Name: 화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 NMR 기반 활성 반응을 통해 뉴클레오시드 리보하이드라제 억제제를 식별하고 특성화하는 방법을 배우세요. Trichomonas vaginalis 효소 표적화 및 항트리코모나스 신약 개발에 활용됩니다.

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아스트라제네카 단편 라이브러리에서 화합물을 제공한 딘 브라운 박사와 AGNH 및 UNH 효소를 제공한 데이비드 파친 박사에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 B. J. S에 상 번호 R15AI128585의 밑에 건강의 국가 학회의 알레르기그리고 감염증의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.연구 는 또한 Horace G. McDonell 여름 연구 펠로우십에 의해 지원되었다 S. N. M., Landesberg 가족 J. A. G., 교수 개발 보조금 및 아델피 대학에서 B. J. S에 프레드릭 베텔하임 연구 상수여.

1. 500 μM 및 250 μM에서 초기 시험 화합물 검아
<ol><li>반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비합니다.<ol>
<li>디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 물 속기(아데노신 또는 5-플루오루리딘)와 50 mM 시험 화합물의 재고 용액을 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.</li>
		<li>기질 12 μL (아데노신 또는 5-플루오루리딘)을 각각 4 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 1-4에 추가합니다.</li>
		<li>튜브 1(0분 제어) 및 4(30분 제어)에 6 μL의 증분 DMSO를 추가합니다. 튜브 2에 6 μL의 테스트 화합물을 추가합니다. 시험 화합물 3 μL과 3 μL의 증정 된 DMSO를 튜브 3에 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>충분한 반응 스톡 솔루션을 준비합니다. 참고: 스톡 용액은 각각 완충액 517 μL, 60 μL의 중수소 산화물과 5 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 포함하는 5 가지 반응을 위한 것입니다. 사용할 효소 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.<ol>
<li>2.59 mL의 반응 버퍼 (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH 6.5)를 15 mL 원추형 튜브에 추가합니다. 원유 관에 300 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원엽에 25 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.</li>
		<li>원추형 튜브를 두 번 부드럽게 뒤집어 섞어주세요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동시에 0 분 제어 반응을 시작하고 담금질하십시오. 반응 스톡 용액의 582 μL을 깨끗한 마이크로퍼지튜브로 이송한다. 이 마이크로 퍼지 튜브에 10 μL의 1.5 M HCl을 추가합니다. 결합된 592 μL을 마이크로퍼지 튜브 1로 옮김. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다.</li>
	<li>나머지 세 가지 반응을 비틀거리는 방식으로 시작하고 실행합니다. 시간 0 분, 마이크로 퍼지 튜브 2에 반응 스톡 용액의 582 μL을 전송합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다. 마이크로 퍼지 튜브 3및 4의 경우 30초 간격으로 반복합니다. 30분 기다립니다.</li>
	<li>반응을 담금질. 30분 동안 1.5M HCl의 10 μL을 마이크로퍼지2에 추가합니다. 마이크로 퍼지 튜브 3및 4의 경우 30초 간격으로 반복합니다. 각 마이크로퍼지에서 NMR 튜브로 600 μL의 용액을 전달합니다.</li>
	<li>각 샘플에서 1D NMR 스펙트럼을 획득합니다. 데이터를 처리하여 올바른 진행 및 플랫 기준선을 보장합니다.</li>
	<li>제어 스펙트럼에 대한 기판의 백분율 변환을 계산합니다.<ol>
<li>0분 및 30분 컨트롤에 대한 스펙트럼을 오버레이합니다. 0분 컨트롤에서 기판 신호를 조정하여 30분 컨트롤과 일치시다. 이 백분율을 기록합니다.</li>
		<li>백분율 전환을 (100 – 1.7.1 단계에서 결정된 백분율)으로 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테스트 화합물을 포함하는 반응에 대한 기판의 백분율 변환을 계산합니다.<ol>
<li>500 μM 시험 화합물을 함유하는 0분 대조군 및 제1 반응에 대한 오버레이 스펙트럼. 0분 제어에서 기판 신호를 확장하여 스펙트럼과 테스트 화합물을 일치시다. 이 백분율을 기록합니다. 백분율 전환을 (100 – 백분율 결정)으로 계산합니다.</li>
		<li>250 μM 시험 화합물을 함유하는 제2 반응에 대해 반복한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 시험 화합물 농도에 대한 백분율 반응 및 퍼센트 억제를 계산합니다.<ol>
<li>백분율 반응을 (1.8.1/1.7.2) x 100으로 계산합니다.</li>
		<li>퍼센트 억제를 (100 – 단계 1.9.1에서 결정된 백분율)로 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. IC50 값의 결정
<ol><li>반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비합니다.<ol>
<li>기질(아데노신 또는 5-플루오루리딘)의 재고 용액을 수분 및 10 mM 테스트 화합물을 deuterated DMSO에서 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mM 테스트 화합물의 연속 희석을 준비하십시오 (Deuterated DMSO에서).<ol>
<li>5 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 1-5에 36 μL deuterated DMSO를 추가합니다.</li>
		<li>튜브 1에 12 μL 10 mM 테스트 화합물을 넣고 가볍게 두드려 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 2.5 mM입니다.</li>
		<li>튜브 1에서 튜브 2로 12 μL을 옮기고 가볍게 두드려 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.63 mM입니다. 튜브 2에서 튜브 3로 12 μL을 옮기고 가볍게 눌러 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.16 mM입니다. 튜브 3에서 튜브 4로 12 μL을 옮기고 가볍게 눌러 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.04 mM입니다. 튜브 4에서 튜브 5로 12 μL을 옮기고 가볍게 눌러 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.01 mM입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>반응을 위해 14 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브를 준비하십시오.<ol>
<li>14 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 1-14에 각각 기질 (아데노신 또는 5-플루오루딘)의 12 μL을 추가합니다.</li>
		<li>튜브 1(0분 제어) 및 14(30분 제어)에 12 μL의 증분 DMSO를 추가합니다.</li>
		<li>튜브 2와 3에 10 mM 테스트 화합물 12 μL을 추가합니다. 튜브 4와 5에 2.5 mM 테스트 화합물 12 μL을 추가합니다. 튜브 6 과 7에 0.63 mM 테스트 화합물의 12 μL을 추가합니다. 튜브 8과 9에 0.16 mM 테스트 화합물 12 μL을 추가합니다. 튜브 10 및 11에 0.04 mM 테스트 화합물의 12 μL을 추가합니다. 튜브 12 및 13에 0.01 mM 테스트 화합물의 12 μL을 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>완충액 511 μL, 60 μL의 중수소 산화물과 5 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 포함하는 15 개의 반응을 실행하기에 충분한 반응 스톡 솔루션을 준비하십시오. 사용할 효소 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.<ol>
<li>반응 버퍼 7.67 mL (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 15 mL 원추형 튜브에 추가합니다. 원유 관에 900 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원유에 75 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.</li>
		<li>원추형 튜브를 2x 부드럽게 뒤집어 섞습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단계 1.3-1.9에 설명 된 단계를 따라 (반응 스톡 용액의 576 μL 사용) 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 반응을 결정합니다.</li>
	<li>그래프 패드 프리즘을 사용하여 IC50 값을 계산합니다.<ol>
<li>반응 테스트 화합물 농도(200 μM, 50 μM, 12.5 μM, 3.13 μM, 0.78 μM, 0.20 μM)와 백분율 반응(각각 2개 값)을 연관시키는 데이터 테이블을 작성합니다.</li>
		<li>비선형 곡선 맞춤을 사용하여 IC50 값 및 표준 오차를 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 100 μM 및 50 μM에서 세제 카운터 스크린 검사
<ol><li>반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비합니다.<ol>
<li>기질(아데노신 또는 5-플루오루리딘)의 재고 용액을 수분 및 10 mM 테스트 화합물을 deuterated DMSO에서 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.</li>
		<li>기질 12 μL(아데노신 또는 5-플루오루리딘)을 각각 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 8개, 1-8개에 첨가합니다.</li>
		<li>튜브 1과 5(0분 컨트롤) 및 4 및 8(30분 컨트롤)에 6 μL의 증정 된 DMSO를 추가합니다. 튜브 2와 6에 6 μL의 테스트 화합물을 추가합니다. 시험 화합물 3 μL과 3 μL의 증정 된 DMSO를 튜브 3 및 7에 추가하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세제 없이 충분한 반응 스톡 용액을 준비하여 각각 517 μL의 버퍼, 60 μL의 중수소 산화물과 5 μL의 효소 용액(AGNH 또는 UNH)을 포함하는 5개의 반응을 실행합니다. 사용할 효소 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.<ol>
<li>2.59 mL의 반응 버퍼 (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 15 mL 원추형 튜브에 추가합니다. 원유 관에 300 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원엽에 25 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.</li>
		<li>원추형 튜브를 2x 부드럽게 뒤집어 섞습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.01% v/v Triton X-100 세제로 충분한 반응 스톡 솔루션을 준비하여 완충액 517 μL, 중수소 산화물의 60 μL 및 5 μL의 효소 용액(AGNH 또는 UNH)을 각각 포함하는 5가지 반응을 실행합니다.<ol>
<li>트리톤 X-100 세제 20 mL의 반응 버퍼 (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 추가합니다. 세제 용액은 1 일 이내에 사용해야합니다.</li>
		<li>0.01% 트리톤 X-100 세제를 함유한 반응 완충액 2.59 mL를 15 mL 원엽 튜브에 추가합니다. 원유 관에 300 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원엽에 25 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.</li>
		<li>원추형 튜브를 2x 부드럽게 뒤집어 섞습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브 1-4의 경우, 세제 없이 반응 스톡 용액을 사용하여, 단계 1.3-1.9에 설명된 단계를 따라 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 억제를 결정한다.</li>
	<li>튜브 5-8의 경우, 반응 스톡 용액과 0.01% v/v 트리톤 X-100 세제를 사용하여, 단계 1.3-1.9에 설명된 단계를 따라 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 억제를 결정합니다.</li>
</ol>4. 점프 희석 카운터 스크린 어세이
<ol><li>반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비<ol>
<li>기질(아데노신 또는 5-플루오루리딘)의 재고 용액을 수분 및 10 mM 테스트 화합물을 deuterated DMSO에서 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.</li>
		<li>53.8 μL의 반응 버퍼(50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 2개의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브(각각), 1 및 2에 추가합니다. 튜브 1과 2에 5 μL의 효소(AGNH 또는 UNH)를 넣습니다.</li>
		<li>511 μL의 반응 버퍼를 두 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 3 및 4 (각각)에 추가합니다. 튜브 3과 4에 60 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 튜브 3과 4에 5 μL의 효소(AGNH 또는 UNH)를 넣습니다.</li>
		<li>튜브 1(30분 제어)에 1.2 μL의 증분 DMSO를 추가합니다. 튜브 2에 1.2 μL의 테스트 화합물을 추가합니다. 튜브 3 (30 분 제어)에 12 μL의 증분 DMSO를 추가합니다. 튜브 4에 12 μL의 시험 화합물을 추가합니다. 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>희석 액으로 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브 2개를 준비합니다.<ol>
<li>468 μL의 반응 버퍼를 각각 2개의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브, 5 및 6에 추가합니다. 각 튜브(5 및 6)에 60 μL의 중수소 산화물을 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>반응에 대한 4 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브를 준비하십시오.<ol>
<li>기질 12 μL(아데노신 또는 5-플루오루리딘)을 각각 4개의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브, 7-10에 첨가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>점프 희석을 수행하고 반응을 시작합니다.<ol>
<li>튜브 5에서 튜브 1로 용액 528 μL을 전달합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다. 튜브 6에서 튜브 2로 용액 528 μL을 전달합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다.</li>
		<li>시간 0 분, 튜브 1에서 튜브 7에 용액의 588 μL을 전송합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 2배 흡인하고 분배합니다. 30 s 간격으로, 튜브 2에서 튜브 8, 튜브 3에서 튜브 9, 튜브 44에서 튜브 10으로 용액의 588 μL을 전송합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다. 30분 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브 7-10의 경우, 단계 1.5-1.9에 설명된 단계를 수행하여 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 억제를 결정합니다.</li>
</ol>5. 대장균 전체 세포의 화합물 세포
<ol><li>실험 전날 대장균의 10 mL 하룻밤 배양을 준비한다.</li>
	<li>NMR 실험을 위해 대장균 세포를 준비하십시오.<ol>
<li>15,000 x g에서10 분 동안 1 mL aliquots로 세포를 원심 분리합니다.</li>
		<li>상판을 버리고 1 mL의 반응 완충제(50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH=6.5)에서 세포의 각 aliquot를 소용돌이에 의해 재중단한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 변경 사항과 함께 원하는 분석에 대한 섹션 1 또는 2를 따르십시오.<ol>
<li>반응 스톡 용액에서 280 μL의 완충액을 280 μL의 재부유 된 세포로 대체합니다.</li>
		<li>반응 스톡 용액에서 5 μL의 효소(AGNH 또는 UNH)를 완충액 5 μL로 대체합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

기질 및/또는 제품이 NMR 스펙트럼에서 용해 가능한 신호를 가지고 있는 경우, 설명된 프로토콜은 일반적으로 많은 효소에 적용가능하다. 그러나, 기판의 농도가 그 Km 값에 가깝고 합리적인 기간 내에 NMR 실험에서 검출될 수 있을 만큼 충분히 높다는 것이 중요하다. 기판 농도가 2-3배 이하인 Km 값은 경쟁력, 비경쟁성 및 비경쟁 억제제 4를 검출하는 데 최적입니다. 여기서 입증된 바와 같이 UNH, 기판, Km 값은 최저 15 μM이 적합하다. 극저온 프로브에 대한 NMR 데이터 수집과 결합된 CH3 또는 CF3 신호가 있는 기판을 사용하면 이 임계값을더욱낮출 수 있습니다 15. 그러나 1 μM 이하의 기질 Km 값을 가진 효소는 NMR 실험의 내재된 낮은 감...

핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 효소 반응을 특성화하고 모니터링하기위한 잘 확립되어 있습니다 1,2. 화학 적 변화와 커플링 패턴의 차이는 기판과 제품 공명을 구별하는 데 사용되며 상대 공명 강도는 반응의 백분율을 정량화하는 데 사용됩니다. 기판의 소비와 제품의 생성은 모두 NMR 스펙트럼에서 직접 관찰된다. 이는 분광광도법 또는 형광 분광법과 대조되는데, 반응 시간 과정은 일부 화학 종에 기인하는 흡광도의 변화로 인해 소비되거나 생성됩니다. 다른 방법과 마찬가지로 NMR은 효소 반응을 온도, pH 또는 다른 용액 조건의 함수로 연구하는 데 사용할 수 있으며 억제제의 효과를 결정할 수 있습니다.
보다 최근에는, NMR 계 효소 활성 성검사가 단편 스크리닝 3,4에대해 입증되었다. NMR 기반 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물(종종 1mMM)의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 생성물 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 유리하게 비교됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이러한 장점은 기존의 높은 처리량 선별 검문 및 벤치탑 심사 검문 5를 보완하는 직교 검문 검사로 유용하게 만듭니다.
우리의 연구 실험실에서, NMR 기지를 둔 활동 시험은 트리코모나스 질 핵핵리보하이드라제의 억제제기준을 확인하고 평가하기 위하여 이용됩니다. 상기 T. 질성 기생충은 가장 널리 퍼진 비바이러스성 성병6을일으킨다. 기존 치료법에 대한 저항성 증가 7은 주요 표적을 나타내는 필수 뉴클레오시드 인양 경로 효소와 함께 새로운 메커니즘 기반 치료법에 대한 필요성을 주도하고있다8. NMR 기반 활성 세포는 피리미딘- 및 푸린 특이적 효소, 우리딘 뉴클레오시드 리보하이드라제(UNH)9,및 아데노신/구아노신을 선호하는 뉴클레오시드 리보하이드로라제(AGNH)10모두에 대해 개발되었다. 이 두 효소에 의해 촉매작용된 반응은 그림1에 나타내었다. NMR 분석을 사용하여 화학적 시작점에 대한 단편 라이브러리를 스크리팅하고, IC50 값을 결정하고, 응집기반 또는 공유 결합 억제제(11)를 잡초아웃한다. 동일한 아세이역시 전체 세포에서 효소 활성을 평가하기 위해 번역되고있다 12.
상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 단순성에 대한 세 가지 가정이 만들어졌습니다. 첫째, 기판은 지정되지 않는다. NMR 기반 활성 반응의 유용성을 위해, 기판의 최종 농도는 Km 값 4의2-3배 이하이어야 한다. 도시된 예에서, 아데노신 및 5-플루오로우리딘의 최종 농도는 각각 100 μM(Km = 54 μM) 및 50 μM(Km= 15 μM)이다. 프로토콜에서, 이들 농도를 달성하는 것은 5 mM 아데노신의 12 μL 또는 2.5 mM 5-플루오루리딘의 12 μL에 해당한다.
둘째, 프로토콜에 제공된 효소의 양은 5 μL로, 30분 내에 기질의 약 75% 변환을 초래하는 데 필요한 양에 대응하기 위해 선택되었다. 이러한 양은 전형적으로 정제된 효소 스톡으로부터 큰 희석을 나타내며, 희석은 각 효소에 대해 미리 결정되어야 한다. 정제된 AGNH 및 UNH 효소 스톡 용액은 수천 개의 반응에 충분한 효소를 제공하는 양현표에 -80°C에 저장됩니다. 따라서, 희석 계수는 이상적으로 단지 몇 개월마다 결정되거나 검증될 필요가 있다. 셋째, 특정 1D NMR 실험은 지정되지 않았다. 대표적인 결과에서, 1H NMR은 UNH 9에 대해 도시된 AGNH10 및 19F NMR에 대해 도시되며, 해당 참조에 기재된 NMR 실험과 함께 도시된다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다. 마지막으로, 설명된 실험 접근법이 정량적 NMR(qNMR)13,14의엄격한 요건을 준수하지 않는다는 점을 지적해야 한다. 프로토콜에서 백분율 반응은 절대 농도를 결정하는 것이 아니라 각 스펙트럼에서 동일한 공진의 강도의 상대적 변화를 사용하여 결정됩니다. 이 방법을 사용하면 qNMR에 필요한 내부 또는 외부 표준뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리 수정이 필요하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>AGNH</td><td>정제 사내</td><td>N/A</td><td>TVAG_213720</td></tr><tr><td>UNH</td><td>정제 사내</td><td>N/A</td><td>TVAG_092730</td></tr><tr><td>아데노신</td><td>시그마</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>5-플루오로리딘</td><td>시그마</td><td>F5130</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드-D6</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>DLM-10-100</td><td>D, 99.9%</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>중수소산화물</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>DLM-4-100</td><td>D, 99.9%</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Chemical</td><td></td> A144212 <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>3-(트리메틸실릴)프로피온-2,2,3,3,-d4 산성 나트륨염(TSP)</td><td>시그마</td><td>269913</td><td>D, 98%</td></tr><tr><td>2,2,2-트리플루오로에탄올-1,1-d2</td><td>시그마</td><td>612197</td><td>D, 99.5%</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>PIPETMAN Classic P1000</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>PIPETMAN Classic P200</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>PIPETMAN Classic P20</td></tr><tr><td>마이크로퓨지 튜브</td>: <td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브</td>, <td>코닝</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr>, <tr><td>볼텍스 믹서</td>, <td>Fisher Scientific</td><td></td> 02215365 <td></td></tr><tr><td>NMR 튜브</td>, <td>Norell</td><td>502-7</td><td>또는</td></tr><tr><td>NMR NMR 분광계</td>에 적합: <td>Bruker</td><td>N/ </td><td>AvanceIII500</td></tr><tr><td>프리즘 소프트웨어</td><td>GraphPad</td><td>N / A</td><td>버전 5.04</td></tr></tbody></table>

화합물 억제, ic50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 nmr 기반 활성 반응

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR 분광법은 약물 발견에서 효소 억제제의 식별 및 특성화, 특히 단편 스크리닝의 맥락에서 종종 사용됩니다. NMR 기반 활성 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 제품 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 대조됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이 속성은 전통적인 높은 처리량 검열 검문 및 벤치탑 분류 검문 검사를 보완하는 직교 검문 검사로 그(것)들을 유용하게 합니다. 상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 이 방법은 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소를 사용하여 입증된다. 1H NMR의 사용은 푸린 특이적 효소에 대해, 19F NMR은 피리미딘 특이적 효소에 대해 나타난 다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 약물 발견의 맥락에서 가장 유용하게 사용하려면, 기판의 최종 농도는 Km 값의 2-3 배 이상이어야한다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다.

도 2는 1H NMR을 사용하여 AGNH에 대하여 2개의 화합물을 시험한 결과를 다음 섹션 1을 나타낸다. 효소 반응은 각각 8.48 ppm 및 6.09 ppm에서 아데노신 싱글트와 더블음 공진의 실종에 의해 가장 쉽게 관찰및 정량화되고, 30분 대조군에서 관찰된 바와 같이 8.33 ppm에서 아데닌 싱글t 공진의 출현 스펙트럼. 500 μM 화합물 1의 존재에서, 어떤 생성물도 8.33 ppm에서 아데닌 공명의 부족에 의해 입증된 바와 같이 형성되지 않는다. 250 μM 화합물 1의 존재에서, 기판의 약 10%가 생성물로 전환되었다. 대조적으로, 화합물 2의 어느 농도도 30 분 제어 스펙트럼에서 그와 유사한 기질 및 생성물 공명에 의해 입증 된 바와 같이 효소를 억제하지 않습니다. 이 데이터는 화합물 1을 양호한 AGNH 억제제로서 식별한다. 화합물 1 (7.70-8.00 및 8.50-8.60 ppm)과 화합물 2 (7.40-7.80 ppm)에서 발생하...

NMR 기반 활성 세포는 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다.

화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMR 기반 활성 작용법은 주어진 효소에 대한 억제제의 식별, 평가 및 유효성을 검사하는 효과적인 방법을 제공합니다. 그들은 특히 단편 스크리닝에 적합합니다. NMR 아세약은 약한 억제제에 필요한 더 높은 화합물 농도에 순종한다.또한, 기자 효소의 부족은 그(것)들을 거짓 긍정에 보다 적게 수그립니다. 우리는 트리코모나스 질에서 두 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 실험실에서 NMR 애서를 사용합니다. 두 효소모두 새로운 항-트리코모날 약물에 대한 새로운 표적을 나타냅니다.NMR 어약은 일반적으로 효소를 관련시키는 연구의 모든 분야에 적용되며 세포 내부의 효소를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 중요한 측면은 올바른 시약 볼륨이 파이펫화되고 반응 구성 요소가 철저히 혼합되도록 하는 것입니다. 기판 및 테스트 화합물을 준비하려면 4개의 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 각각 12개의 미세리터를 추가하고 0분 제어 및 30분 제어 튜브에 6개의 미정 DMSO를 추가합니다.시험 화합물의 6마이크로리터를 제1 실험 튜브에 추가하고 시험 화합물의 3개의 마이크로리터와 중음DMSO3마이크로리터를 제2 실험 튜브에 첨가한다. 다음으로, 300 마이크로리터의 중수소 산화물을 반응 버퍼 2.59밀리리터를 함유한 15밀리리터 튜브에 추가하고, 그 다음으로 25마이크로리터의 효소 용액을 함유하고 있습니다. 튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 용액을 혼합하고 1.5 개의 어금니 염산 10 마이크로 리터를 반응 스톡 솔루션 582 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 추가하십시오.그런 다음, 반응 스톡 용액및 산의 전체 부피를 제로분 제어 튜브로 동시에 전송하여 제로분 제어 반응을 동시에 개시하고 담금질한다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡입하고 분배합니다. 나머지 3개의 반응을 비틀거리는 방식으로 시작하고 실행하여 반응 스톡 솔루션 582마이크로리터를 첫 번째 실험 튜브로 즉시 전송하고 방금 입증된 대로 샘플을 두 번 혼합합니다.신중한 포부와 디스펜싱은 개시 단계 동안 완전한 혼합을 보장합니다. 차동 혼합이 변수가 아닌지 확인하기 위해 각 샘플과 일치하십시오. 30초 후, 반응 스톡 용액 582마이크로리터를 제2 실험관 및 혼합으로 옮기고, 제2 실험관에서 반응을 시작하고 30분 제어관에 반응 스톡 용액 582마이크로리터를 첨가하였다.30분 후, 첫 번째 실험 관에 1.5-어금다 염산 10 마이크로리터를 추가하여 제2 실험 및 30분 제어 튜브에 대해 30초 간격으로 담금질을 반복합니다. 모든 반응이 담금질되면 각 반응에서 NMR 튜브로 600 마이크로리터의 용액을 전달합니다. 컨트롤 스펙트럼에 대한 기판의 백분율 변환을 계산하려면 샘플을 분광계에 로드하고 NMR 스펙트럼을 수집하며 0 및 30분 컨트롤에 대한 스펙트럼을 오버레이합니다.기판 신호를 0분 제어에서 배율 조정하여 30분 제어에 일치하고 이 백분율을 기록합니다. 그런 다음 백분율 변환을 기판 신호일치에서 백분율을 뺀 백분율을 계산합니다. 시험 화합물을 포함하는 반응에 대한 기판의 백분율 변환을 계산하기 위해, 500 마이크로몰러 테스트 화합물을 포함하는 제로 분 제어 및 첫 번째 반응에 대한 스펙트럼을 오버레이하고 시험 화합물과 스펙트럼과 스펙트럼을 일치시키기 위해 제로 분 제어에서 기판 신호를 배율한다.이 백분율을 기록하고 방금 설명한 대로 백분율 변환을 계산하는 데 사용합니다. 이어서, 250 마이크로몰러 시험 화합물을 포함하는 제로분 제어 및 제1 반응에 대한 스펙트럼을 오버레이하고, 시험 화합물과 스펙트럼에 맞게 제로 분 제어에서 기판 신호를 배율한다. 백분율을 기록한 후 백분율 변환을 계산하는 데 사용합니다.각 시험 화합물 농도에 대한 백분율 반응 및 백분율 억제를 계산하기 위해 먼저, 대조군 시간의 백분율 변환으로 나누어 시험 화합물의 백분율 변환으로서 백분율 반응을 계산한다 100. 그런 다음 백분율 억제를 100으로 계산하여 백분율 반응을 뺀 값입니다. 세제 카운터 스크린 분석법을 수행하려면 300 마이크로리터의 산화황과 25마이크로리터의 효소 용액을 반응 완충제 2.59 밀리리터를 함유한 15밀리리터 튜브에 추가합니다.튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 용액을 혼합하고, 트리톤 X-100 세제의 마이크로리터 2개를 반응 버퍼 20밀리리터에 추가합니다. 그런 다음 0.01%트리톤 X-100 세제를 함유한 반응 버퍼 2.59밀리리터를 새로운 15밀리리터 원내 튜브에 첨가합니다. 그런 다음 300 마이크로리터의 산화철과 25마이크로리터의 효소 용액을 튜브에 첨가합니다.튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 솔루션을 혼합합니다. 그런 다음, 100 마이크로몰라 및 50 마이크로몰러 테스트 화합물에 대한 백분율 억제를 방금 입증한 바와 같이 결정한다. 세제 없이 반응 스톡 솔루션을 사용 하 여, 4개의 튜브의 1 세트 및 4개의 튜브의 두 번째 세트에 대 한 세제와 반응 스톡 솔루션.점프 희석을 수행하기 위해 반응 완충제 468마이크로리터와 산화황 60마이크로리터를 53.8 마이크로리터의 반응 완충제, 5마이크로리터의 효소 용액 5개, 30분 동안 배양한 DMSO 1.2 마이크로리터를 포함하는 튜브로 이송한다. 혼합물을 두 번 흡입하고 분배하면서 느리지만 의도적인 방식으로 분배합니다. 반응 완충제 468마이크로리터와 산화중수소 60마이크로리터를 53.8 마이크로리터의 반응 완충제, 5마이크로리터의 효소 용액, 30분 동안 배양한 1.2마이크로리터를 포함하는 튜브로 이송하기 전에.두 번째 반응을 두 번 혼합합니다. 그리고 즉시 588 마이크로리터의 용액을 점프 희석 DMSO 제어 튜브에서 혼합과 함께 12 마이크로리터의 기판을 포함하는 튜브로 이송한다. 점프 희석 시험 화합물 튜브, 희석되지 않은 DMSO 제어 튜브 및 희석되지 않은 테스트 화합물 튜브에서 588 마이크로리터를 30초 간격으로 혼합하여 튜브당 기판 12마이크로리터를 각각 3개의 1.5밀리리터 튜브로 계속 이송합니다.그런 다음 반응을 담금질하고 NMR 스펙트럼을 수집하고 각 화합물에 대한 백분율 억제를 계산하기 전에 30 분 동안 기다립니다. 여기서 입증된 바와 같이 양성자 NMR을 이용한 초기 시험 화합물 분석에서 AgNH에 대한 2개의 화합물을 테스트한 결과가 나타난다. 효소 반응은 아데노신 싱글의 실종에 의해 가장 쉽게 관찰되고 정량화되며 각각 8.48 및 6.09 부품에서 이중 공명.그리고 30 분 제어 스펙트럼에서 관찰된 바와 같이 백만 당 8.33 부품에서 아데닌 싱글 레지던스의 출현. 이 그림에서, 양성자 NMR을 이용한 세제 카운터스크린 분석에서 AgNH에 대한 2개의 농도에서 화합물을 시험한 결과가 입증된 바와 같이 나타났다. 기판및 제품 신호의 강도에서 관찰된 효소 억제는 화합물 응집의 아티팩트가 아니라는 것을 나타내는 최소한의 차이만이 관찰된다.시험된 화합물및 세제에서 발생하는 공명은 기판 또는 제품 공명을 방해하지 않는다는 점에 유의하십시오. 양성자 NMR을 이용한 AGNH에 대한 점프 희석 분석에서 화합물을 테스트한 결과, 200마이크로몰라 반응에 비해 20마이크로몰라 반응에서 기판 신호의 강도가 감소되어 억제가 가역적임을 나타낸다. 각 반응을 개시하는 동안 및 점프 희석에 대한 완전한 샘플 혼합이 중요합니다.신중하고 일관된 포부와 분배가 필요합니다. NMR 기반 의 소법은 또한 반응 완충제 및 효소 대신 에 중단된 세포를 포함하는 용액을 사용하여 전체 세포에서 효소 활성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 우리의 항 trichomonal 약물 발견 노력은 리보 하이드로 라제 효소에 대한 새로 합성 된 화합물의 효능을 측정하기 위해 이러한 검사에 계속 의존하고 있습니다.비록 그것은 매우 소량에서 사용, 반응을 담금질 하는 데 사용 되는 염산은 위험 하 고 적절 한 개인 보호 장비와 함께 사용 해야 합니다.

nmr-based-activity-assays-for-determining-compound-inhibition-ic50

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

이 원고에서는 세균 전사를 표적으로 하는 항균제의 전사 및 억제 활성을 기능적으로 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

우리는 항 바이러스의 뉴 라미니다 제 억제제 클래스 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 감수성을 평가하는 표현형 형광 계 뉴 라미 억제 분석의 사용을 설명한다.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

변경된 뉴클레아제 활성은 바이오마커로서의 잠재력을 기점으로 다른 인간 조건과 연관되어 있다. 이 논문에 제시된 모듈식 및 구현 방법론은 뉴클레아제 활성을 질병의 바이오마커로 활용하기 위한 특정 핵산 프로브를 선택할 수 있게 한다.

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

SAMHD1은 인체 건강과 질병에 중요한 역할을 하는 디옥시뉴클레오시드 삼인산삼인산삼인산가수분해효소입니다. 여기에서는 SAMHD1 기질, 활성제 및 억제제로서 소분자 및 뉴클레오티드 유사체를 평가할 수 있는 384웰 마이크로플레이트 형식으로 배포된 다목적 효소 결합 SAMHD1 활성 분석을 제시합니다.

dNTPase SAMHD1과의 저분자 상호작용을 프로브하기 위한 고처리량 효소 결합 활성 분석

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

이 연구는 인실리코(in-silico ) 전략을 사용하여 Enumerated Etravirine이 HIV에 대한 유망한 치료제임을 확인했습니다. 분자 상호 작용 및 역학에 대한 우리의 발견은 가능한 HIV 치료 대안으로서 새로운 NNRTI의 합리적인 설계를 뒷받침합니다.

비뉴클레오티드 역전사효소 억제제의 정량적 구조-활성 관계, 활성 예측 및 분자 역학

학습하세요 NMR 기반 활성 반응을 통해 뉴클레오시드 리보하이드라제 억제제를 식별하고 특성화하는 방법을 배우세요. Trichomonas vaginalis 효소 표적화 및 항트리코모나스 신약 개발에 활용됩니다.

화합물 억제, IC₅₀ 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응

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