만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE^{확실히)을}연구합니다.

TEdeff 암이 면역 요법에 대한 중요한 장애물이라는 점을 감안할 때, 우리의 약리학 모델은 그러한 암에서 관찰된 광범위한 전사 및 후성 유전학 적 결함을 적절하게 모방하고 새로운 통찰력을 얻고, 기존 약물에 대한 새로운 용도를 찾거나, 그러한 암에 대한 새로운 전략을 찾을 수 있기 때문에 유리한 도구입니다. 이것은 암에 있는 전사 신장 결함을 연구하기 쉬운 확립하기 쉬운 및 일반화할 수 있는 모형입니다, 시험관 내와 생체 내 둘 다 종양 면역 상호 작용을 공부하는 것을 가능하게 합니다. 이 방법은 또한 인간 암종 선에 적용될 수 있습니다.

우리는 짧은 기간 동안 T47D 및 CAL51에 이것을 시험하여 유사한 TEdeff와 유사한 특성을 초래했습니다. 여기서 설명하는 프로토콜은 만성 CDK9 억제에 의한 TEdeff와 같은 기능 생성에 중요한 알려진 변수를 최소화하는 기본 프레임워크를 제공합니다. 그러나, 다른 뮤린 라인에 대 한 flavopiridol의 정확한 sub치명적인 복용량을 최적화 하기 위해 주의 해야 합니다.

세포 도금 밀도, 배양 조건, 사이토카인 자극 조건의 변이의 영향은 다른 세포 뮤린 라인에 따라 다를 수 있다. 올리고 dT 자기 구슬을 사용하여 이전에 리보소말 RNA 고갈된 시료의 절반으로부터 폴리아 양성 RNA를 추출하는 것으로 시작한다. 30초 동안 소용돌이를 통해 바이알의 구슬을 다시 중단하고 구슬 200마이크로리터를 튜브로 옮킨다.

바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 내용을 혼합합니다. 튜브를 자석에 1분간 놓고 상체를 폐기합니다. 그런 다음, 자석에서 튜브를 제거하고, 결합 버퍼의 100 마이크로 리터에서 세척 된 구슬을 다시 중단합니다.

리보소말 RNA 고갈된 시료의 부피를 pH 7.5에서 10밀리머 트리-HCl으로 100 마이크로리터로 조정한다. 샘플에 바인딩 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 혼합물을 2분간 섭씨 65도로 가열하여 이차 RNA 구조를 방해한 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.

총 RNA 200마이크로리터를 세척된 구슬 100마이크로리터에 넣고 로터에 5분간 철저히 섞습니다. 튜브를 1~2분 동안 자석에 놓고 모든 상체를 조심스럽게 제거한 다음 자석에서 튜브를 제거하고 200 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 위아래로 몇 번 파이프를 사용하여 샘플을 혼합, 1 분 동안 자석에 튜브를 반환하고, 상체를 제거합니다.

이어서, 분광계를 사용하여 분리된 비드 바운드 mRNA의 순도와 농도를 측정한다. 리보소말 RNA 고갈된 시료의 나머지 절반을 단백질 A 컬럼에 입력하여 단일 클론 7-메틸구아노신 항체를 사용하여 5-프라임 캡된 RNA를 입력합니다. 제조자의 프로토콜에 따라 RIP 키트로부터 마그네틱 비드를 세척하여 항체를 구슬에 사전 결합하고, 7-메틸구아노신 항체의 비드에 키트로부터 세척 버퍼 100 마이크로리터에 매달린 비드에 세척한다.

낮은 속도로 회전하면서 실온에서 30 분 동안 혼합물을 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 간략하게 원심분리하고 자기 분리기에 놓습니다. 상체를 제거하고 폐기한 다음 튜브를 자기 분리기에서 꺼내 500 마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 다시 분리합니다.

튜브를 소용돌이치고 원심분리기를 짧게 배치하고 자기 분리기에 다시 배치하고 다시 상체를 폐기합니다. 그런 다음, RNase 억제제의 1마이크로리터와 함께 항체 바인딩 구슬에 리보소말 RNA 고갈 RNA 120 나노그램을 추가하고, 가벼운 동요로 60 내지 90분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 인큐베이션 후, 샘플을 10초 동안 300배 g로 회전시키고, 미완성 mRNA로 상체를 새로운 미세원심분리기로 옮긴다.

세척 버퍼 100 마이크로 리터로 세척을 두 번 더 반복하고 수집 된 상체를 풀링합니다. 원고 방향에 따라 제조된 300마이크로리터의 우레아 용해 버퍼를 추가하고 혼합물을 섭씨 65도에서 2~3분 동안 가열하여 구슬에서 캡된 mRNA를 엘테. 페놀 300 마이크로리터와 300 마이크로리터를 결합: 클로로폼:이소아밀 알코올, 혼합 반전, 10분 간 그대로 둡니다.

샘플을 다시 부드럽게 섞고 원심분리기를 2분간 섞습니다. 상단 레이어를 신선한 튜브로 조심스럽게 피펫하고 아래쪽 레이어를 폐기합니다. 2-프로판올 300 마이크로리터와 3개의 어금니 나트륨 아세테이트 30마이크로리터를 시료에 넣고 몇 번 반전하고 20시간 동안 영하 20도에 넣습니다.

인큐베이션 후, 원심분리는 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 버리고 실온에서 펠릿을 5 분간 건조시다. 핵이 없는 물에서 펠릿을 재중단하고 분광계로 RNA의 순도와 농도를 측정한다.

원고 방향에 따라 CD8 양성 세포를 분리한 다음 시판되는 자기 분리 시스템 버퍼에서 세포를 다시 분리합니다. 세포의 모든 1 밀리리터에 대한 항체 칵테일 100 마이크로리터를 추가하고 15 분 동안 얼음에 세포를 배양합니다. 그런 다음 항체 칵테일 100 마이크로리터당 100 마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가하고 세포를 얼음 위에 15분 더 둡니다.

인큐베이션 후, 7밀리리터의 자기 분리 버퍼를 세포에 추가하고, 신선한 튜브에 3~4밀리리터를 알리쿼트하고, 튜브를 5분 동안 자기위에 놓습니다. CD8 양성 세포로 액체를 얼음의 신선한 튜브로 데산합니다. 그런 다음 나머지 3~4밀리리터의 세포를 자기 구슬에 넣고 5분 동안 자석에 튜브를 놓습니다.

첫 번째 배치를 사용하여 CD8 양성 세포의 두 번째 배치를 튜브에 데산합니다. 종자 설계 섬유아세포 SAMBOK 세포는 24웰 플레이트에서 75, 000 세포당 동자극 분자와 함께, 37도 섭씨, 5%의 이산화탄소 가습인 인큐베이터로 배양한다. 24시간 후, 이스코브의 수정된 덜벡코 배지로 APC 단층층을 한 번 세척하고, 원고 의 지시에 따라 보충된 2밀리리터의 6개의 순진한 세포에 0.5배 10배를 첨가한다.

세포를 20시간 동안 배양한 다음, 배지를 수집하고 2분 동안 191회 g로 세포를 펠릿하여 비부착 OT-I 세포를 부드럽게 수확한다. 세포를 계산하고 B16/F10, 처리되지 않은 B16/F10-OVA 및 플라보피레돌로 전처리된 B16/F10-OVA 세포와 함께 공동 배양에서 일대일 비율로 종자합니다. 37도 섭씨, 5%의 이산화탄소 가습인 인큐베이터에서 20시간 동안 세포를 배양한 다음 OT-I CD8 양성 세포를 제거하고 PBS에서 부착물 B16/F10-OVA 세포를 세척합니다.

트립신으로 05%EDTA에 부착된 세포의 3개의 단을 5분 동안 트립신으로 한 다음 5분 동안 191회 g로 펠릿을 넣습니다. 생존 성 염료 및 관련 표지 된 항체와 감기 PBS에서 수확 된 B16 /F10-OVA 세포를 배양 한 다음 유동 세포 측정으로 생존 가능성을 분석합니다. 이 프로토콜은 RNA 폴리머라제 II의 C 단말 반복 도메인에 세린 2 위치에서 인산화의 심오한 손실을 보여주고 H3K36me3의 현저한 감소를 보여주는 전사 신장 결함 세포 모델을 확립하는 데 사용되어 왔으며, 이는 엑슨 경계를 정의하고 엉뚱한 전사를 억제하는 데 연루되어 있다.

세포는 부적절하게 덮인 및 비 polyadenylated mRNAs의 증가 비율로 중요한 mRNA 처리 결함을 보여줍니다. 더욱이, 주요 염증 반응 경로 유전자 및 FasL 매개 세포 죽음의 특정 억압은 이 세포 모형에서 관찰됩니다. 세포 모델이 세포 독성 T 세포 공격에 저항을 부여하는 경우 테스트하는 탐색 분석은 만성 플라보피레돌 유발 전사 신장 결함항종양 면역 공격에서 탈출수단을 부여할 수 있음을 보여준다.

FLAvopiridol 처리B16/F10 세포는 OVA 유전자를 안정적으로 과발현시키는 것은 OVA 발현 세포를 향한 선택적 독성이 있는 CD8 양성 세포독성 T 세포에 영향을 받기 쉽지 않았다. 플라보피레로 전조되지 않은 세포는 주요 세포 사망을 겪었으며, OVA 항원항을 표현하지 않는 부모 B16/F10은 살아남았습니다. 25나노몰러 플라보피라이트 치료에 인포세린 2및 H3K36 트리메틸화 수준의 감소가 phopsho-STAT1 및 인-NF-kappaB 레벨의 감소를 보장하지 않는다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

각 마우스 암종 라인은 고유하며, JAK1 및 CCNT1은 플라보피레돌의 효과를 구출할 수 있다. 추가적으로, 이 모형은 선천적이고 적응성 항종양 면역 반응에 대하여 TEdeff 암에 의해 제안된 저항을 감시하기 위하여 생체 내에서 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 항아시아로 치료는 NK 세포의 활성을 조절하는 데 사용될 수 있고, 면역 체크포인트 요법은 TEdeff 종양 베어링 마우스에게 투여될 수 있었다.

종양 에 침투하는 림프구 또는 TIL, 부하는 면역 요법에서 성공의 지표입니다. 우리의 모델은 면역 요법 전후에 TEdeff 암 미세 환경에서 TiL의 활성화 및 피로의 정도를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.