적을 조정하기 위한 것이다.</li>
		<li>6웰 플레이트를 5% CO2로 37°C 인큐베이터에 넣는다. 세포가 24 시간 동안 자랄 수 있게 하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 체외 대식 세포 매력 분석
<ol><li>컨디셔닝된 매체의 준비
	<ol>
<li>종양 세포 유지 매체(단계 1.3에 기재된 바와 같이)를 37°C 수조에서 20분 동안 예열하였다.</li>
		<li>조직 배양 후드 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70% 에탄올을 닦아냅니다. 냉장고에서 셀 분리 용액을 가져 가라. 배지와 셀 분리 용액의 병에 70 % 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70 % 에탄올을 닦아 조직 배양 후드로 가져 오십시오.</li>
		<li>인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼냅니다. 15 mL 멸균 원심 분리튜브에 조건부 매체를 조심스럽게 피펫. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 별도의 15 mL 멸균 원심분리튜브에 "미디어 만"에서 미디어를 피펫. 참고: 이 단계 전에 현미경으로 확인하여 세포가 부착되는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 더 나은 부착을 허용하거나 계수 단계에서 부동 세포를 포함하기 위해 단계 2.4.8에서 코팅 된 플레이트를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>6웰 플레이트의 각 웰에 0.5 mL의 셀 분리 용액을 추가합니다. 종양 세포가 매 분마다 반올림하는지 확인하십시오. 종양 세포가 둥글게 되면 플레이트의 측면을 부드럽게 탭하여 세포가 분리될 수 있도록 합니다.</li>
		<li>피펫 2.5 mL의 종양 세포 유지 보수 배지를 웰 내로, 피펫을 3회 위아래로 하여 세포를 혼합및 15 mL 멸균 원심분리관으로 이송한다. 세포의 10 μL을 가지고 10 μL의 Trypan Blue 용액과 혼합하십시오. 혼합물의 피펫 10 μL을 계수 슬라이드내로 넣고 자동 세포 카운터를 사용하여 살아있는 세포의 수를 정량화한다.</li>
		<li>혈청 프리 줄기 세포 배지(하룻밤 동안 37°C 배양)를 사용하여 세포 수에 따라 조절된 배지의 부피를 조절한다. 예를 들어, Well A가 셀 수가 가장 적은 웰만큼 많은 라이브 셀이 3배인 경우 조건부 미디어 1:3을 희석합니다. 이 단계는 세포 증식 속도에 기인한 다름을 통제하기 위하여 이용됩니다. 참고: 혈청 프리 줄기 세포 배지를 밤새 37°C 배양하여 사용하는 이유는 37°C의 장기간 노출로 배지의 가능한 변화를 조절하기 위한 것입니다.</li>
		<li>0.45 μm 필터를 통해 컨디셔닝된 미디어를 필터링합니다. 컨디셔닝된 매체를 얼음 위에 놓습니다. 참고: 이 단계는 컨디셔닝된 매체에 있는 세포 및 세포 파편을 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MV-4-11 세포 의 제조
	<ol>
<li>IMDM 배지(FBS 제외)를 37°C 수조에서 20분 동안 데우습니다.</li>
		<li>조직 배양 후드 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70% 에탄올을 닦아냅니다. 중간 크기의 병에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면에 70% 에탄올을 닦아 내고 조직 배양 후드로 가져오십시오.</li>
		<li>MV-4-11 세포의 플라스크를 조직 배양 후드에 넣습니다. 15 mL 멸균 원심분리튜브내의 피펫 10 mL 세포. 10 μL의 세포를 가지고 10 μL의 Trypan Blue 용액과 혼합하십시오. 혼합물의 피펫 10 μL을 계수 슬라이드내로 넣고 자동 세포 카운터를 사용하여 살아있는 세포의 수를 정량화한다. 4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인.</li>
		<li>10 mL의 PBS로 세포를 세척하고 4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상급자 흡인.</li>
		<li>1x106 셀/mL의 최종 셀 밀도에 대해 IMDM 배지(FBS 제외)에서 셀을 다시 일시 중단합니다. 참고: 여기서 사용되는 대식세포의 세포 수를 조정할 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>트랜스웰 분석 참고: 이 단계에서는 세포 이동 분석 키트를 사용하거나 시약을 구입하고 별도로 삽입하십시오. MV-4-11 셀의 경우 5 μm 크기의 트랜스웰 인서트를 선택합니다. 대식세포 이동을 감지하려면 하부 챔버의 대식세포 수를 직접 정량화하거나 색도/형광 방법을 사용합니다. 여기서, 우리는 대색 방법을 사용하여 분석법을 시연한다.<ol>
<li>24웰 플레이트, 인서트와 시약을 실온으로 가져옵니다.</li>
		<li>위에 준비된 MV-4-11 셀 250 μL을 각 인서트가 넣습니다.</li>
		<li>400 μL의 컨디셔닝 된 배지 / 매체만 추가하십시오 (37 °C에서 하룻밤 배양시, 이 샘플은 음의 대조군역할을합니다) 24 웰 플레이트의 하부 챔버에. 각 종양 라인 또는 대조군을 위해, 삼중 샘플을 사용하십시오. 인서트와 조건부 매포 사이에 기포가 발생하지 않도록 하십시오. 거품은 대식세포가 바닥 우물로 이동하는 것을 억제합니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C 인큐베이터에서 5% CO2로 4시간 동안 배양합니다. 참고: 배양 시간을 조정할 수 있습니다. 더 낮은 약실로 이동하는 세포는 현미경의 밑에 보일 수 있습니다.</li>
		<li>같은 우물의 내벽에 있는 인서트를 가볍게 두드리고 인서트를 폐기합니다. MV-4-11 세포가 현탁액에서 성장함에 따라, 세포 분리 용액 또는 트립신 치료가 여기에 필요하지 않습니다.</li>
		<li>우물의 세포를 부드럽게 피펫하여 3번 위아래로 섞어 주세요. 형광 측정에 적합한 검은 벽 96 웰 플레이트에 225 μL의 셀 현탁액을 전달합니다.</li>
		<li>CyQuant 염료를 4배 의 리시스 버퍼로 1:75로 희석합니다. 소용돌이를 짧게 하고 용액을 스핀다운합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 75 μL의 용액을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>형광 플레이트 리더가 있는 480/520 nm 필터 세트를 사용하여 형광을 판독합니다.</li>
		<li>빈 칸을 빼고 대조군 종양 세포주로 정상화하여 데이터를 분석한다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+function+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and function of tumor-associated macrophages.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Riabov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+associated+macrophages+in+tumor+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Frontiers in Physiology. 5, (2014).</li>
<li>Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+tumor-promoting+chronic+inflammation%3A+a+magic+bullet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet.</a> Science. 339 (6117), 286-291 (2013).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+IL6+and+PD-1%2FPD-L1+Signaling+Abrogates+Mutual+Regulation+of+Their+Immunosuppressive+Effects+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).</li>
<li>Borgoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+tumor-associated+macrophages+switches+the+epigenetic+profile+of+pancreatic+cancer+infiltrating+T+cells+and+restores+their+anti-tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype.</a> Oncoimmunology. 7 (2), e1393596(2018).</li>
<li>Argyle, D., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophage-Recruiting+Chemokines+as+a+Novel+Therapeutic+Strategy+to+Prevent+the+Progression+of+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2629(2018).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+cooperates+with+EGFRvIII+to+recruit+macrophages+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma.</a> Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Fan, Q. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+phosphorylates+tumor-derived+EGFRvIII+driving+STAT3%2F5+and+progression+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma.</a> Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).</li>
<li>Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Chemokines+and+Chemokine+Receptors+in+Melanoma+and+Other+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2480(2018).</li>
<li>Arimont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+of+Chemokine+Receptor-Ligand+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).</li>
<li>Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+chemokines%3A+At+the+crossroads+of+cell+signalling+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).</li>
<li>Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in innate immunity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).</li>
<li>Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tumor-Associated+Macrophages+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer.</a> Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).</li>
</ol>

윌리엄 A. 와이즈는 StemSynergy 치료제의 공동 설립자입니다. 제니 안은 공개할 것이 없다.

이 프로토콜에는 1) Transwell 삽입물의 선택이라는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. MV-4-11 세포주, 5 μm 트랜스웰 인서트가 잘 작동합니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 단핵구 세포주 THP-1과 같은 다른 세포주, 다른 기공 크기는 더 잘 작동 할 수 있습니다. 2) 다른 세포주가 다른 속도로 증가함에 따라, 세포 수에 따라 조절 된 매체의 부피를 조정하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 동일한 실험 조건 하에서 배양된 무세포 방진 매체는 컨디셔닝된 매체를 희석하는데 사용될 수 있다. 3) FBS는 사이토 카인을 포함합니다. 상부 챔버에서 MV-4-11 세포를 시드하기 위해 무혈청 배지를 사용하는 것이 중요합니다. 여기서 FBS를 사용하는 경우 셀 마이그레이션을 관찰할 수 없는 경우도 있습니다.
연구원은 다른 응용 프로그램에 대 한이 분석 이 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 종양 세포는, 일차적인 환자 유래 이종이식 배양, 또는 마우스 세포가 전술한 예에서...

대식세포는 높은 자형질 및 기능적 이질성을가진 면역 세포1. 그들은 숙주 방어 시스템, 조직 수리, 발달및 종양 진행에 중요한 역할을 한다 1. TAM은 고형 종양의 미세 환경의 대식세포입니다. 특정 T는 T 세포 매개 세포 독성 활성을 억제하고, 종양 미세 환경(TME)을 조절하고, 혈관신생, 침입 및 전이 를 촉진하여 종양 성장을 촉진할 수있습니다2,3,4, 5.TAM은 TME에서 가장 풍부한 세포 유형 중 하나이며 더 많은 수의 TAM은 일반적으로 많은유형의 고형 종양에서 환자 생존과 상관 관계가 6. 종양 세포의 명백한 유전 서명은 대식세포를 모집하는 그들의 기능에 영향을 미칩니다. GBM에서, 아무 치료도 없는 공격적인 뇌종양, 대식세포는 종양질량 7의 반까지 나타낼 수 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)와그의 절단 돌연변이체 EGFRvIII의 공동 증폭은 종양 성장 이점을 부여하는 GBM에서 빈번히 관찰되며, 이는8. EGFR 및 EGFRvIII를 공동 발현하는 세포는 EGFR 또는 EGFRvIII를 발현하는 세포에 비해 더 많은 대식세포를 유치한다 7.
케모카인은 TME6,9에서면역 조성을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 작은 사이토카인의 가족이다. 인간 세포는 50개 이상의 사이토카인10개이상을 발현한다. 종양에서의 면역 침윤은 주로 사이토카인과 사이토카인수용체(11)사이의 상호작용에 의해 실현된다. 면역 세포의 각 유형은 뚜렷한 케모카인 수용체/케모카인을 발현하고 특정 케모카인/케모카인 수용체12를분비하는 세포에 의해 모집될 수 있다. 암세포는 TAM, 조절 T 세포 및 골수성 유래 억제세포(MDSCs)와 같은 면역 세포를 모집하기 위해 특정 케모카인의 발현을 증가시킬 수있다6. 종양에 의해 분비되는 특정 케모카인의 봉쇄는 종양 덩어리로 면역 세포의 침투를 억제하는 유망한 방법이 될 수 있다.
여기서, 우리는 화학피닌 및 대식세포 세포주를 포함하는 종양 세포로부터의 컨디셔닝된 매체를 사용하여 종양-대식세포 상호작용의 시험관내 평가를 허용하는 프로토콜을 기술한다.

<table><tbody><tr><td>0.1 &뮤; m 여과 컵</td><td>써모 피셔</td><td>566-0010</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 필터 장치</td>, <td>Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>10mL 혈청학 피펫,</td><td>Olympus 플라스틱</td>, <td>12-104</td><td></td></tr>, <tr><td>15mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>, Olympus 플라스틱</td><td>, 28-103</td><td></td></tr>, <tr><td>1mL 피펫 팁</td><td>, ART molecular bioproducts</td><td>2779-RI</td><td></td></tr>, <tr><td>2mL 흡인 피펫</td>, <td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td>, <td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>ECM507의 일부, 또는 별도로 구매할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>4x 용해 버퍼</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>ECM507의 일부, 또는 별도로 구매할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 5 &mu; m Transwell insert</td><td>Millipore</td><td>ECM507 ECM507</td><td>의 일부, 또는 별도로 구매 가능</td></tr><tr><td>75 cm2 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant Dye</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>ECM507의 일부 또는 별도로 구매 가능</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>펜 스트렙</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>Biorad</td><td>1450021</td><td></td></tr></tbody></table>

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 관련 대식세포 (TAM)는 암의 다른 모형을 위한 종양 질량에 있는 세포의 큰 비율을 차지합니다. 아교 모세포종 (GBM), 치료법이없는 악성 뇌종양은 종양 질량 의 절반까지 있습니다. TAM은 세포에서 특정 유전자의 활성화에 따라 종양 또는 항종양일 수 있다. 종양에 있는 유전 돌연변이는, 핑거레이토카인 발현을 통제해서, 종양 미세 환경에 TAM의 모집에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서, 우리는 종양 세포로부터의 조절된 배지에 의한 대식세포 모집을 평가하기 위한 정량적 세포 기반 분석방법을 기술한다. 이 분석은 인간 대식세포주 MV-4-11을 사용하여 교모세포종으로부터 조절된 배지에 의한 대식세포 인매력을 연구하여 높은 재현성과 낮은 가변성을 허용합니다. 이 분석으로 생성된 데이터는 종양과 종양 미세 환경 사이의 상호 작용에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있다. 유사한 분석은 종양 세포와 T 세포 및 자연 살인자 (NK) 세포를 포함하여 그밖 면역 세포 사이 상호 작용을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.

결과는 일반적으로 막대 그래프를 통해 표시됩니다(그림 1에도시된 예). 값이 480/520이 높은 샘플은 컨디셔닝된 미디어가 대식세포를 모집할 수 있는 능력이 높다는 것을 나타냅니다. 실험적 필요에 따라 추가 컨트롤을 포함할 수 있습니다. 예를 들어, 중화 항체를 사용하여 대식세포 화학요법을 폐지하고, 동일한 분석법을 수행하기 위해 조절된 매체를 치료할 수 있다. 하나는 또한 추가 케모카인 (즉, CCL2)을 컨디셔닝 된 미디어에 추가 할 수 있으며, 이는 긍정적 인 대조군역할을합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59907/59907fig1.jpg"> 도 1: EGFR 및 EGFRvIII를 공동 발현하는 U87 세...

본 문서는 대식세포를 유치하기 위해 종양 세포로부터 조절된 배지의 능력을 평가하는 유용한 시험관내 분석방법을 나타낸다.

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

종양 관련 대식세포는 종양 미세 환경에서 중요한 역할을 합니다. 종양 세포에 있는 다른 유전 돌연변이가 대식세포 모집에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것은 암 환자를 위한 개인화한 처리를 디자인하기 위한 중요합니다. 이 분석법은 시험관 내 종양 세포와 대식세포 사이의 상호 작용을 평가하는 쉽고 강력한 방법을 제공합니다.이 분석체는 종양 세포와 체외내의 다른 면역 세포 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 수정될 수 있다. 이 절차를 시작하려면 20 분 동안 섭씨 37도에서 수조에 배치하여 혈청없는 줄기 세포 매체를 따뜻하게하십시오. 70%에탄올로 조직 배양 후드 표면을 살포하고 종이 타월로 분무된 표면을 닦아냅니다.다음으로 중간 및 세포 분리 용액 병을 70%에탄올로 분사하고 종이 타월로 닦아냅니다. 청소된 병을 조직 배양 후드로 옮킨다. 종양 세포를 검색하고 조직 배양 후드로 옮춘다.매체를 흡인하고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 씻으세요. 그런 다음 플라스크에 세포 분리 용액 의 2 밀리리터를 추가합니다. 두건을 아래로 플라스크를 설정하고 종양 세포가 반올림되었는지 확인하기 위해 매 분마다 확인합니다.일단 종양 세포가 둥글게 되면, 부드럽게 세포가 분리하는 것을 돕기 위하여 플라스크의 쪽을 누릅니다. 그 후, 혈청이 없는 셀 배지의 파이펫 8밀리리터를 플라스크로 들어가고 파이펫을 세 번 위아래로 섞어 섞는다. 이 셀 서스펜션을 15밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기로 200배, 섭씨 4도에서 5분간 전달합니다.상체를 흡인합니다. 그런 다음 PBS의 10 밀리리터에서 세포를 씻어 서 3 ~ 5 번 파이펫을 섞습니다. 원심 분리는 200 배 g와 5 분 동안 섭씨 4도에서 세포를 원심 분리합니다.수퍼내티퍼를 흡인시키고 혈청이 없는 배지의 10밀리리터에서 세포를 재분리한다. 파이펫을 3~5회 위아래로 섞어 섞습니다. 이 셀 서스펜션의 마이크로리터 10을 Trypan Blue 용액의 10 마이크로리터와 혼합합니다.다음 파이펫 10 트리판 블루와 셀 혼합물의 마이크로 리터 는 카운트 슬라이드로, 살아있는 세포 수를 정량화하기 위해 자동 셀 카운터를 사용합니다. 혈청이 없는 세포 배지를 사용하여 밀리리터당 5번째 세포로 세포 밀도를 2.5배 10배로 조절한다. 그런 다음 세포의 2 밀리리터를 6웰 배양 판의 각 우물로 시드합니다.동시에 세럼이 없는 줄기 세포 배지의 2밀리리터만으로 6개의 우물을 준비합니다. 그 후 6웰 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 먼저 70 %에탄올로 조직 배양 후드 표면을 분사하고 종이 타월로 분무 된 표면을 닦아냅니다.다음으로 중간 및 세포 분리 용액 병을 70%에탄올로 분사하고 종이 타월로 닦아냅니다. 청소된 병을 조직 배양 후드로 옮킨다. 이 후 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 검색합니다.조건부 미디어를 15밀리리터 멸균 원심분리기 튜브에 조심스럽게 피펫하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포 분리 용액0.5 밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 종양 세포가 반올림한 경우 매 분마다 확인합니다. 일단 종양 세포가 둥글게 되면, 부드럽게 세포를 분리하는 것을 돕기 위하여 접시의 쪽을 누릅니다.종양 세포 유지 보수 배지의 다음 파이펫 2.5 밀리리터는 혼합하기 위해 세 번 위아래로 파이펫으로 한다. 세포를 15 밀리리터 멸균 원심분리기 튜브로 옮기다. Trypan Blue 용액의 10 마이크로리터와 세포의 10 마이크로리터를 혼합하고 이 혼합물의 10 마이크로리터를 카운팅 슬라이드로 옮킨다.자동 세포 카운터를 사용하여 살아있는 세포의 수를 정량화하고, 세포 수에 따라 조건부 된 매체의 부피를 조정하기 위해 하룻밤 사이에 37섭씨에서 배양된 혈청 없는 줄기 세포 배지를 사용합니다. 0.45 마이크로미터 필터를 통해 조건부 미디어를 필터링하고 조건부 미디어를 얼음 위에 놓습니다. 먼저 IMDM 배지를 섭씨 37도에서 20분간 따뜻하게 해보시다.70%에탄올로 조직 배양 후드를 청소하고 배지병을 청소하고 이전에 설명한 대로 후드로 운반한다. 다음으로 MV-4-11 세포의 플라스크를 후드로 옮킨다. 파이펫 10 밀리리터 의 세포는 15 밀리리터 원심분리기 튜브로.Trypan Blue와 자동 셀 카운터를 사용하여 이전에 설명한 대로 살아있는 세포의 수를 정량화합니다. 그런 다음 세포를 200 배 g에서 5 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리합니다. 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 씻으세요.원심분리기는 다시 200배, 섭씨 4도에서 5분간 다시 원심분리기를 사용한다. 수퍼나탄을 흡인하고, 밀리리터당 100만 개의 세포의 최종 세포 밀도에서 IMDM 배지에서 세포를 재분리한다. 먼저 필요한 재료를 실온으로 가져옵니다.각 삽입에 준비된 MV-4-11 셀의 250 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 24웰 플레이트의 하부 챔버에만 조건부 배지 또는 배지의 400 마이크로리터를 추가하여 트리플리케이트에 샘플을 추가합니다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다.그런 다음 동일한 내부 벽에 삽입을 부드럽게 탭하고 삽입을 폐기합니다. 부드럽게 혼합 하는 우물에 세포를 피펫 세 번. 이 세포 현탁액의 225 마이크로리터를 형광 측정에 적합한 검은 벽 96웰 플레이트의 우물로 옮기.그 후 CyQUANT 염료를 4배 리시스 버퍼로 1~75의 비율로 희석합니다. 소용돌이를 짧게 하고 용액을 회전시다. 이 용액의 75 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 실온에서 15분 동안 배양합니다.형광판 판독기를 사용하여 형광을 읽고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다. 이 연구에서는, 체외 분석은 종양 대식세포 상호 작용을 연구하기 위하여 이용됩니다. 형광 값이 높은 샘플은 조건부 미디어가 대식세포를 모집할 수 있는 높은 용량을 가지고 있음을 나타냅니다.실험적 필요에 따라 추가 컨트롤을 포함할 수 있습니다. 예를 들어, 중화 항체를 사용하여 조건부 된 매체를 치료하여 대식세포 화학요법을 폐지하고 동일한 방식으로 수행 할 수 있습니다. 또한 조건부 미디어에 추가 케모키네를 추가할 수 있으며 이는 긍정적인 제어 역할을 합니다.다른 세포 모형이 다른 속도로 증가할 수 있기 때문에 이 분석에 대한 세포 수 차이를 통제하는 것이 중요합니다. 생체 내 결과의 생체 내 확인은 매우 중요합니다. 하나는 마우스로 종양 세포를 주입하고 결과를 확인하기 위해 유동 세포, 면역 염색 및 CyTOF를 사용하여 종양을 분석 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 형광 기반 트랜스웰 대식세포 상호작용 분석을 사용하여 종양-대식세포 상호작용을 연구합니다. 이 분석에는 화학적 유도 화학주성을 통한 대식세포의 이동 분석이 포함됩니다.

형광 기반 트랜스웰 대식세포 유인 분석법: 화학적 유도 화학주성을 통한 종양-대식세포 상호작용을 연구하기 위한 체외 방법

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여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.

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분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

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