Name: 4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: 배우세요 4tU를 이용한 효모 Saccharomy cerevisiae의 신생 RNA 신속 정제법. 짧은 라벨링 시간과 낮은 배경으로 펄스-체이스 실험이 가능하며, RNA 합성 동역학 분석에 탁월합니다.

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이 작품은 JB [104648]에 웰컴 자금 에 의해 지원되었다. 세포 생물학을 위한 웰컴 센터에서 일은 Wellcome 코어 자금 조달 [092076]에 의해 지원됩니다. 저자들은 벨라 모들린, 에마누엘라 사니, 수잔나 드 루카스-아리아스, 샤이니 조지 등 연구실 구성원들의 도움을 인정한다. 저자는 또한 플라스미드 YEpEBI31111에대한 패트릭 크레이머에게 감사하고 싶습니다 .

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 문서는 매우 신속하고 특정 4tU 라벨링에 대한 프로토콜을 제시, 초기의 회복을위한, 라벨링의 작은 후 S. cerevisiae에서 새로 합성 된 RNA 15 s, 라벨이 없는 RNA에 의해 매우 낮은 오염.
사용자는 항상 차가운 온도와 DEPC 처리 된 시약을 사용하여 RNA의 무결성을 유지하기 위해주의를 기울여야합니다. 스트렙타비딘 비드 정제는 일반적으로 신뢰할 수 있다; 그러나 비드 버퍼는 처리하기가 어렵습니다. 그것은 그것의 구성 요소가 올바른 순서로 추가, 신선하게 만들어야하며, 냉장 또는 오토 클레이브하지. 일반적인 실패는 침전 단계 후에 불완전하게 용해되는 RNA를 포함하고, 그래서 처리 단계 도중 biotinylated 또는 그렇지 않으면 분실되지 않는. 보충 자료에는 광범위한 문제 해결 도움말이 있습니다.
ers4tU에서 알아야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이미 언급 한 것은 4tU효모의 성장이느려졌다는 것입니다(도 1a). 내인성 RNA 9를 제외하고,라벨링 기간 동안 전사 된 RNA 만이이 방법으로 정제 될 수 있습니다. 티올화 시간 내내 유전자에 일시 중지된 폴리머라제는 정제될 수 있는 티오화된 전사체를 생성하지 않지만, 티올화 동안 일시 중지된 상태로 들어가거나 떠나는 중합체로 인해 부분적으로 표지된 전사체는 회수될 수 있다. 돌연변이 또는 성장 조건 때문에 제대로 전사하는 균주는 다른 방법에 비해 nsRNA의 회복을 향상시킬 수 있지만 여기에 사용되는 기술은 거의 nsRNA를 생성하지 않습니다. 이러한 균주 및 조건에서 더 긴 시간 및 증가 된 배양 볼륨이 필요할 수 있습니다. 우라실은 질소의 좋은 소스이며, 그래서이 방법은 질소 기아와 관련된 연구에 사용되기 전에 시험되어야한다.
ers4tU 프로토콜은 수명이 짧은 RNA의 분석에 특히 유용하며, 그 중 상당수는 급격히 저하되어 분해 기계를 손상시키지 않고는 식별할 수 없습니다. 예로는 비밀불안정성 전사체(CUTs)4, 프로모터(PROMPTs) 19로부터의 조기 종단 또는 프로모터 근위정 일시중지 및안티센스 전사 "업스트림"에 의해 생성된 짧은 전사체를 포함한다. 안정한 RNA 종의 처리 도중 생성된 중간체는 또한 일시적이지만 ers4tU전사 4를 사용하여 풍부하게 될 수 있다. ers4tU 프로토콜은 그러므로 다른 방법에 비해 큰 이점인 가까운 생리적 조건 하에서 분석되고 포획되는 높게 과도한 RNA 종을 허용하는 예외적입니다. 이 기술은 정상20보다더 빨리 또는 느리게 길게 하는 RNA 폴리머라제 돌연변이체에서 전사 및 하류 RNA 처리 역학을 연구하는 데 사용되어 왔다.
Thiolation은 또한 RNA-seq 및 SLAM-seq21과호환되므로 매우 짧은 시간 내에 생성된 모든 RNA가 정교한 디테일을 특징으로 합니다.

RNA는 역동적인 성질을 가지고 있다; 생산 직후 많은 RNA가 빠르게 처리되고 저하됩니다. 현재, RNA 물질 대사의 대부분의 연구는 총 세포 RNA를 분석, 이는 주로 완전히 처리 및 정상 상태 수준에서. 이 수준은 전사, 전사 후 성숙 및 저하 속도 사이의 균형에 따라 달라집니다. 안정된 상태 평형으로 이끌어 내는 프로세스의 분석은 아주 단명한 RNA 종을 붙잡기 위하여 전문화한 기술이 필요합니다.
4-티우라실 (4tU) 또는 4-티오리딘 (4sU)과 같은 뉴클레오티드 유사체를 가진 RNA의 대사 라벨링 (우수한 검토를 위해 더피 등1 참조), 티오 라벨 된 초기 RNAs 및 처리 중간체를 분리하는 기능을 제공합니다. 그러나, 게시된 프로토콜은 많은 전사체의 생산 속도에 비해 느린 몇 분2,3의라벨링 시간을 포함한다. 평균 효모 유전자를 전사하는 데 1 분의 순서로 걸리므로 효모 RNA를 1 분 미만으로 표시하는 것은 매우 짧은 것으로 간주 될 수 있습니다. 매우 신속하고 특정한 4티우라실 프로토콜(ers4tU)은 4tU 통합을 최대화하고 라벨이 부착되지 않은 기존 RNA의 회수를 최소화하여 신호대 잡음 비를 최대화하여 라벨링 시간을 매우 짧게 만드는 4.
티오-변형염기는 새로 합성된 RNA(nsRNA)에 효율적으로 라벨을 붙일 수 있도록 세포 내로 신속하고 충분한 양을 수입해야 한다. 이를 촉진하기 위해, 세포는 우라실 프리 배지에서 성장하고, 적절한 파마이즈의 발현은 4tU 또는 4sU 섭취량을 증진시키는 데 도움이 된다(적절한 파마이즈 유전자 및 보충체 도1을 운반하는 플라스미드의 리스트에 대한 표 1 참조). 4tU의 수산화 나트륨 용해도는 다른 뉴클레오티드 유사체가 요구하는 독성 유기 용매의 필요성을 방지합니다. 불행히도, 50 μM 이상의 농도에서 티오 변형 뉴클레오시드를 가진 장기간 성장하는 배양은 리보솜5를방해하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 여기서 사용되는 농도(10 μM)는 매우 짧은 라벨링 시간, 해로운 효과를 최소화5(도1a),여전히 분석을 위한 충분한 RNA를 산출하면서.
이 기술은 표적 단백질6,7의 신속하고 특이적인 보조 매개 고갈과 결합될 수 있으며, "β-est AID 4U" 프로토콜로 지칭되며, 이 프로토콜은 β-estradiol 조절식이 있는 보조제의 유도성 다채기(AID) 시스템은 4tU 라벨링과 결합됩니다. β-est AID 4U 접근법을 사용하면 표적 단백질이 고갈될 수 있고 RNA대사에 미치는 영향이 면밀히 모니터링될 수 있다(그림 2). 타이밍은 매우 중요합니다. 함께 제공되는 비디오를 보고 그림 2와 애니메이션 된 양식에 주의를 기울이는 것이 좋습니다 (추가 그림 2참조).
정확한 시간 해결을 위해 RNA의 처리 및 분해를 매우 신속하게 중단해야 합니다. 이는 저온에서 메탄올을 사용하여 달성되며, 이는 세포 내용물들을 매우 빠르게 고정시키고 핵산함량을유지하면서 세포막을 저하시킵니다 8. RNA 추출은 효율적이어야 하며 RNA를 손상시키지 않아야 합니다. 기계적 인해는 chaotropic 에이전트의 부재에서 효과적입니다 (종종 이들은 티오 그룹을 포함하므로 피해야한다). RNA의 염화리튬 침전은 tRNA가 덜 효율적으로 침전되기 때문에 바람직하다. tRNA는 급속하게 전사되고 자연적으로thiolated 9, 그래서 제거 tRNAs는 생물 항성 시약에 대한 경쟁을 감소시킵니다. 작고 고도로 구조화 된 RNA가 관심이있는 경우 알코올 기반 RNA 침전 방법이 권장됩니다.
티오레이트 RNA를 회수하기 위해, 비오틴은 4tU를 가진 RNA내로 통합된 티오기를 통해 공유적으로 부착된다. 클레블 이황화물 결합을 통해 부착되는 변형 된 비오틴 (예를 들어, HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)h엑실]-3 ́-(2́-p yridyldithio)propionamide, 또는 MTS-비오틴(메탄 티오불폰)을 사용하는 것이 좋습니다. 환원제를 첨가하여 RNA의 방출을 허용한다. 생체별화된 RNA는 자기 구슬에 결합된 스트렙타비딘상에서 화합성을 정제한다. 이 프로토콜은 이전에나열된 다른 프로토콜과 유사하지만 배경을 줄이기 위해 집중적으로 최적화되었습니다.
수행 될 수있는 티올 라벨링 실험의 두 가지 유형이 있습니다, 연속 및 불연속 라벨링. 각각은 자신의 장점이 있습니다. 연속 라벨링에서 4tU는 일정한 간격으로 채취한 배양 및 샘플에 첨가된다. 실험의 이 모형은 RNA가 처리되는 방법 및 수준이 시간이 지남에 따라 어떻게 변화하는지 보여줍니다. 예로는 야생형 실험및 펄스체이스 실험과 돌연변이의 비교가 있다. 도 3b,c에 도시된 실험은 이러한 유형이다. 불연속 라벨링의 경우 변경이 시스템 내로 유도되고 RNA가 모니터링됩니다. 변경이 유도되면 배양은 여러 하위 문화로 분할되어야하며 특정 시간에 각 문화는 짧은 기간 동안 티오 라벨로 표시됩니다. 일예는 도 27에도시된 β-est AID 4U이다. 이러한 유형의 실험은 RNA 처리에 대한 대사 변화의 효과를 모니터링하는 데 특히 유용합니다(도 3d참조).
티오 라벨링 실험의 그래픽 표현은 그림 4 및 그림5에 표시되며 프로토콜의 성능을 크게 단순화하는 스프레드시트를 사용할 수 있습니다(4tU 실험 template.xlsx참조). 이뿐만 아니라 추가 정보에는 광범위한 문제 해결 가이드가 포함되어 있습니다. 4tU 라벨링을 auxin 고갈 프로토콜과 통합하는 β-est AID 4U 프로토콜의 경우 그림 2 및 보충 그림2를 참조하십시오. 자세한 AID 고갈 프로토콜은 Barrass 외 7을 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올 (&beta; ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>주의 독성. 원액은 약 14M이며,</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td> <<td>사용을</td></tr> 위해 <<tr><td></td><td></td><td></td><td>sup>>1<<><>>/20 희석액으로 만듭니다. 그런 다음 오토 클레이브</td></tr><tr><td>DMF (N, N- 디메틸 포름 아미드)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>주의 독성</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>수산화나트륨 에탄올로 0.5M 및 pH를 8.0으로 만들기</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP Biotin</td><td>Thermo scientific</td><td>21341</td><td>빛으로부터 보호하여 보관하십시오. 모든 바이알 내용물을 22.7mL DMF에 용해시킵니다(4mM 원액 만들기). 물에서 멀리 떨어진 곳, 어두운 곳에서 & -20 &deg;C. HPDP의 일부 배치가 저장에 침전되므로 사용하기 전에 용액을 확인하십시오. 42 &deg에서 가열; C를 사용하여 다시 중단합니다.</td></tr><tr><td>글루코스</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 [20 mg/mL]</td><td>시그마-알드리치</td><td>10901393001</td><td>-20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>고정 TCEP 이황화 환원 겔</td><td>Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>옵션</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 M 용액. 주의: 이것은 용해되고 100 oC 이상에서 끓을 수 있기 때문에 매우 뜨거워지며 LiCl 결정을 물에 천천히 첨가하십시오.</td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1M 용액. 주의: 이것은 용해되고 100 oC 이상에서 끓을 수 있기 때문에 매우 뜨거워지며 MgCl2 결정을 물에 천천히 첨가합니다.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>주의 독성 및 인화성</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>각각을 1M 용액으로 만들고 동일한 양으로 혼합하여 적절한 pH</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>5 M 용액</td></tr><tr><td>페놀, 낮은 pH.&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>4°C의 어둠 속에 보관하십시오. 주의 독성</td></tr><tr><td>페놀 클로로포름 5:1 (125:24:1) 낮은 pH.&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>4°C의 어둠 속에 보관하십시오. 주의 독성</td></tr><tr><td>피어스 스핀 컬럼</td><td>Thermo Scientific</td><td>69702</td><td>선택적</td></tr><tr><td>SCSM 단일 드롭아웃 &ndash; 우라</td><td>포미디엄&nbsp;</td><td></td><td></td>DSCS101</tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>아세트산</td></tr> 수산화<tr><td>나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>주의 부식성</td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>주의 자극성,</td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic beads</td><td>NEB</td><td>1420S</td>를 흡입하지 마십시오.<td> 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERase-In, RNase 억제제</td><td>생명 기술&nbsp;</td><td>AM2696</td><td>-20°C에서 보관; </td></tr><tr><td>C 스파이크에 대한 티올화 Schizosaccharomyces pombe</td> 프로토콜 4-thiouracil (4tU)<td>의 섹션 1.7 참조</td>&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>아크로스 오가닉스</td><td>359930010</td><td>어둠 속에 보관합니다. 1M NaOH로 100mM 재고를 만들고 -20°C에서 솔루션을 저장합니다.</td></tr>다양한 pH tRNA<tr>에서 <td>트리스 염기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>1M 용액</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5mg/ml, -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>U3750</td><td>H2O에서 1M 용액을 만듭니다. 2mL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>아미노산이 없는 효모 질소 베이스&nbsp; 황산 아모늄</td> 함유 <td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 컬럼 0.5ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>4°C에서 보관; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>지르코니아 비드</td><td>Thistle Scientific</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td><td>다른 균질화제를 사용할 수 있습니다. 각 균질화제 및 균주에 대한 올바른 조건을 설정해야 합니다.</td></tr><tr><td>RNA 품질을 평가하기 위한 Bioanalyser(Agilent) 또는 이와 유사한 장치. 이것이 중요하지 않은 경우 분광 광도계가 RNA를 정량화하는 데 유용합니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기: 4°C에서 배양물을 회전시킬 수 있음; C 및 최소 3000g. 가능하면 미리 식히십시오.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기: 최대 13,000 g에서 최대 1000 g까지의 가변 속도로 최대 2 mL 튜브를 회전시킬 수 있음;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>샘플에서 비드를 분리하기 위한 마그네틱 랙. 논문에 사용된 것은 3D 프린팅으로 Thingiverse(thing:3562952)에서 구할 수 있습니다. 상업적으로 사용 가능한 랙이 존재합니다&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>어둠 속에서 배양할 수 있는 가열된 뚜껑이 있는 PCR 기계.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브를 끝에서 끝까지 회전시키는 회전 휠&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흔드는 가열 블록(예: Eppendorf Thermomixer)을 권장합니다&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜브, 원심분리기, 저유지, RNase free 0.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>Tubes, 원심분리기, 저유지, RNase free 1.5mL</td><td>Ambion</td><td>AM12350</td><td></td></tr><tr><td>Tubes, 원심분리기, 50 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>다른 원심분리기 튜브는 가스 방지가 아니므로 CO2가 메탄올에 용해됩니다. 이것은 따뜻한 배양을 추가하면서 용액에서 격렬하게 나옵니다. 이로 인해 샘플 손실이 발생합니다</td></tr><tr><td>. 튜브, 원심분리기, 15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>튜브, 2 mL, 나사 캡</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>튜브 0.2 mL, 8개/스트립, 일체형 뚜껑 포함,</td><td>브랜드</td><td>781332</td><td></td></tr></tbody></table>

4-티우라실(ers4tu)을 가진 생체내 rna의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

뉴클레오티드 유사체, 4-티우라실 (4tU)은 세포에 의해 쉽게 채택되고생체 내에서 전사될 때 RNA에 통합되어 짧은 기간 동안 생산된 RNA를 분리할 수 있습니다. 이는 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 통합된 티오기와 친화도 정화에 비오틴 모이어티를 부착함으로써 수행된다. 기존 RNA가 없는 순수하고 새로 합성된 RNA의 좋은 수율을 달성하면 라벨링 시간이 단축되고 운동 연구에서 시간적 분해능이 증가합니다. 이것은 새로 합성된 RNA의 매우 특이하고 높은 수율 정제를 위한 프로토콜이다. 여기에 제시된 프로토콜은 효모 사카로마이세스 세레비시아에서 RNA가 어떻게 추출되는지 설명합니다. 그러나, 총 RNA로부터 티오레이트 RNA의 정제를 위한 프로토콜은 일단 세포로부터 추출되면 임의의 유기체로부터 RNA를 사용하여 효과적이어야 한다. 정제된 RNA는 역전사-qPCR, RNA-seq 및 SLAM-seq와 같은 많은 널리 사용되는 기술에 의한 분석에 적합하다. 이 기술의 특이성, 감도 및 유연성은 RNA 대사에 대한 비교할 수없는 통찰력을 허용합니다.

이러한 ers4tU 프로토콜을 사용하여 회수된 nsRNA에 대한 전형적인 수율은 도 1b에표시되며, 이것은 바이오분석자에 의해 생성되었으며, 트레이스는 RNA 대 크기(뉴클레오티드[nt])의 수율을 나타낸다. 참고, 바이오 분석기 추적 및 삽입 그래프 모두에서, 시간 포인트 0에서 RNA 복구는 더 긴 시간 포인트에서 복구 의 매우 작은 부분 - 약 0.3 RNA의 약 0.3 μg는 약에서 복구 109 세포보다 두 배 이상 동일한 수의 세포로부터 단지 30s의 라벨링(0.8 μg의 nsRNA)을 채진하였다. 15 s에서의 RNA 회복은 샘플링을 수행하는 작은 차이가 RNA 회복에 비례적으로 더 큰 영향을 미치기 때문에 더 가변적이다. 바이오 분석기 추적에서 rRNA 전구체는 1000 nt 근처의 피크와 1700-1800 nt에서 피크의 두 배로 볼 수 있습니다. 이러한 중간체의 풍부는 티올레이션이 계속됨에 따라 증가합니다.
티오 라벨링은 ACT1 전사체의 접합을 정량화하는데 사용되었다(도 3). 티올레이션을 수행하고 모니터링된 ACT1 RNA의 처리 및 티오 라벨링의 시작으로부터 15 s 간격으로 채취한 샘플(도3a,b). 알 수 있듯이, pre-mRNA는 (전사에 의해) 생성되고, lariats (pre-mRNA로부터 접합의 첫 번째 단계에 의해), 심지어 단지 15 초의 라벨링 후에도 생성된다. 약 45 s 내지 1 분 후에, lariats 및 pre-mRNA의 양은 접합에 의해 멀리 처리되는 것과 같이 전사에 의해 생성되는 이 RNA 종의 많은 것과 평형에 도달합니다.
도 3c에 나타낸 데이터를 생성하기 위해 스트레인을 25s에 대해 4tU로 펄스한 다음 우리딘으로 쫓아냈다. 전 mRNA 및 lariats의 생성은 1 분에서 최대에 도달합니다. 이는 그림 3b와잘 비교됩니다. 평형에 도달하기 위해 45 s 후에 달성되는 최대 값과 라벨링의 25 s. 피크 후, 티오 라벨 RNA는 접합 과정을 통해 쫓아로 수준이 감소.
도 3d는 β-est AID 4U 시스템6,7을사용하여 단백질 접합 인자의 고갈 및 RNA 대사에 미치는 영향을 나타낸다. 여기에서, Prp16p는 고갈의 25 분 후에 이 수준의 5%에 가까운 생리적인 수준에서 감소됩니다. Prp16p는 접합15의두 번째 단계에 필수적인 접합 요소입니다. Lariats 접합의 두 번째 단계 동안 제거 (그림3a),하지만 여기 Prp16 제한 되 면 그들은 사전 mRNA의 수준 이상으로 증가. 나중에 고갈 시간에, 그밖 요인은 이차 효력 때문에 제한되고, 그래서 lariat의 수준이 감소하고, pre-mRNA 수준 상승. 접합 된 mRNA의 수준은 감소합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> 그림 1: 4tU 및 RNA 회복의 성장. (a) 4-티우라실이 성장에 영향을 미칩니다. 우라실 없이 YMM 드롭아웃 성장 배지에서 4tU의 농도를 증가시키면 p4FuiΔPEST 플라스미드를 운반하는 S. 세레비시아(BY4741)의 배가 증가한다. 테칸 인피니트 프로 200에서 30°C에서 4개의 복제 배양물의 성장을 모니터링하였다. 모든 문화는 전체로그 단계에 있었으며 OD600은 0.1에서 0.6 사이였습니다. 모의 객체는 NaOH가 추가된 동등한 양을 가진 제어 문화권이며, 그 자체로 성장률을 변경하지는 않습니다. 이 그래프는 티오 라벨링이 빠른 라벨링과 세포 손상 사이의 타협임을 보여줍니다. 오류 막대는 4개의 복제본의 표준 오류입니다. (b) nsRNA 수율은 약 15초의 라벨링으로부터 선형으로 증가한다. 주요 도면은 15 s 간격으로 4tU를 첨가한 후 0(티오레이트되지 않음)에서 2분까지 정제된 nsRNA의 생체분석기 흔적을 나타낸다. 15s 샘플은 레이블이 지정되지 않은 샘플과 구별할 수 있으므로 표시되지 않습니다. 두 개의 큰 피크는 리보소말 RNA(rRNA)에 해당합니다. rRNA 전구체 및 중간체는 성숙한 rRNAs 보다는 더 중대한 분자량에 몇몇 봉우리로 보입니다. 이러한 전구체 및 중간체의 회복은 시간이 지남에 따라 증가합니다. 하나의 대표적인 실험의 결과가 도시되어 있다. 인세트 그래프는 4tU를 가진 증가인 배양과 nsRNA의 회복을 나타낸다. nsRNA의 수율은 4tU로 성장의 증가 시간으로 증가합니다. 이 실험의 기간 동안 복구는 현저하게 선형(R2 = 0.934)이며 바이오분석기에서 눈으로 표기되지 않은 시료와 구별할 수 없더라도 4tU로 라벨링된 15s에서도 배경에 비해 약간 증가하는 것을 보여줍니다. 추적. 오류 막대는 세 가지 생물학적 복제에 대한 표준 오류를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> 도 2: β-est AID 4U β-est AID 4U 그래픽 프로토콜. β-est AID 4U 프로토콜의 프로토콜에 대한 그래픽 요약. β-estradiol(β-est)은 보조*태그가 지정된 표적 단백질을 고갈시키는 보조인 유도성 투성(AID) 시스템의 발현을 촉진하며, 자세한 프로토콜은 Barrass et al. 7을 참조하십시오. 이 경우, 탈지 계 발현은 단백질 분해가 시작되기 25분 전에 시작되고 각 시점에서 티올레이션은 1분 동안 이다. 애니메이션 된 버전은 추가 그림2에 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> 그림 3: ACT1 RNA 접합의 전구체 및 중간체. ACT1 프리-mRNA 전사체의 접합은 정량적 역전사 PCR16에의해 모니터링되었다. ACT1 전구체(pre-mRNA), 중간 lariat-exon2(Lariat) 및 접합 생성물(mRNA)의 수준은 ACT1 Exon2 수준 및 이러한 RNA의 정상 상태 수준에 대해 정규화된 것으로 나타났다. (a) ACT1 성적증명서에 qPCR 제품의 위치. ACT1 전사체 16의 접합 반응의 전구체, 중간체 및 제품의 수준을 분석하는 데 사용되는 qPCR 제품의위치의 회로도. 엑손은 상자, 인트론을 라인으로, qPCR 제품은 양쪽 끝에 다이아몬드가 있는 선으로 표시되며, 색상은 그래프에 사용된 것과 일치합니다. pre-mRNA PCR은 이 제품이 접합의 첫 번째 단계 후에 중단되는 분기점을 가로지르기 때문에 접합의 중간체가 아닌 사전 mRNA에 특이적입니다. Lariat PCR은 접합의 첫 번째 단계의 생성물 및 두 번째 후 생산된 절제된 라리야를 검출합니다. mRNA PCR은 접합, mRNA의 생성물특정이다. 엑시온 PCR의 결과(절제된 라리를 제외한 모든 전구체, 중간체 및 제품에 존재함)는 데이터를 정규화하는 데 사용되었기 때문에 그래프에 나타나지 않으므로 항상 1과 동일합니다. (b) 연속 티오라벨링. 4tU가 전사에 의해 통합됨에 따라 사전 mRNA의 양은 시간이 지남에 따라 증가하고, 짧은 지연 후, 접합은 이를 lariat-exon2 중간 및 접합 된 제품으로 변환합니다. 이 pre-mRNA 와 lariat 종의 수준은 4tU를 가진 성장의 작은 15 s 후에 배경 위에 검출되고 4tU를 가진 연속적인 라벨링의 대략 45 s 후에 최대에 도달하고, 이 시점에서 그들의 생산은 접합된 변환에 의해 균형을 입니다 mRNA 및/또는 저하. 값은 정상 상태(그래프의 왼쪽 부분)로 정규화되고, exon 2 레벨은 엑온 2의 전사와 비교하여 모양과 처리를 표시합니다. ACT1의 RNA 접합은 크게 공동 전사4,17 접합 mRNA가 급속하게 가장 풍부한 종으로, 그 수준은 엑소온 2의 그것과 유사하다. 3개의 생물학적 복제물의 표준 오차, 각각삼중으로 분석. (c) 펄스 / 체이스. 25초의 티올레이션 펄스와 우리딘의 추격. 이러한 RNA(가장 왼쪽 지점)의 정상 상태 수준에 비해 처음에는 새로 합성된 풀에서 매우 풍부합니다. 그들은 mRNA로 처리 될 때 수준은 점차적으로 감소 (또는 저하), 에 의해 정상 상태 수준과 매우 유사한 수준에 접근 5 분. 세 생물학적 복제의 표준 오류, 각각 삼중 분석. (d) nsRNA 및 단백질 고갈. 도2에 기재된 바와 같이 프론 데그론 시스템을 이용하여 Prp16 단백질이 고갈된 후 패널(a)에서와 같이 정량적 역전사 PCR에 의해 모니터링된 ACT1 프리-mRNA 전사체의 스플릭. Prp16 단백질 수준은 또한 보조고갈 전에 레벨의 백분율로 제2 Y축에 대하여 플롯된 그래프에 표시됩니다. Prp16은 스플리세오좀의 중요한 구성 요소이며, 특히 패널(a)에 도시된접합의 제2 단계에 특히 중요하며, 그 후 라리에이트가 분해된다. 이 단계가 제한되면 lariats는 처음에 축적. 나중에 점합이 완전히 실패하면 lariats가 더 이상 생산되지 않고 mRNA 이전 수준이 상승합니다. 오차 바는 3개의 생물학적 복제물의 표준 오차이며, 각각 삼중으로 분석된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> 그림 4: 프로토콜 섹션 1에서 3까지의 그래픽 요약. 세포는 4tU로 티오레이되고 RNA내로 변형된 뉴클레오티드를 통합하도록 성장하도록 허용된다. 시간 포인트와 실험에 걸쳐 정규화를 허용하기 위해 thiolated S. pombe 스파이크를 추가할 수 있습니다. 4tU의 펄스는 비티오레이식 소변을 사용하여 추격할 수 있다. 라벨링은 4tU 첨가또는 성장 조건에 대한 변화로부터 연속으로 수행될 수 있으며, 배양 스플릿 및 4tU는 성장 조건 변화로부터 증가하는 시간에 배양에 첨가되지만, 각각의 라벨링은 단지 짧은 시간 동안에만 수행될 수 있다. 상기 세포는 세포로부터 제조된 RNA, 바람직하게는 균질화 및 페놀 계 방법을 사용하여 제조된다. RNA는 크기 배제 컬럼을 사용하여 통합되지 않은 비오틴으로부터 정제된 생체티니틸화된 RNA를 생체화한 후 정제한다. nsRNA는 이제 스트렙타비딘 비드로 정제할 준비가 되었습니다(섹션 4, 그림5). 빨간색 숫자는 프로토콜의 단계 번호와 일치합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> 그림 5: 프로토콜 섹션 4의 그래픽 요약. 섹션 1에서 3(그림4)에 따라, 스트렙타비딘 비드가 차단되고 생체 화된 RNA 샘플을 준비된 구슬에 첨가한다. 생체용 RNA는 스트렙타비딘 구슬과 비생체화된 RNA를 제거하고 세척합니다. 생체티니화된 RNA는 βME를 사용하여 구슬로부터 용출되고 추가 연구를 위해 준비되었다. 빨간색 숫자는 프로토콜의 단계 번호와 일치합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 티오 라벨링의 1 및 3 분에서 수입의 추가 사본이 있는 유무에 관계없이 효모 세포에서 nsRNA 회복의개선. Fui1은 2 μm 플라스미드에서 발현된 효모자체 프로모터입니다. 이 유전자의 게놈 사본은 이 긴장의 둘 다에서 나타나. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 도 2: β-est AID 4U β-est AID 4U 그래픽 프로토콜의 애니메이션 버전. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 4tU_experiment_template.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>플라스미드 이름</td>
			<td>수입/파마이즈</td>
			<td>마커</td>
			<td>코멘트</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. 세레비시아에 후이1</td>
			<td>우라3</td>
			<td rowspan="2">Fui1은 우라실과 우리딘을 수입하여 펄스/체이스 실험에 이상적입니다.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. 세레비시아에 후이1</td>
			<td>류22</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
S. 세레비시아에 후이1</td>
			<td>우라3</td>
			<td>Fui1의 PEST 모티프는 비활성화되었습니다, 그래서 세포의 요구에 충분한 세포 내 우라실이있을 때 permease가 저하되지 않습니다. 라벨링 실험에서 잘 작동하며 펄스/체이스 성능을 향상시킵니다.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. 세레비시아에 Fur4</td>
			<td>우라3</td>
			<td>우라실 파마이즈</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">예페비311</td>
			<td>H. 사피엔스 ENT1</td>
			<td rowspan="2">류22</td>
			<td rowspan="2">밀러 외.11. 또한 HSV 티미딘 키나아제 유전자를 함유하고 있습니다.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(평형 뉴클레오시드 수송기)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">모든 플라스미드는 2 μm 기초입니다. 모든 p4 플라스미드 및 pAT는 pRS16 시리즈 플라스미드를 기반으로 합니다. FUI1 및 FUR4는 내인성 프로모터로부터 표현됩니다.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 이 프로토콜과 함께 사용되는 플라스미드.

효모 사카로미세세스 세레비시아에서새로 전사된 RNA를 민감하게 그리고 구체적으로 정화하기 위해 티오레이드 우라실을 사용한다.

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

이 방법은 다른 프로토콜이 이러한 짧은 시간 규모로 새로 합성된 RNA를 분석할 수 없고, 이러한 짧은 펄스를 가진 펄스 추적 실험을 허용하지 못하기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 Best AID 4U 프로토콜과 같은 단백질 고갈과 잘 작동합니다. 주요 장점은 배경이 낮다는 것입니다.이것은 거의 모든 비티오탈RNA를 제거해서 짧은 라벨링 시간을 허용합니다. 또한 작성된 프로토콜은 수행 될 수있는 많은 다른 유형의 실험과 이 기술에 통합하는 방법에 대해서도 자세히 설명합니다. 이 절차를 시작하려면 YMM 중간에서 효모를 0.6에서 0.8 사이의 OD 600으로 성장시다.연기 후드에 의도한 시료 부피의 30~50%에 해당하는 메탄올을 50밀리리터 튜브에 추가합니다. 튜브를 단단히 닫고 라벨을 붙인 다음 건조한 얼음위에 놓아 차갑게 식힙니다. 다음으로, 샘플의 장기 저장을 위해 2 밀리리터 튜브를 라벨과 얼음에 배치하여 식힙니다.지르코니아 구슬을 두 밀리리터 튜브에 넣습니다. 얼음에 샘플 당 물 적어도 1 밀리리터를 냉각. S.pombe 스파이크를 배양에 추가하려면 얼음 위에 thiolated S.pombe 세포의 알리쿼트를 놓아 해동하십시오.해동 된 알리 쿼트 소용돌이와 문화에 추가. 그런 다음 배양에 4tU를 첨가하여 10 마이크로몰라의 농도를 적극적으로 섞는다. 15초에서 5분 사이의 시간 동안 티오 라벨을 표시합니다.시간 과정이 끝날 때까지 일정한 간격으로 배양 샘플을 채취합니다. 각 샘플을 메탄올이 함유된 준비된 원심분리기 튜브 중 하나에 추가합니다. 각 튜브를 밀봉하고, 흔들어서 철저히 섞고, 드라이 아이스에 놓습니다.모든 샘플을 채취하면 모든 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 샘플중 어느 것도 동결되지 않았는지 확인합니다. 얼어 붙은 경우, 끊임없이 반전하면서 손에 부드럽게 데우십시오.세포를 3, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 원심분리하여 세포를 펠릿합니다. 액체를 붓고, 힘차게 위아래로 파이프를 통해 적어도 1 밀리리터의 얼음 차가운 물에 펠릿을 다시 놓습니다. 서스펜션을 준비된 나사 캡 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.원심분리기는 세포를 다시 펠릿하기 위해 13, 000배 g이상의 속도로 샘플을 간략하게 분리합니다. 그런 다음 얼음에 다시 놓고 액체를 제거합니다. 먼저 AE 버퍼 400마이크로리터, SDS 마이크로리터 40개, 페놀 800마이크로리터를 낮은 pH에 추가합니다.10초 동안 소용돌이를 통해 다시 중단합니다. 그런 다음 가장 낮은 전력 설정에서 3 2 분 버스트에 대한 균질화에서 세포를 lyse. 균질화 펄스 사이에 2 분 동안 얼음에 샘플을 둡니다.용해 된 세포를 건조 얼음에 5 분간 놓고 고화시때까지 놓습니다. 다음으로, 마이크로센트심분리기를 사용하여 실온에서 5분 동안 13배, 000배 g 이상의 속도로 세포를 회전시킵니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 페놀 클로로폼 추출 및 클로로폼 추출을 수행합니다.10 개의 어금니 리튬 염화물의 부피의 1/3 에서 1/2 사이를 추가하고 RNA를 침전시키기 위해 혼합합니다. 원심 분리기는 5분 동안 13배, 000배 이상의 속도로. 액체를 제거하고 샘플을 잠시 다시 회전하여 찌꺼기를 제거합니다.그런 다음 펠릿을 70%에탄올의 300~500마이크로리터로 세척합니다. 씻은 펠릿을 원심분리하고 남은 에탄올을 제거합니다. 흔들리는 동안 섭씨 65도에서 가열하여 pH 7.0에서 90 마이크로 리터의 RNA 펠릿을 다시 용해하십시오.전체 RNA 용해화를 확인한 후 서스펜션을 0.2 밀리리터 튜브로 이송합니다. 우선, RNA에 HPDP-비오틴 용액 10마이크로리터를 첨가하여 생체화하고 철저히 혼합합니다. 15~30분 동안 65도의 어둠 속에서 배양하세요.다음으로, 작은 수지 볼륨, 크기 배제 열을 준비하여 비법인 비오틴을 제외한다. 컬럼의 아래쪽 태그를 제거하고 캡을 풀고 컬럼을 2밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 1, 500회 g의 원심분리기는 버퍼를 플러시하고 흐름을 폐기합니다.그런 다음 부드럽게 0.3 밀리리터의 TE를 열 상단에 넣고 동일한 조건을 사용하여 다시 회전합니다. 세척된 컬럼을 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨냅니다. 샘플 인큐베이션이 완료되면 컬럼 맨 위에 샘플을 추가합니다.원심분리기는 2분 동안 1, 500배 g로, 생체화 RNA 샘플을 튜브 바닥에 남깁니다. 열을 삭제합니다. 그리고 10 개의 어금니 리튬염화물의 1/3 ~ 1/2 부피를 샘플을 포함하는 튜브에 추가합니다.혼합하여 RNA를 다시 침전시합니다. 먼저, DEPC 처리수 의 200 마이크로리터에서 RNA를 재용이한다. RNA 농도를 측정하고, 모든 샘플에 대해 동일한 양의 RNA를 제공하는 각 샘플에 대한 부피를 계산합니다.이 양의 RNA를 신선한 튜브에 추가하고 DEPC 처리된 물을 총 200마이크로리터까지 다시 추가합니다. 샘플이 실온에 있을 때, 10 x NaTM 완충제의 25 마이크로리터, 1개의 어금니 나트륨 인산염의 25 마이크로리터 및 10% SDS의 2.5 마이크로리터를 추가합니다. 30초 이내에 약 100배 g에서 원심분리기를 부드럽게 섞습니다.1개의 x NaTM 버퍼, 0.1 어금량 나트륨 인산염 및 0.1% SDS를 가진 각 견본을 위한 비드 버퍼의 2밀리리터를 준비합니다. 50 마이크로리터의 스트렙타비딘 구슬을 낮은 보존 1.5 밀리리터 튜브에 추가합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 구슬이 정착할 때까지 기다립니다.그런 다음, 포부에 의해 유체를 제거합니다. 구슬을 씻으려면 비드 펠릿이 완전히 재주질될 때까지 200 밀리리터의 비드 버퍼와 소용돌이를 추가하십시오. 튜브를 약 100배 g에서 최대 5초 동안 원심분리합니다.구슬을 자석에 의해 캡처 할 수 있도록 자기 랙에 튜브를 배치합니다. 적은 수의 샘플이 있는 경우 흡인으로 유체를 제거합니다. 많은 샘플이있는 경우 액체를 부어 다음 흡인.200 마이크로리터의 비드 버퍼, 글리코겐 10마이크로리터, tRNA 2.5 마이크로리터로 블록하십시오. 적당한 속도로 끝을 회전시키면서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유체를 제거하고 다시 세척합니다.샘플에서 구슬을 다시 중단하고 회전하는 동안 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 이 인큐베이션 동안 각 샘플에 대해 신선한 1.5 밀리리터 튜브를 준비하십시오. pH 5.3 및 20 마이크로그램의 글리코겐에 3개의 어금니 나트륨 아세테이트1/10 부피를 추가합니다.3초 동안 약 100배 g의 원심분리기. 구슬에서 언바운드 RNA를 제거하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세척합니다. RNA를 엘로우기 위하여는, 구슬에 새로 준비된 0.7 어금다 베타 mercaptoethanol의 50 마이크로리터를 추가합니다.소용돌이와 원심분리 후 슬러리를 자기 랙에 놓습니다. 제조된 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브내용액을 함유하는 RNA 파이펫. 앞서 설명한 대로 다시 한 번 엘루트.이어서, 샘플을 자기 랙에 다시 배치하여 용출된 RNA로부터 잔류 구슬을 제거하고 유체를 신선하고 낮은 결합 0.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송한다. 샘플을 섞는다. 그리고 nsRNA를 침전시키기 위해 2.5권의 에탄올을 추가합니다.혼합 및 인큐베이팅 후 원심분리기는 최소 13, 000배, 섭씨 4도에서 20분 동안. 이 프로토콜을 사용하여 복구된 snRNA에 대한 일반적인 수율은 여기에 나와 있습니다. 시간 점 0에서 RNA 복구는 약 300억 개의 세포에서 회수되는 RNA의 단지 0.3 마이크로그램으로 더 긴 시간 지점에서 복구된 그 중 아주 작은 부분입니다.라벨링의 단지 30 초 후에, 그러나, 2배 이상의 RNA는 세포의 동일 수에서 집합됩니다. 생체 분석기 추적에서, 우리의 RNA 전구체는 1, 000 뉴클레오티드 및 1, 700 에서 1, 800 뉴클레오티드에서 피크의 이중에 가까운 피크로 볼 수 있습니다. 이러한 중급제의 풍부는 티올레이션이 계속됨에 따라 증가합니다.티올레이션은 티오 라벨링의 시작과 ACT1 RNA 전사체의 처리로부터 15초 간격으로 채취되는 시료로 수행된다. 사전 mRNA와 후유리는 라벨링의 단지 15 초 후에 생성되는 것을 볼 수 있습니다. 약 45초에서 1분 정도 후에, 후유자와 전mRNA의 양은 접합에 의해 멀리 처리되는 바와 같이 전사에 의해 생성되는 이들 RNA 종의 많은 평형에 도달한다.가장 어려운 단계는 구슬, 세척 및 차단과 관련된 단계입니다. 구슬을 잃지 않도록 주의하거나 건조하게하십시오. 새로 합성된 RNA를 정제하면 기존의 RNA 분석 절차를 사용할 수 있습니다.생체 분석기 또는 이와 유사한 RNA를 실행하는 것이 좋습니다. 그 후, 우리는 일반적으로 Rna를 분석하기 위해 QPCR 및 RNA-Seq를 사용합니다. 이 방법은 RNA 처리의 역학을 분석하기 에 이상적이었다.가장 위험한 단계는 RNA 추출에서 페놀과 클로로포형을 사용하는 단계입니다. 밀봉되지 않은 용기에 이러한 화학 물질을 사용할 때마다 연기 후드로 사용하며 적절한 보호 복, 실험실 코트 및 장갑을 착용하십시오. 스크류 캡 튜브의 실에 지르코니아 구슬이 없다는 것을 주의하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

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바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

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RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

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Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화)

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