Name: 만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE확실히)을연구합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 학습하세요 만성 CDK9 억제를 이용한 뮤린 암 세포주 기반 전사 신장 결점 모델을 통해 비유전적 전사 이상과 종양-면역 상호작용을 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 면역치료 저항성 암에 대한 새로운 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 부분적으로 NCI (CA193549)와 카카얀 코무로프에 CCHMC 연구 혁신 파일럿 상, 국방부 (BC150484) 해군 싱에 대한 상을 지원했다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국방부의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.

<ol><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).</li>
<li>Margaritis, T., Holstege, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poised+RNA+polymerase+II+gives+pause+for+thought%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poised RNA polymerase II gives pause for thought.</a> Cell. 133 (4), 581-584 (2008).</li>
<li>Modur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+transcription+elongation+in+a+subset+of+cancers+confers+immunotherapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance.</a> Nature Communications. 9 (1), 4410(2018).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-145 (2009).</li>
<li>Adelman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+mediators+of+the+inflammatory+response+are+poised+for+gene+activation+through+RNA+polymerase+II+stalling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).</li>
<li>van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+CTLs+Require+a+Single+Brief+Period+of+Antigenic+Stimulation+for+Clonal+Expansion+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li>
<li>Gilchrist, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+regulators%3A+the+pervasive+effects+of+Pol+II+pausing+on+stimulus-responsive+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks.</a> Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).</li>
<li>Danko, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+differentially+affect+RNA+polymerase+II+initiation%2C+pausing%2C+and+elongation+rate+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells.</a> Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).</li>
<li>Nechaev, S., Adelman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol+II+waiting+in+the+starting+gates%3A+Regulating+the+transition+from+transcription+initiation+into+productive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+modifies+the+activity+of+CDK9+to+phosphorylate+serine+5+of+the+RNA+polymerase+II+carboxyl-terminal+domain+during+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).</li>
<li>Palancade, B., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+RNA+polymerase+II+carboxyl%E2%80%90terminal+domain+%28CTD%29+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

RNA Pol II 신장 조절은 악성 세포의 이점에 대한 자극 반응유전자 발현을 조절하기 위한 결정적인 지렛대로 대두되고있다 5,7,8. 발기인-근위성 일시 중단을 극복하여 연신장 및 후속 mRNA 생산을 위해서는 P-TEFb9,10,11의키나아제 활성이 요구됩니다. 우리의 모델은 필수 사이클린 의존키나제 CDK9의 억제제인 플라보피리돌(25 nM)을 사용하여TE에서 Pol II 신장 기간 동안 관찰된 결함을 모방합니다. 이전3.
CDK9 키나아제 활성은 오랫동안 Pol II의 대형 소단...

거의 모든 활성 유전자의 발현에서 중요한 속도 제한 단계는 프로모터 근위식 일시에서 생산적인 신장1,2로의RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 전이이다. 전사 신장의 후생 유전학 적 dysregulationTE확실히로 정의 된 여러 인간의 악성 종양의 진행에 도움이 주어진, 가난한 응답에 달하는 프로 염증 반응 경로에서 최적이 아닌 신호로 이어지는 면역 요법3에대한 결과, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 암에서 이러한 광범위한 비 유전 적 전사 이상을 연구하는 유용한 시험관 내 모델을 확립하는 것입니다. 이러한 관점에서, CDK9의 만성 약리학적 억제의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에 있는 비 유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모형을 만들기위한 효과적인 전략이다. 만성 CDK9 억제를 사용하는 근거는 RNA Pol II의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 제거하여 RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사 신장으로 억제한다는 것입니다. 또한,TE확실히 암, 우리의 그룹3에의해 이전에 설명한, 어떤 특정 체세포 돌연변이의 밑에 분류되지 않습니다. 따라서 비유전적(pharmaological) 모델은 유리하며 그(것)들에서 관찰된 광범위한 전사 및 후생유전학 적 결함을 가장 잘 모방한다. 본 명세서의 방법은 뮤린 암세포의 만성 플라보피리돌 치료 모델의 생성 및 특성화를 상세히 설명한다. 이 방법은 더 긴 게놈 길이를 특징으로 하는 유전자를 따라 전사 신장을 명백하게 방해하며, TNF/NF-θB 및 인터페론/STAT 신호와 같은 유도성 발현과 함께, 심오하게 조절되는 유전자의 수준에서 제어됩니다. 전사 신장3,4,5. 전반적으로, 전사 신장 결함의 이 최적화된 뮤린 세포주 모형은 새로 기술된TE를 연구하는 우리의 지식에 유일한 모형이 확실히 종양을 연구하기 위하여- 반대로 종양 면역 공격에 저항을, 악용하기 위하여 유용한 시스템을 렌더링하고 암에서 핵심 전사 기계에서 비 유전 적 결함의 취약점을 검사 vis-à-vis 면역 매개 세포 공격.

<table><tbody><tr><td>hhis6FasL</td><td>세포 신호</td><td>5452</td><td></td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>12 웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>20% 메탄올</td><td>Fisher Chemical</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 18% SDS 폴리아크릴아미드 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>5% 분유</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>7-메틸구아노신 항체</td><td>BioVision</td><td>6655-30T</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Cellstar</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AF647-conjugated mouse CD8</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100727</tr><tr><td>항생제 및 항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>항-His 항체</td><td>세포 신호</td><td>2366&thinsp; P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabit</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td>Dilution 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-Rat</td><td>Cell Signaling</td><td>7077S</td><td>Dilution 1:5000</td></tr><tr><td>Bradford assay Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000121</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ACROS Organics</td><td>24040-0100</td><td></td></tr><tr><td>BV421-conjugated mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>109831</td><td></td></tr><tr><td>crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Oligo (dT)25</td><td>Ambion</td><td>61002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>45015</td><td></td></tr><tr><td>고정성 생염색제/사염색염료 e780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Flavopiridol</td><td>Selleckchem</td><td>S1230</td><td></td></tr><tr><td>H3k36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td>희석 1:2000</td></tr><tr><td>IFN-&알파;</td><td>R& D 시스템</td><td>12100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&감마;</td><td>R& D 시스템</td><td>485-MI-100</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td></td></tr><tr><td>NF-&kappa; B</td><td>세포 신호</td><td>8242s</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>p-NF-&kappa; B</td><td>세포 신호</td><td>3033s</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>p-Ser2-RNAPII</td><td>활성 모티프</td><td>61083</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>p-Ser5-RNAPII</td><td>활성 모티프</td><td>61085</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>p-STAT1</td><td>세포 신호</td><td>7649s</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>RiboMinu 진핵생물 키트</td><td>Ambion</td><td>A10837-08</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>산타 크루즈 생명공학</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>RNAPII</td><td>Active Motif</td><td>61667</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>STAT1</td><td>세포 신호</td><td>9175s</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>TNF-&알파;</td><td>R& D 시스템</td><td>410-MT-010</td><td></td></tr><tr><td>총 H3</td><td>세포 신호</td><td>4499</td><td>희석 1:2000</td></tr><tr><td>트라이 시약</td><td>시그마</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>트리톤</td><td>시그마</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>AA Hoefer</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin</td><td>세포 신호</td><td>12620S</td><td>희석 1:5000</td></tr><tr><td>&베타;-ME</td><td>G 바이오사이언스</td><td>BC98</td><td></td></tr></tbody></table>

만성 cdk9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (te확실히)을연구합니다.

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

우리는 이전에 암의 부분 집합이 mRNA 전사 신장 (TE)에 있는 광범위한 결핍을 가진 글로벌 전사 deregulations에 의해 정의된다는 것을 보고했습니다- 우리는 TE와 같은 암을확실히칭합니다. 특히, TE확실히 암은 그들의 억압으로 이끌어 내는 인터페론/JAK/STAT 및 TNF/NF-θB 통로와 같은 유전자의 큰 세트에서 가짜 전사 및 결함이 있는 mRNA 처리를 특징으로 합니다. TE는 신장 세포 암및 전이성 흑색종 환자에 있는 종양의확실히 특수형은 면역 요법에 있는 나쁜 반응 및 결과와 유의하게상관합니다. 면역 요법에 대한 중요한 장애물을 포팅으로 -이 프로토콜의 목표는 이러한 광범위하고 비 유전적 연구를 위해 체외 TE확실히 마우스 모델을 확립하는 것입니다. 암에 있는 전사 이상 및 새로운 통찰력, 기존 약에 대한 새로운 용도를 얻거나, 그 같은 암에 대하여 새로운 전략을 찾아내십시오. 우리는 RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 폐지하기 위해 만성 플라보피리돌 중재 CDK9 억제를 상세히 설명하며, RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사체로 억제합니다. 신장. TE가확실히 어떤 특정 체세포 돌연변이의 밑에 분류되지 않다는 것을 감안할 때, 약리학 모형은 유리하고, 그(것)들에서 관찰된 광범위한 전사 및 후생유전학 결함을 가장 잘 모방합니다. 플라보피리돌의 최적화된 치사용량의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에서 비유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모델을 만드는 유일한 효과적인 전략이며, 임상적으로 관찰된 TE를 밀접하게 모방합니다. 확실히 특성. 따라서, TE의 이 모형은확실히 면역성이 있는 중재한 세포 공격에 저항하는 에서 그(것)들을 가능하게 하는 세포 자율적인 요인을 해부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

여기서, 우리는 25 nM에서 플라보피리돌로 치료한 만성 서브치사(도2)에의해 얻어진TE확실히 세포 모델을 확립하기 위한 상세한 계획(도1)을제공한다. 도 3에서,플라보피리돌로 치료한 3일 동안, B16 OVA 세포는 TE의 부분적인 특성을확실히 나타내지만, 1주일의 치료 후, B16/F10 OVA 세포는 RNA Pol II의 CTD에 대한 세린 2 위치에서 의인산화의 심오한 손실을 나타낸다. H3K36me3의 현저한 감소와 함께, 엑슨 경계를 정의하는 데 연루된 히스톤 수정과 도망가는 비밀 전사의 억제제. 결과적으로, TE확실히 세포 모델은 부적절하게 캡및 비-폴리-아데닐화 mRNA의 명백하게 증가된 비율로 중요한 mRNA 처리 결함을<strong cl...

프로토콜은 비 유전적 결함 전사 신장의 시험관 내 뮤린 암종 모델을 자세히 설명합니다. 여기서, CDK9의 만성 억제는 모든 암 유형의 약 20%에서 존재하는 임상적으로 과용된TE 를 모방하고 연구하기 위해 프로-염증 반응 유전자를 따라 RNA Pol II의 생산적인 신장을 억압하는 데 사용된다.

만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE확실히)을연구합니다.

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription ...

TEdeff 암이 면역 요법에 대한 중요한 장애물이라는 점을 감안할 때, 우리의 약리학 모델은 그러한 암에서 관찰된 광범위한 전사 및 후성 유전학 적 결함을 적절하게 모방하고 새로운 통찰력을 얻고, 기존 약물에 대한 새로운 용도를 찾거나, 그러한 암에 대한 새로운 전략을 찾을 수 있기 때문에 유리한 도구입니다. 이것은 암에 있는 전사 신장 결함을 연구하기 쉬운 확립하기 쉬운 및 일반화할 수 있는 모형입니다, 시험관 내와 생체 내 둘 다 종양 면역 상호 작용을 공부하는 것을 가능하게 합니다. 이 방법은 또한 인간 암종 선에 적용될 수 있습니다.우리는 짧은 기간 동안 T47D 및 CAL51에 이것을 시험하여 유사한 TEdeff와 유사한 특성을 초래했습니다. 여기서 설명하는 프로토콜은 만성 CDK9 억제에 의한 TEdeff와 같은 기능 생성에 중요한 알려진 변수를 최소화하는 기본 프레임워크를 제공합니다. 그러나, 다른 뮤린 라인에 대 한 flavopiridol의 정확한 sub치명적인 복용량을 최적화 하기 위해 주의 해야 합니다.세포 도금 밀도, 배양 조건, 사이토카인 자극 조건의 변이의 영향은 다른 세포 뮤린 라인에 따라 다를 수 있다. 올리고 dT 자기 구슬을 사용하여 이전에 리보소말 RNA 고갈된 시료의 절반으로부터 폴리아 양성 RNA를 추출하는 것으로 시작한다. 30초 동안 소용돌이를 통해 바이알의 구슬을 다시 중단하고 구슬 200마이크로리터를 튜브로 옮킨다.바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 내용을 혼합합니다. 튜브를 자석에 1분간 놓고 상체를 폐기합니다. 그런 다음, 자석에서 튜브를 제거하고, 결합 버퍼의 100 마이크로 리터에서 세척 된 구슬을 다시 중단합니다.리보소말 RNA 고갈된 시료의 부피를 pH 7.5에서 10밀리머 트리-HCl으로 100 마이크로리터로 조정한다. 샘플에 바인딩 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 혼합물을 2분간 섭씨 65도로 가열하여 이차 RNA 구조를 방해한 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.총 RNA 200마이크로리터를 세척된 구슬 100마이크로리터에 넣고 로터에 5분간 철저히 섞습니다. 튜브를 1~2분 동안 자석에 놓고 모든 상체를 조심스럽게 제거한 다음 자석에서 튜브를 제거하고 200 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 위아래로 몇 번 파이프를 사용하여 샘플을 혼합, 1 분 동안 자석에 튜브를 반환하고, 상체를 제거합니다.이어서, 분광계를 사용하여 분리된 비드 바운드 mRNA의 순도와 농도를 측정한다. 리보소말 RNA 고갈된 시료의 나머지 절반을 단백질 A 컬럼에 입력하여 단일 클론 7-메틸구아노신 항체를 사용하여 5-프라임 캡된 RNA를 입력합니다. 제조자의 프로토콜에 따라 RIP 키트로부터 마그네틱 비드를 세척하여 항체를 구슬에 사전 결합하고, 7-메틸구아노신 항체의 비드에 키트로부터 세척 버퍼 100 마이크로리터에 매달린 비드에 세척한다.낮은 속도로 회전하면서 실온에서 30 분 동안 혼합물을 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 간략하게 원심분리하고 자기 분리기에 놓습니다. 상체를 제거하고 폐기한 다음 튜브를 자기 분리기에서 꺼내 500 마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 다시 분리합니다.튜브를 소용돌이치고 원심분리기를 짧게 배치하고 자기 분리기에 다시 배치하고 다시 상체를 폐기합니다. 그런 다음, RNase 억제제의 1마이크로리터와 함께 항체 바인딩 구슬에 리보소말 RNA 고갈 RNA 120 나노그램을 추가하고, 가벼운 동요로 60 내지 90분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 인큐베이션 후, 샘플을 10초 동안 300배 g로 회전시키고, 미완성 mRNA로 상체를 새로운 미세원심분리기로 옮긴다.세척 버퍼 100 마이크로 리터로 세척을 두 번 더 반복하고 수집 된 상체를 풀링합니다. 원고 방향에 따라 제조된 300마이크로리터의 우레아 용해 버퍼를 추가하고 혼합물을 섭씨 65도에서 2~3분 동안 가열하여 구슬에서 캡된 mRNA를 엘테. 페놀 300 마이크로리터와 300 마이크로리터를 결합: 클로로폼:이소아밀 알코올, 혼합 반전, 10분 간 그대로 둡니다.샘플을 다시 부드럽게 섞고 원심분리기를 2분간 섞습니다. 상단 레이어를 신선한 튜브로 조심스럽게 피펫하고 아래쪽 레이어를 폐기합니다. 2-프로판올 300 마이크로리터와 3개의 어금니 나트륨 아세테이트 30마이크로리터를 시료에 넣고 몇 번 반전하고 20시간 동안 영하 20도에 넣습니다.인큐베이션 후, 원심분리는 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 버리고 실온에서 펠릿을 5 분간 건조시다. 핵이 없는 물에서 펠릿을 재중단하고 분광계로 RNA의 순도와 농도를 측정한다.원고 방향에 따라 CD8 양성 세포를 분리한 다음 시판되는 자기 분리 시스템 버퍼에서 세포를 다시 분리합니다. 세포의 모든 1 밀리리터에 대한 항체 칵테일 100 마이크로리터를 추가하고 15 분 동안 얼음에 세포를 배양합니다. 그런 다음 항체 칵테일 100 마이크로리터당 100 마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가하고 세포를 얼음 위에 15분 더 둡니다.인큐베이션 후, 7밀리리터의 자기 분리 버퍼를 세포에 추가하고, 신선한 튜브에 3~4밀리리터를 알리쿼트하고, 튜브를 5분 동안 자기위에 놓습니다. CD8 양성 세포로 액체를 얼음의 신선한 튜브로 데산합니다. 그런 다음 나머지 3~4밀리리터의 세포를 자기 구슬에 넣고 5분 동안 자석에 튜브를 놓습니다.첫 번째 배치를 사용하여 CD8 양성 세포의 두 번째 배치를 튜브에 데산합니다. 종자 설계 섬유아세포 SAMBOK 세포는 24웰 플레이트에서 75, 000 세포당 동자극 분자와 함께, 37도 섭씨, 5%의 이산화탄소 가습인 인큐베이터로 배양한다. 24시간 후, 이스코브의 수정된 덜벡코 배지로 APC 단층층을 한 번 세척하고, 원고 의 지시에 따라 보충된 2밀리리터의 6개의 순진한 세포에 0.5배 10배를 첨가한다.세포를 20시간 동안 배양한 다음, 배지를 수집하고 2분 동안 191회 g로 세포를 펠릿하여 비부착 OT-I 세포를 부드럽게 수확한다. 세포를 계산하고 B16/F10, 처리되지 않은 B16/F10-OVA 및 플라보피레돌로 전처리된 B16/F10-OVA 세포와 함께 공동 배양에서 일대일 비율로 종자합니다. 37도 섭씨, 5%의 이산화탄소 가습인 인큐베이터에서 20시간 동안 세포를 배양한 다음 OT-I CD8 양성 세포를 제거하고 PBS에서 부착물 B16/F10-OVA 세포를 세척합니다.트립신으로 05%EDTA에 부착된 세포의 3개의 단을 5분 동안 트립신으로 한 다음 5분 동안 191회 g로 펠릿을 넣습니다. 생존 성 염료 및 관련 표지 된 항체와 감기 PBS에서 수확 된 B16 /F10-OVA 세포를 배양 한 다음 유동 세포 측정으로 생존 가능성을 분석합니다. 이 프로토콜은 RNA 폴리머라제 II의 C 단말 반복 도메인에 세린 2 위치에서 인산화의 심오한 손실을 보여주고 H3K36me3의 현저한 감소를 보여주는 전사 신장 결함 세포 모델을 확립하는 데 사용되어 왔으며, 이는 엑슨 경계를 정의하고 엉뚱한 전사를 억제하는 데 연루되어 있다.세포는 부적절하게 덮인 및 비 polyadenylated mRNAs의 증가 비율로 중요한 mRNA 처리 결함을 보여줍니다. 더욱이, 주요 염증 반응 경로 유전자 및 FasL 매개 세포 죽음의 특정 억압은 이 세포 모형에서 관찰됩니다. 세포 모델이 세포 독성 T 세포 공격에 저항을 부여하는 경우 테스트하는 탐색 분석은 만성 플라보피레돌 유발 전사 신장 결함항종양 면역 공격에서 탈출수단을 부여할 수 있음을 보여준다.FLAvopiridol 처리B16/F10 세포는 OVA 유전자를 안정적으로 과발현시키는 것은 OVA 발현 세포를 향한 선택적 독성이 있는 CD8 양성 세포독성 T 세포에 영향을 받기 쉽지 않았다. 플라보피레로 전조되지 않은 세포는 주요 세포 사망을 겪었으며, OVA 항원항을 표현하지 않는 부모 B16/F10은 살아남았습니다. 25나노몰러 플라보피라이트 치료에 인포세린 2및 H3K36 트리메틸화 수준의 감소가 phopsho-STAT1 및 인-NF-kappaB 레벨의 감소를 보장하지 않는다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.각 마우스 암종 라인은 고유하며, JAK1 및 CCNT1은 플라보피레돌의 효과를 구출할 수 있다. 추가적으로, 이 모형은 선천적이고 적응성 항종양 면역 반응에 대하여 TEdeff 암에 의해 제안된 저항을 감시하기 위하여 생체 내에서 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 항아시아로 치료는 NK 세포의 활성을 조절하는 데 사용될 수 있고, 면역 체크포인트 요법은 TEdeff 종양 베어링 마우스에게 투여될 수 있었다.종양 에 침투하는 림프구 또는 TIL, 부하는 면역 요법에서 성공의 지표입니다. 우리의 모델은 면역 요법 전후에 TEdeff 암 미세 환경에서 TiL의 활성화 및 피로의 정도를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

a-murine-cell-line-based-model-chronic-cdk9-inhibition-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

inducible과 관심의 유전자의 치료 cDNA overexpression 또는 shRNA로 인한 똑 다운과 인간의 세포 라인을 생성하기 위해 신속하고 간단한 방법. 이 방법은 일시적 transfection 방법 또는 기존 최저 / 한방 전략에 의해 변경하기가 어렵 안정적으로 높은 reproducibly 조작 세포 라인에 연구자 수 있습니다.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

임상 적으로 전이성 유방암에서 유방 유관 시스템 결과에 아데노 바이러스 크레와 잠재 돌연변이의 활성화. YFP 발기인의 설립은 말초 전이성 종양 세포의 추적을 할 수 있습니다. 이 모델은 잠재 전이, 항 종양 면역, 유방암을 치료하는 새로운 면역 요법을 디자인을 공부하는 데 유용합니다.

유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시

텔로미어와 텔로머라제는 노화와 종양 형성에 필수적인 역할을 합니다. 이 프로토콜의 목표는 두 개의 쥐 유도성 텔로머라제 넉인 대립유전자를 생성하는 방법과 조직 퇴행/재생 및 암 연구에 이를 활용하는 방법을 보여주는 것입니다.

조직의 변성 / 재생 및 암의 연구에서 설치류 유도 성 텔로 머라 대립 유전자를 활용

여기에서는 항암 치료제에 반응하는 단일 세포를 종단으로 추적하는 장기 타임 랩스 현미경 검사 방법을 설명합니다.

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

인간 종양 이종 이식은 생체 혈관의 성장 단계 중 마우스 유래의 세포에 의해 함침된다. 하류 분석시 이러한 세포의 오염에 의한 바이어스를 회피하기 위해, 자기 세포 선별에 의해 모든 마우스 세포의 광범위한 공핍을 허용하는 방법을 개발 하였다.

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쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

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Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.

조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석

두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

이 프로토콜은 체외/생체 내 기능 분석, 전사체학 및 컴퓨터 분석을 포함하여 쥐 CAF를 배양, 조작 및 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다. 또한, 인간 유방암 종양 컬렉션에서 레이저 캡처 미세 절개 기질 및 상피 구성 요소의 공개적으로 사용 가능한 전사체를 분석하기 위해 개발된 웹 기반 플랫폼에 대해 설명합니다.

Cancer-Associated Fibroblasts from Mouse Mammary Tumors as Tools for Molecular and Computational Studies(분자 및 컴퓨터 연구를 위한 도구로서의 마우스 유방 종양에서 유래한 암 관련 섬유아세포)

학습하세요 만성 CDK9 억제를 이용한 뮤린 암 세포주 기반 전사 신장 결점 모델을 통해 비유전적 전사 이상과 종양-면역 상호작용을 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 면역치료 저항성 암에 대한 새로운 치료 전략 개발에 활용됩니다.

만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE^{확실히)을}연구합니다.

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