단일 뉴클레오티드 해상도로 리보솜 전좌의 메커니즘을 연구하는 이중 DNA 통치자

이중 DNA 눈금자 분석은 리보솜 전좌에 대한 기계적 통찰력을 제공하고 다른 핵산 변위를 조사할 수 있습니다. 우리의 이중 DNA 눈금자 분석법은 현재 단일 뉴클레오티드 분해능을 가진 리보솜 복합체에서 mRNA의 입구와 출구 면을 객관적으로 조사할 수 있는 유일한 방법입니다. 유사한 방법은 또한 화학요법 약의 DNA 결합 강도 및 선택성을 측정하기 위하여 적용됩니다.

이 방법의 시각적 데모는 우리의 기술의 장점을 직관적으로 보여주고 다른 연구자들이 더 많은 응용 프로그램으로 발전할 수 있도록 도울 수 있는 좋은 기회입니다. 먼저 중앙에 큐브를 드릴링하여 스티렌 스트립으로 플라스틱 샘플을 3밀리미터 x 2밀리미터 로 3밀리미터로 드릴링합니다. 그런 다음 에폭시를 사용하여 약 5밀리미터 길이의 비오틴 코팅 유리 조각을 바닥 표면에 접착제로 붙입니다.

밀리리터 스트렙타비딘 수성 용액당 0.25 밀리그램의 20 마이크로리터를 시료에 잘 넣고 실온에서 40분 동안 배양합니다. 그런 다음 TAM10 버퍼로 샘플을 두 번 헹요. 항생제 없이 리보솜 복합체를 고정하려면 먼저 시료로부터 버퍼를 잘 제거하고 0.1 마이크로몰러 MF-Pre 또는 MF-Post 리보솜 복합체20을 샘플에 잘 첨가한다.

1시간 동안 섭씨 37도에서 배양한 다음 TAM10 버퍼로 한 번 헹구습니다. 리보솜 복합체는 이제 mRNA의 5프라임 엔드 비오틴을 통해 표면에 있는 스트렙타비딘과 결합한다. 항생제를 이용한 실험을 위해 MF-Pre 복합체의 9마이크로리터를 4밀리머 네오마이신 1편, 섭씨 37도10분으로 배양한다.

그런 다음 튜브 0.6 마이크로리터 60 마이크로몰라 EFG, 0.8 마이크로리터 100 마이크로몰라 GTP, 0.8 마이크로리터 100 밀리머 PEP, 밀리리터 피루바테 키나아제 당 1.3 밀리그램, 6.43 마이크로리터 TAM10 완충제, 1마이크로리터 TAM10 완충제 및 1마이크로리터 에 결합한다. 섭씨 37도에서 20분간 배양하세요. 그런 다음 두 혼합물을 결합하고 섭씨 37도에서 추가로 5 분간 배양합니다.

유사한 다른 항생제 실험을 수행, 의 농도와 0.2 밀리머 비오 마이신, 0.4 밀리머 hygromycin B, 그리고 0.25 밀리몰러 fusidic 산. 프레임 시프팅 스터디의 경우 미끄러운 모티프인 U6A와 관련된 MFNF-Pre 복합체의 인큐베이션을 반복하십시오. fusidic 산 플러스 네오 마이신의 항생제를 포함.

혼성화 프로세스의 완료를 보장하기 위해 충분한 시간이 필요합니다. 또한 실제 1개의 몰 나트륨 염화나트륨과 TAM10 버퍼를 사용하여 호모스테디 시스템을 유지하는 것이 좋습니다. 인큐베이션 후 샘플에서 버퍼를 잘 제거합니다.

1개의 마이크로몰러 생물화한 DNA 가닥의 20마이크로리터를 추가하고, 밤새 실온에서 배양합니다. 아침에, TAM10 버퍼와 함께 한 번 형성 된 DNA / mRNA 복층을 헹구는다. 샘플에서 버퍼를 잘 제거합니다.

그런 다음 밀리리터 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 구슬당 0.5 밀리그램의 20 마이크로리터를 시료에 잘 넣고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 조심스럽게 홀더에 샘플을 삽입하고 5 분 동안 84 시간 g에서 표면에서 자유 자기 입자를 제거하기 위해 원심 분리기에 배치합니다. 레이저를 켭니다.

그런 다음 전원 버튼을 누릅니다. 감도를 500 밀리볼트로 조정하고 약 2시간 동안 기다렸다가 원자자력계를 따뜻하게 하고 안정화합니다. 원자 자력계를 설정하려면 계측기 제어 소프트웨어를 실행하고 모터 이동 모드를 노이즈 및 기본 위치로 설정합니다.

전면 패널의 잠금을 누릅니다. 감도를 다시 200 밀리볼트로 조정합니다. 레이저의 전류와 전압을 조정하고 최적의 신호 해상도를 위해 적절한 공진 피크 및 신호 대 잡음 레벨을 찾습니다.

전면 패널에서 스윕을 누릅니다. 진폭 대 폭 비율이 0.5 를 초과하고 위상 값이 너비가 170 hertz 미만인 5도 보다 작은지 확인합니다. 다른 SR530 잠금 증폭기의 출력을 레이저의 피드백에 연결하여 주파수를 잠급합니다.

함수 생성기 ATF20B를 연결하여 500 밀리볼트 피크의 정사각형 파를 피크로 입력하고, 100 밀리헤르츠를 전류를 자기 신호로 변환하기 위한 기준 신호로 입력합니다. 그런 다음 함수 생성기를 분리합니다. 모터 이동 모드를 양방향 및 기본 위치로 260mm로 설정합니다.

온도 컨트롤러의 상태를 확인하여 원자 센서의 온도가 섭씨 약 37도에 있는지 확인하십시오. 빈 샘플 홀더의 신호를 측정하기 위해 샘플을 적재하지 않고 프로그램을 직접 실행하여 전체 시스템의 안정성을 두 번 확인합니다. 시료를 자화하려면 핀셋을 사용하여 샘플을 홀더에서 꺼내 2 분 동안 자화 단계에 놓습니다.

그런 다음 샘플을 샘플 홀더에 다시 넣고 원심분리기를 335.4배 g에서 20분 동안 넣습니다. 특이하지 않은 자기 입자를 제거합니다. 그런 다음 핀셋으로 샘플을 모터에 로드합니다.

전면 패널의 잠금을 클릭하여 프로그램을 실행합니다. 한편 핀셋을 사용하여 다른 샘플을 홀더에 로드하고 원심분리기에 넣습니다. 코팅 된 유리 면은 원심 분리기의 중심을 향하고, 4 분 동안 335.4 배 g에서 원심 분리를 시작합니다.

모터가 0으로 돌아오면 약 5분 후에 전면 패널에 저장을 클릭합니다. 핀셋을 사용하여 모터에서 원심분리기 홀더로 샘플 1개를 전송합니다. 원심 속도를 100rpm 또는 이와 유사한 스텝 크기로 증가시켜 더 강한 힘을 적용하십시오.

원심분리기의 샘플을 교환합니다. 매번 점차적으로 힘을 증가시키기 위해 번갈아 프로세스합니다. 10~12개의 데이터 포인트 후에 완전한 힘 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.

계획된 모든 실험이 완료되면 장비를 끄고 켜진 대로 반대 순서로 진행합니다. 홀더에서 샘플을 제거하고 청소 및 향후 사용을 위해 에탄올에 담가 두습니다. 마그네틱 비드 오염시 아세톤으로 샘플 홀더를 청소하십시오.

이 프로토콜에서, 리보솜 복합체는 mRNA의 5-프라임 끝을 통해 표면에 고정되었고, 조사 DNA 통치자에 쉽게 접근할 수 있는 5프라임 및 3프라임 측을 모두 만들었다. 5-프라임 측에 대한 링커가 50 티민보다 길면 강력한 자기 신호가 감지되어 DNA /mRNA 이중으로 성공적으로 형성되었습니다. DNA상에 있는 뉴클레오티드의 수를 변화시킴으로써, 해복 길이에 대한 해리력의 상관관계는 각각 3-프라임 및 5-프라임 측면에 대해 달성되었다.

MF-Pre에서 MF-Post로의 정상적인 전좌 결과는 항생제가 없는 상태에서 양측의 3개의 핵성으로 3개의 뉴클레오티드에 의해 이동된 리보솜을 보여줍니다. MF-Pre는 P와 A 사이트에서 각각 fMet-tRNA및 페닐알라닌-tRNA를 운반했으며, MF-Post는 각각 E 및 P 사이트에서 fMet-tRNA와 페닐라닌-tRNA를 가지고 빈 A 사이트를 가지고 다녔다. 그러나, fusidic 산과 아디오마이신 항생제가 모두 존재했을 때, 리보솜은 5-프라임 측에 단 하나의 뉴클레오티드에 의해 움직였지만 3개의 주요 측에 2개의 뉴클레오티드에 의해 움직였다.

항생제를 씻은 후에, 일반적인 전좌는 5-프라임 과 3개의 프라임 측 모두에서 3개의 뉴클레오티드 운동에 의해 입증된 바와 같이, 일어났습니다. 시료를 자화할 때 코팅된 표면에 접근하여 자석을 수직으로 두어야 합니다. 그리고 비특이적으로 결합된 자기 입자를 제거하는 것은 데이터 정확도와 품질에 매우 중요합니다.

우리의 기술은 분자 생물학에서 널리 발생하는 핵산의 분자 변위를 조사하는 고해상도 및 일반적으로 적용 가능한 방법을 제공합니다.