Name: DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 학습하세요 혜성 분석에서 냉동 조직을 사용하여 DNA 손상을 평가하는 방법을. 냉동 큐브 조직 기법은 숙련된 인력 없이도 기술적 오류와 기계적 DNA 손상을 최소화하여 전임상 약물 개발 및 환경 안전성 평가에 효과적으로 활용됩니다.

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저자는 링컨 마틴과 켈리 오웬스에게 혜성 슬라이드를 준비하고 채점하는 전문 기술 지원을 위해 빚을 지고 있으며, 캐롤 스와츠 박사는 통계 분석을 수행합니다. 저자는 또한 ILS에 있는 유전 독물학, 조사 독물학 및 necropsy 프로그램의 일원의 지원 기여를 인정합니다.

조직은 좋은 실험실 연습 규정 (21 CFR 파트 58)과 기관 동물에 의해 승인 된 동물 사용 프로토콜에 따라 NTP 계약 실험실에서 AAALAC 공인 시설에서 수행 된 연구의 수행 중에 수확되었다 각 실험실에서 관리 및 사용 위원회 (IACUC).
1. 조직 수확 및 가공
참고: 중복 샘플 튜브(예를 들어, 간)를 준비하거나 샘플의 약 절반을 다른 저장 튜브(예: 십이지장, 위)로 옮겨 재분석을 가능하게 하는 것이 유용하다. 장 부 조직에 대한 잠재적 인 샘플 간 가변성을 최소화하기 위해 각 동물에 대한 위장에 비해 조직의 동일한 영역을 샘플링하고 샘플을 나누어 중복 샘플을 생성하는 것이 좋습니다. 플라스틱 집게는 두뇌와 같은 끈적끈적한 조직을 옮기는 것을 추천합니다. 옵션으로서, 다진, 긁힌 또는 균질화된 조직 제제는 원점 관에 부착된 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 균질한 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 여과될 수 있다.
<ol><li>관심 있는 장기에서 연결된 연결 조직, 장기 및 이물질을 제거하십시오. 제거 직후, ~ 7 mL의 차갑게 준비된 다진 용액 (Mg++, Ca++ 및 페놀 적색 행크의 균형 잡힌 소금 용액, 10 % v / v DMSO 및 20 mM EDTA pH 7.5)을 함유 한 중간 크기의 계량 보트에서 장기를 힘차게 휘젓고 잔여 혈액과 이물질을 제거하십시오.</li>
	<li>각 장기를 충분한 (~7 mL) 차가운 다진 용액을 함유한 다른 깨끗한 계량 보트로 옮기고, 추가 처리가 될 때까지 얼음위에 침수된 조직을 유지합니다.</li>
	<li>관심있는 각 기관의 섹션을 제거하고 포함 카세트에 놓습니다. 10% 중성 완충 포르말린, 트림 및 파라핀을 향후 조직 병리학 평가를 위한 실험실의 표준 절차에 따라 수정하십시오.</li>
	<li>간장의 경우 왼쪽 엽의 5mm 세로 부분을 자르고 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL에 부드럽게 휘저어 주세요. 조직의 스트립을 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL가 들어있는 깨끗한 중간 크기의 계량 보트에 넣고 추가 처리 준비가 될 때까지 얼음위에 유지하십시오 (단계 1.8 또는 1.11).</li>
	<li>십이지장의 경우 십이지장 근시의 10mm 부분을 위장으로 자른다. 21-25 G 바늘을 사용 하 여, 이물질과 박테리아를 제거 하기 위해 플러시.
	<ol>
<li>십이지장의 한쪽 끝에 바늘을 삽입하고 1 mL의 차가운 다진 용액으로 플러시하십시오.</li>
		<li>십이지장의 뒤집기와 다른 1 mL의 다진 용액으로 반복하여 다른 방향을 플러시합니다. 바늘을 버리십시오.</li>
		<li>십이지장 오픈을 슬라이스하고 ~ 7 mL의 깨끗한 다진 용액을 포함하는 중간 크기의 계량 보트에 넣기 전에 채굴 용액의 ~ 7 mL로 헹구십시오. 추가 처리 가 준비될 때까지 얼음 위에 유지하십시오(1.8 단계 또는 1.11단계).</li>
	</ol></li>
	<li>뇌의 경우 먼저 뇌를 두 개의 반구로 나누는 것이 유용할 수 있습니다. 하나의 반구는 가능한 조직 병리학을 위해 저장할 수 있습니다 (1.2 단계 참조).
	<ol>
<li>관심있는 뇌 영역을 해부하고 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL에서 부드럽게 휘저어 주세요.</li>
		<li>조직(들)을 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL를 함유한 깨끗한 중형 계량 보트로 옮기고 추가 처리 준비가 될 때까지 얼음 위에 유지합니다(단계 1.8 또는 1.11; 소뇌 및 해마와 같은 작은 부위는 더 이상 트리밍이 필요하지 않을 수 있음).</li>
	</ol></li>
	<li>위장용
	<ol>
<li>포위를 제거하고 폐기하십시오. 배를 열고 중간 크기의 계량 보트에서 ~ 7 mL의 차가운 다진 버퍼를 사용하여 음식에서 씻어 냅니다.</li>
		<li>가능한 조직 병리학 평가를 위한 고정을 위해 십이지장에 5 mm 의 선 위 근엽 을 제거하십시오 (단계 1.2 참조).</li>
		<li>남은 배를 중간 크기의 계량 보트에 차가운 다진 완충액 ~7 mL에 넣고 얼음에 15-30 분 동안 배양하십시오. 참고: 이 배양 단계는 필요하지 않을 수 있습니다. 이 단계는 JaCVAM 유효성 검사 프로토콜에 포함되었지만 OECD 시험 지침8,,9에는언급되지 않았습니다.</li>
		<li>깨끗한 파라핀 조각(또는 페트리 접시 또는 계량 보트)으로 위를 옮기고 메스 블레이드 또는 폴리테트라플루오로에엔(PTFE) 스크레이퍼를 사용하여 표면 상피를 2회 이상 부드럽게 긁어 내어 이물질을 제거합니다. 집게로 위 점막을 집어 들고 파이펫을 사용하여 1 mL의 차가운 다진 버퍼로 헹구고 헹구어 보세요. 깨끗한 표면이나 접시에 위 조직을 전송합니다.</li>
		<li>메스 블레이드 또는 PTFE 스크레이퍼의 뒷면으로 다진 용액 (일반적으로 250 μL / 마우스 또는 500-1,000 μL / rat)에서 위 상피를 4-5 회 조심스럽게 긁어 냅니다. 선택적으로, 더 많은 세포를 복구하기 위해 거의 동일한 양의 다진 용액으로 조직을 헹구는 다. 파이펫을 사용하여 방출된 세포를 함유하는 다진 용액을 수집하고 얼음 위에 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김을 전달한다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 샘플을 다진 경우, 간 또는 뇌 조직의 3-4 mm 절편 또는 십이지장의 ~ 5mm를 자르고 1.5 또는 2.0 mL의 콜드 마칭 용액을 함유한 표지된 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 합니다. 샘플을 차갑게 유지하면서 미세하게 분산 될 때까지 가위로 빠르게 다진 (≤30s). 샘플은 약간 흐린 것처럼 보입니다. 그러나 일부 조각이 튜브 의 바닥에 정착하는 것이 일반적입니다.</li>
	<li>신선한 조직을 사용하려면, 다진 조직 또는 얼음에 긁힌 상피 세포를 포함하는 튜브를 유지; 약 1 시간 의 수확 (섹션 2에 설명)에서 혜성 슬라이드를 준비하기 위해 조직을 사용합니다.</li>
	<li>조직 샘플을 동결하기 위해, 긁힌 상피 세포의 다진 또는 수집 직후
	<ol>
<li>튜브 뚜껑을 고정하고 액체 질소를 함유한 Dewar 플라스크에 튜브 를 떨어 뜨리십시오. 튜브는 부검 기간 동안 액체 질소에서 유지 될 수있다 (≤3 h).</li>
		<li>국자를 사용하여 튜브를 검색하고 정렬 드라이 아이스에 배치합니다. 튜브를 드라이 아이스의 냉동고 박스로 옮기고 -80°C 냉동실에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>조직의 냉동 큐브를 준비하기 위해, 조직의 여러 작은 조각을 잘라 (직경 ≤4mm 및 ~ 6mm 길이; 그림 1).
	<ol>
<li>액체 질소가 들어있는 중간 크기의 계량 보트 또는 기타 적합한 용기에 개별적으로 직접 떨어 뜨립니다.</li>
		<li>조각이 완전히 동결하고 건조 얼음에 유지 표지 된 미세 원심 분리튜브 또는 저온 튜브에 개별 냉동 조직 큐브를 전송하는 몇 초 동안 기다립니다; 동결 과정에서 조각이 뭉쳐지지 않도록 하십시오.</li>
		<li>튜브를 드라이 아이스의 냉동고 박스로 옮기고 -80°C 냉동실에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 슬라이드 준비
<ol><li>
다진/긁힌 티슈용
	<ol>
<li>젖은 얼음에 신선한 조직을 포함하는 튜브를 유지합니다.</li>
		<li>냉동 조직의 튜브를 시료가 완전히 해동될 때까지 실온의 수조에 놓고 차가운 것을 유지하십시오. 즉시 튜브를 얼음으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김에 대십시오.</li>
		<li>아가로즈로 전달하기 위해 세포를 인출하기 직전에(단계 2.3), 각 셀 현탁액을 부드럽게 혼합; 필터링되지 않은 샘플의 경우 큰 덩어리가 튜브 바닥에 정착하도록 하십시오. 슬라이드가 모든 샘플에 대해 준비될 때까지 얼음에 있는 모든 튜브를 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
큐브 티슈용
	<ol>
<li>80°C 냉동고에서 티슈 큐브가 들어 있는 튜브를 꺼내고 슬라이드 준비전까지 드라이 아이스를 유지합니다.</li>
		<li>상인의 배지의 1 mL (0.14 M NaCl, 1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 8.1 mMNa2HPO4,10 mM NaEDTA, pH 7.4) 또는 각 샘플에 대한 1.7 mL 마이크로 센트리 퓨지 튜브로 다진 용액을 각 샘플에 유지한다.</li>
		<li>조직 해동을 피하기 위해 신속하게 작업하고, 실온 조직 다진 장치의 열린 끝에 조직의 큐브를 놓습니다(그림 1). 여러 조직 조각이 사용될 수있다; 필요한 경우, 동결된 조직은 장치에 맞게 큐브 크기를 줄이기 위해 차가운 모르타르 및 유봉을 사용하여 더 작은 조각으로 절단되거나 갈라질 수 있다.</li>
		<li>크기 일치의 주사기 플런저를 장치에 신속하게 삽입하여 조직을 메쉬 단부로 밀어 넣은 다음 차가운 다진 용액을 함유하는 미세 원심 분리튜브에 배치해야 합니다. 액체가 튜브를 덮어 넘도록 강요하지 마십시오. 조직이 완전히 해동 될 수 있도록 차가운 다진 용액에 약 5-10 s에 대한 장치의 메쉬 끝을 담급질.</li>
		<li>세포가 메쉬 모공을 통해 압출 볼 때까지 플런저를 완전히 누르는. 그런 다음 플런저를 약 2.5 cm 위로 당기고 다시 완전히 누릅니다. 다진 용액이 혼탁해질 때까지 과정을 여러 번 반복합니다.</li>
		<li>필요한 경우, 샘플은 1100 rpm에서 5분 동안 냉장 된 원심분리및 상판의 일부를 제거함으로써 세포 밀도를 증가시키기 위해 농축될 수 있다.</li>
		<li>각 샘플에 대한 깨끗한 조직 다듬기 장치를 사용하여 모든 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C에서 0.5% 낮은 융점 아가로즈의 450 μL을 함유하는 튜브에 50 μL의 세포 현탁액을 전달한다. 참고: 볼륨은 조정할 수 있지만 아가로즈의 양은 ≤1%여야 합니다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 슬라이드를 준비하고 점수 슬라이드10,,11.</li>
</ol>

<ol><li>van der Leede, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+data+interpretation+of+the+in+vivo+comet+assay+in+pharmaceutical+industry%3A+EFPIA+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).</li>
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</ol>

이 작품은 NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 환경 보건 과학의 국립 연구소 (NIEHS) 계약 HHSN273201300009C에 따라; 그러나 그 안에 포함된 진술, 의견 또는 결론이 NIEHS, NIH 또는 미국 정부의 진술, 의견 또는 결론을 반드시 나타내는 것은 아닙니다.

이전에 입증된 바와 같이7,,12,,13,제대로 처리된 플래시 냉동 다진 조직은 혜성 분석에서 좋은 결과를 제공한다. 사실, 우리의 실험실에서 제조 된 냉동 다진 쥐와 마우스 간을위한 기준 % 꼬리 DNA 값은 일반적으로 ≤6 %, 새로 다진 쥐 간 샘플에 대한 OECD 테스트 지침9에 의해 권장. 좋은 결과 다진 하 고 냉동 저장 된 조직 유형의 다양 한를 사용 하 여 여러 실험실에 의해 얻은; 마찬가지로, 위장관에서 장기로부터 긁힌 플래시 냉동 상피 세포는 혜성 분석7,,12,,13,,14에서</sup...

혜성 분석기는 화학 물질 또는 다른 환경 스트레스제에 노출된 배양 된 세포 및 조직에서 DNA 손상을 평가하는 수단으로 점점 더 많이 사용된다1. 이 분석은 불완전한 DNA 복구와 관련되었던 DNA 이중 및 단 하나 물가 휴식, 알칼리-labile 병변 및 단 하나 물가 나누기를 검출할 수 있습니다. 국제항암제 시험용 인체사용기술요건의 조화(ICH) 가이드라인은 생체내 유독성 평가를 위한 설치류 적혈구 미세핵분석실험을 보충하기 위한 제2시험으로서 혜성분석과 같은 DNA 가닥 파괴 분석실험을 권고하고, 종양유도2의표적기관에서의 행동모드를 평가하기 위한 후속검사로 한다. 유럽식품안전청(EFSA)은 생체외 유독성 시험3에서 양성 결과의 관련성을 조사하기 위한 적절한 후속 시험으로서 생체 내 혜성 분석기를3권장한다. 2014년, 설치류 혜성 분석실험에 대한 OECD 시험 지침이 승인되어, 따라서 게노독성 전위내성의 규제 시험에 사용하기 위한 분석법의 수용성을 증가시킨다. 분석은 용해 된 세포의 핵에서 이동하는 이완된 DNA 루프 및 파편의 전기 동화성 분리에 근거를 두었습니다. 기본적으로, 단 하나 세포는 현미경 슬라이드에 겹쳐진 agarose에 내장됩니다. 슬라이드는 다음 알칼리성 (pH > 13) 솔루션 다음에 용해 버퍼에 침지, 단단히 코일 핵 DNA가 이완하고 긴장을 풀 수 있습니다. 슬라이드는 다음 양극을 향해 음전하 DNA의 이동을 자극하는 전기장에 배치, 혜성을 닮은 이미지를 만드는; 혜성 머리와 비교된 혜성 꼬리에 있는 DNA의 상대적인 양은 DNA 손상의 양에 정비례합니다; 꼬리의 DNA 함량은 전형적으로 디지털 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다.
혜성 분석이 단편화된 DNA를 검출하기 때문에, 노출 유도된 DNA 손상의 정확한 정량화는 처리 유도된 세포 독성 또는 긴장에서 유래한 괴사 또는 세포자멸과 관련되었던 염색질 단편화에 의해 혼동될 수 있습니다. 또한, DNA 손상은 기계적 전단 또는 부적절한 시료 처리의 결과로 발생할 수 있습니다4. DNA 손상의 기준선 수준을 최소화하기 위해 슬라이드 준비 전에 냉각 된 수확 된 조직을 유지하는 것이 이전에5,,6으로입증되었습니다. 많은 실험실은 신선한 조직에서 혜성 분석 슬라이드를 준비; 그러나, 이것은 동물의 다수를 가진 연구 결과에 있는 동물 당 다중 조직 모형에서 슬라이드를 준비할 때 물류적으로 도전적일 수 있습니다. 또한, 이것은 슬라이드 준비 및 분석이 원격 실험실에서 발생할 때 문제를 제시, 샘플의 선적을 필요로. 예를 들어, 미국 국립 독성학 프로그램은 혜성 분석물질을 그 유전독성시험 프로그램(https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html)의 성분으로 포함하며, 때로는 28일 또는 90일 반복 투여량 독성 연구에 분석결과를 통합한다; 이것은 생활 실험실에 의하여 조직의 수집및 분석을 위한 다른 실험실에 견본의 전송을 필요로 합니다. 이를 달성하기 위해, 조직 조각은 다진, 및 /또는 위장관의 상피 세포는 긁어 및 세포 현탁액은 분석7까지수신 실험실에 의해 후속 선적 및 저장을위한 냉동및 냉동에 저장된다. 시료의 적절한 취급은 냉동 조직을 사용하여 고품질의 데이터를 얻는 데 중요합니다. 그러나, 끊임없이 변화하는 인원에 의해 수행된 부검 도중 조직 견본의 재현가능한 조작은 통제하기 어렵습니다, 특히 혜성 분석사를 위한 조직을 일상적으로 수확하지 않는 생활 실험실에서. 부검 직원의 재교육 또는 신선하거나 냉동 된 조직 샘플을 수집하기 위해 숙련 된 실험실 직원이 근무하는 모바일 유닛의 사용은 종종 너무 비싸거나 실현 가능하지 않거나 단순히 과소 평가됩니다.
혜성 분석 분석을 위한 원격 부위로의 이송을 위한 고품질 조직 샘플의 일관된 생성을 더 잘 보장하기 위해, 조직의 플래시 냉동 큐브로부터 조직 보존의 출판 방법6의 유용성을 탐구하였다. 이 방법에서, 조직의 동결된 큐브는 콜드 버퍼를 함유하는 미세원원원지 튜브에 배치되는 스테인레스 스틸 조직 채굴장치(도 1)에적재된다. 조직의 큐브는 장치의 끝에있는 작은 게이지 메쉬를 통해 밀어 넣습니다. 반복적으로 메쉬 체를 통해 여러 번 양방향으로 조직 현탁액을 강제하면 비교적 균일한 단일 세포 현탁액을 초래한다. 이 방법으로 제조된 샘플은 다진 에 의해 제조된 신선 및 냉동 조직 샘플 모두에 품질면에서 유리하게 비교하였다. 추가 혜택으로, 다진 샘플과는 달리, 조직 큐브는 오랜 시간 동안 냉동 저장 될 수 있으며 여전히 혜성 분석에서 높은 품질의 결과를 산출.

<table><tbody><tr><td>Cryovials</td><td>Corning Costar</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>치과 왁스 시트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72670</td><td></td></tr><tr><td>해부 (다지기) 마이크로 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Teknova</td><td>P0315-10</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>저융점</td><td>Agarose Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>마이크로fuge 튜브(1.7 mL)</td><td>Corning</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Na2 HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린</td><td>Leica</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>주사기 플런저(1mL)</td><td>Fisher Scientific 또는 Vitality Medical</td><td>14-826-88; 8881901014</td><td>Becton Dickinson 또는 Monoject tuberculin 주사기</td></tr><tr><td>조직 다진 장치</td><td>NorGenoTech (노르웨이 오슬로)</td><td>없음</td><td>플런저의 포근함에 영향을 줄 수 있는 직경의 작은 변동이 관찰되었습니다.</td></tr><tr><td>핀셋, 플라스틱</td><td>Trade Winds Direct</td><td>DF8088N</td><td>강화 나일론, 비멸균, 뭉툭한 팁, 오토클레이브 가능; tradewindsdirect.com</td></tr><tr><td>Weigh Boats</td><td>Krackler Scientific/Heathrow Scientific</td><td>6290-14251B</td><td></td></tr></tbody></table>

dna 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

혜성 분석은 배양 된 세포와 조직에서 DNA 손상을 평가하는 수단으로 인기를 얻고 있으며, 특히 화학 물질이나 다른 환경 스트레스 에 노출 된 후. 설치류에서 genotoxic 잠재력에 대한 규제 테스트에서 혜성 분석의 사용은 2014 년 경제 협력 및 개발 기구 (OECD) 테스트 가이드 라인의 채택에 의해 구동되었다. 혜성 분석 슬라이드는 전형적으로 부검시에 신선한 조직에서 제조된다; 그러나, 동결 조직 견본은 동물 당 그리고 연구 당 많은 동물에서 다중 기관에서 슬라이드의 동시 준비와 관련되었던 물류 도전을 피할 수 있습니다. 동결은 또한 분석을 위해 다른 실험실에 노출 시설에서 샘플을 선적 할 수 있으며, 냉동 조직의 저장은 주어진 기관에 대한 DNA 손상 데이터를 생성하는 결정을 연기 용이하게. 알칼리성 혜성 분석은 불완전한 DNA 절제 수선과 관련되었던 노출 관련 DNA 이중 및 단 하나 물가 나누기, 알칼리-labile 병변 및 가닥 나누기를 검출하기 위해 유용합니다. 그러나 DNA 손상은 또한 기계적 전단 또는 부적절한 샘플 처리 절차로 인해 분석 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 부검 중 조직 샘플의 수집 및 처리의 재현성은 혜성 분석에 대한 조직 을 수확하는 경험이 다양한 수준의 실험실 직원변동으로 인해 제어하기 어려울 수 있습니다. 숙련된 실험실 인력으로 구성된 모바일 장치의 재교육 또는 배포를 통해 일관성을 향상시키는 것은 비용이 많이 들며 항상 실현 가능하지는 않을 수 있습니다. 혜성 분석 분석을 위한 고품질 샘플의 일관된 생성을 최적화하기 위해 맞춤형 조직 채굴 장치를 사용하여 조직의 플래시 냉동 큐브를 균질화하는 방법을 평가하였다. 이 방법에 의해 혜성 분석에 대해 제조된 샘플은 부검 시 다진 에 의해 제조된 신선 및 냉동 조직 샘플에 대한 품질면에서 유리하게 비교하였다. 더욱이, 낮은 기준선 DNA 손상은 장기간 저장다음 조직의 동결 된 큐브에서 세포에서 측정되었다.

연구 1 간은 4일 동안 옥수수 오일을 투여한 수컷 스프라그 다울리 쥐의 2마리 집단으로부터 수확하였고, 1주일씩 엇갈렸다. 슬라이드는 신선하게 다진 조직, 냉동 다진 조직, 및 조직 다진 장치를 사용하여 상인의 배지 또는 다진 용액에서 처리된 냉동 큐브 조직으로부터 제조되었다. 제1 코호트로부터 동물로부터 얻은 냉동 조직을 ~3.5개월 동안 냉동보관 후 평가하였다. 제2 코호트로부터 동물로부터 얻은 냉동 조직을 ~6개월 동안 저장한 후 평가하였다. 심하게 손상된 세포 (세포 독성 또는 기계적 스트레스를 포함 할 수있는 불확실한 병인)를 나타내는 특징적인 "고슴도치"형태를 나타내는 혜성은 % 꼬리 DNA의 채점에 포함되지 않았습니다. 형태학의 육안 검사에서만 확인된 고슴도치의 백분율은 OECD TG 4899에따라 별도로 표로 표로 표로 정리되었습니다. 두 코호트(100세포/동물 채점 기준)의 동물에 대한 평균 %의 꼬리 DNA 결과는 <strong c...

이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

이 프로토콜은 여러 조직을 평가할 때 냉동 조직의 사용이 물류를 단순화하고 분석을 위해 원격 실험실로 샘플 전송을 허용하며 몇 달 동안 조직을 분석하는 결정을 연기할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 냉동 큐브 조직의 사용이 부검에서 혜성 분석에서 훈련 된 인력을 필요로하지 않으며, 샘플 조작 중에 도입 된 기술적 오류 및 기계적 DNA 손상에 대한 기회를 최소화한다는 것입니다. 이 기술은 전임상 약물 개발, 환경에 들어가는 화학 물질의 안전 평가 및 식품 첨가제에 응용 이해왔습니다.냉동 조직은 혜성 분석에서 유독성 잠재력, DNA 수리, 화학 요법 또는 방사선에 의해 유도 된 DNA 손상에 대한 보호 효과 및 환경 바이오 모니터링을 위해 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 실험은 다음 동물에게서 수확한 기관이 처리를 위해 유효해지기 전에 동결 단계로 각 조직 견본의 처리를 허용하도록 설계되어야 합니다. 냉동 조직은 유독성 잠재력, DNA 수리, 화학 요법 또는 방사선에 의해 유도 된 DNA 손상에 대한 보호 효과 및 환경 바이오 모니터링을 평가하기 위해 혜성 분석에서 소송을 제기 할 수 있습니다.기술 트레이너 캐롤 보빗, 조사 독성 실험실 매니저 아일린 길라스는 오늘 프로 섹터로 봉사 할 것입니다. 연구 동료 링컨 마틴, 그리고 역사학 기술자 아멜리 Ladesseur 샘플 처리를 시연 할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 관심 기관에서 연결된 연결 조직, 장기 및 이물질을 제거하십시오.잔류 혈액과 파편을 제거하기 위해 약 7 밀리리터의 차갑고 갓 준비된 다진 용액이 들어있는 중간 크기의 계량 보트에서 즉시 장기를 힘차게 휘젓습니다. 조직을 물에 잠그고 추가 처리될 때까지 얼음 위에 유지하기에 충분한 냉분질 용액을 포함하는 다른 깨끗한 계량 보트로 기관을 옮춥니다. 간의 경우 왼쪽 엽의 5mm 세로 섹션을 자르고 차가운 다진 용액의 약 7 밀리리터에서 부드럽게 스위시하십시오.그런 다음 조직의 스트립을 약 7 밀리리터의 차가운 다진 용액이 들어있는 깨끗한 중간 크기의 계량 보트에 넣고 더 처리 할 준비가 될 때까지 얼음을 유지합니다. 간 의 한 부분을 제거하고 포함 카세트에 배치합니다. 가능한 미래 조직 병리학 평가를 위한 실험실 표준 절차에 따라 고정, 트리밍 및 파라핀 포함을 수행합니다.십이지장의 경우 십이지장 근위 10mm 부분을 위장에 잘라냅니다. 십이지장 한쪽 끝에 21~25게이지 바늘을 삽입하고 차가운 밍크 액액 1밀리리터로 세척하여 이물질과 박테리아를 제거합니다. 십이지장을 뒤집어 다진 용액의 또 다른 밀리리터로 다시 씻어 내고 바늘을 버립니다.십이지장 위를 슬라이스하고 약 7밀리리터의 밍크 액티비터에 헹구습니다. 그런 다음 십이지장 두경을 다시 헹구고 더 멀리 처리 할 준비가 될 때까지 얼음에 다진 용액으로 유지합니다. 이전에 간을 위해 설명된 바와 같이 가능한 미래 조직 병리학 평가를 위해 나머지 십이지장의 일부를 잘라고 수정합니다.두뇌를 위해, 가능한 조직병리학을 위해 저장되는 한 반구와 함께, 먼저 두 개의 반구로 두뇌를 분할하는 것이 유용할 지도 모릅니다. 관심있는 뇌 영역을 해부한 다음 부드럽게 헹구고 간과 십이지장에게 이전에 설명된 대로 더 가공 할 준비가 될 때까지 다진 용액의 얼음을 유지하십시오. 위장의 경우, 제거하고 위위를 폐기.선위를 열고 차가운 다진 버퍼 약 7 밀리리터가 들어있는 중간 크기의 계량 보트에서 스위싱하여 음식에서 무료로 씻으십시오. 이전에 설명한 바와 같이 가능한 조직 병리학 평가를 위해 고정을 위해 십이지장까지 5밀리미터의 선 위 근위를 제거하십시오. 남은 위장을 약 7밀리리터의 차가운 다진 버퍼가 들어 있는 중간 크기의 계량 보트에 넣고 15~30분 동안 얼음위에 배양합니다.그 후, 위장을 깨끗한 파라핀 조각으로 옮기고 메스 블레이드 나 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 표면 상피를 두 번 부드럽게 긁어 이물질을 제거합니다. 집게로 위 점막을 집어 들고 파이펫을 사용하여 차가운 다진 버퍼 1 밀리리터로 헹구세요. 헹구는 위 조직을 깨끗한 표면이나 접시에 옮기고 차가운 다진 용액을 추가합니다.메스 블레이드 또는 플라스틱 셀 스크레이퍼의 뒷면을 사용하여 위 상피를 4~5회 조심스럽게 긁어 내어 세포를 방출합니다. 이어서, 파이펫을 사용하여 방출된 세포를 포함하는 밍크 액액을 수집하고 얼음상에 있는 미세원심분리기 튜브로 옮기다. 조직 샘플을 다진 경우 간, 뇌 또는 십이지장 의 한 부분을 자르고 차가운 다진 용액 1 밀리리터를 포함하는 표지 된 미세 센심 분리기 튜브로 옮춥시게합니다.다진 가위를 사용하여 샘플이 마침내 분산될 때까지 시료를 빠르게 다진 반면 샘플이 차가운 상태를 유지하도록 합니다. 샘플은 약간 흐린 것처럼 보일 것입니다. 그러나, 튜브의 바닥에 정착 하는 일부 조각 남아 하는 것이 일반적이다.그것은 신선한 동안 조직을 사용 하려면, 얼음에 샘플을 포함 하는 튜브를 유지. 조직 샘플을 동결하려면, 다진 또는 수집 직후 튜브의 뚜껑을 고정하고 액체 질소를 포함하는 데워 플라스크에 튜브를 떨어 뜨립니다. 조직 수확이 끝나면 국자를 사용하여 샘플 튜브를 검색하고 건조 얼음에 배치하여 정렬하십시오.튜브를 드라이 아이스의 냉동고 상자에 옮기고 상자를 영하 80도의 냉동고에 보관합니다. 조직의 냉동 큐브를 준비하기 위해, 조직의 몇 가지 작은 조각을 잘라 개별적으로 몇 초 동안 액체 질소를 포함하는 중간 크기의 계량 보트 또는 다른 적합한 용기에 직접 드롭. 조각이 완전히 얼어 붙은 후, 냉동 조직 큐브를 개별적으로 옮기고 미세 원심 분리튜브 또는 냉동 튜브를 드라이 아이스에 부착합니다.조직 수확이 끝나면 튜브를 드라이 아이스의 냉동고 상자로 옮기고 상자를 영하 800도의 냉동고에 보관하십시오. 젖은 얼음에 유지 되는 갓 다진 또는 긁힌 조직을 사용 하는 경우, 수확 의 시간 이내에 혜성 슬라이드를 준비. 냉동 다진 또는 긁힌 조직을 사용하는 경우, 샘플이 완전히 해동 될 때까지 실온에서 수조에 냉동 조직의 튜브를 배치하여 차가운 유지되도록합니다.시료가 해동되면 즉시 튜브를 얼음으로 옮기습니다. 큐브 조직의 경우 냉동고에서 큐브가 들어있는 튜브를 회수하고 슬라이드 준비까지 드라이 아이스를 유지합니다. Aliquot는 상인의 매체 의 1 밀리리터 또는 각 샘플에 대한 라벨1.7 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 다진 용액을 표시하고 얼음에 유지합니다.해동을 피하기 위해 빠르게 작동하여 실온 조직 채굴 장치의 열린 끝에 조직 큐브를 배치합니다. 장치로 일치하는 크기와 일치하는 주사기 플런저를 신속하게 삽입하여 조직을 메쉬 끝으로 밀어 넣은 다음 차가운 밍크 솔루션을 포함하는 미세 원심 분리기 튜브에 배치해야합니다. 차가운 다진 용액에 약 5~10초 동안 장치의 메쉬 끝을 침수하여 조직이 완전히 해동할 수 있도록 합니다.세포가 메쉬 모공을 통해 압출될 때까지 플런저를 완전히 우울하게 합니다. 그런 다음 플런저를 약 2.5센티미터 위로 당기고 다시 완전히 누릅니다. 밍싱 솔루션이 탁구가 될 때까지 여러 번 반복합니다.슬라이드를 준비하려면 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하고 50 마이크로리터를 섭씨 37도에서 0.5% 낮은 융점 아가로즈450 마이크로리터를 함유한 튜브로 옮킨다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 슬라이드를 준비하고 점수를 매는다. 첫 번째 연구에서, 간 은 1 주일 의해 비틀 거린 남성 Sprague Dawley 차량 제어 쥐의 두 코호트에서 수확되었다.미끄럼주는 갓 다진 조직, 냉동 다진 조직 및 냉동 큐브 조직에서 제조되었습니다. OECD는 신선한 쥐 간에서 백분율 꼬리 DNA에 대한 상한을 권장하기 때문에 6%이러한 결과는 동결 방법 중 어느 것이든 조직을 평가하기 위해 잘 작동 할 수 있음을 보여줍니다. 전반적으로, 고슴도치는 백분율 꼬리 DNA를 평행시켰습니다, 동결된 조직이 더 중대한 가변성을 보였더라도.두 번째 연구에서는, 암컷 B6C3F1 마우스는 돌연변이원 에틸 메탄설포네이트를 투여하였다. 백분율 꼬리 DNA 결과는 간 조직이 큐브로 동결되고 그 후에 조직 다진 장치를 사용하여 처리되었다는 것을 신선하게 다진 조직을 위해 얻은 것과 아주 유사한 결과를 산출했다는 것을 표시합니다. EMS 유도 DNA 손상의 통계적으로 유의한 증가는 세 가지 방법 모두에 의해 처리된 조직 샘플에서 측정되었다.세 번째 연구에서는, 90일 화학독성 연구에서 여성 B6C3F1 마우스로부터 채취한 간 샘플을 분석하였다. 냉동 다진 조직의 DNA 손상은 동물 가변성에 상당한 동물과 함께 모든 용량 그룹에 걸쳐 높았다. 백분율 꼬리 DNA 결과는 고슴도치가 이 견본에서 관찰된 DNA 손상의 높은 수준에 실질적으로 기여했다는 것을 나타내는 백분율 고슴도치와 상관관계를 연관시켰습니다.대조적으로, 손상된 DNA와 백분율 고슴도치는 다진 조직 견본과 병행해서 준비된 플래시 동결된 입단에서 아주 낮았습니다. 따라서, 다진 조직 샘플에서 고슴도치로 나타난 고슴도치로서 나타난 고슴도치들은 생물학적 과정의 결과가 아니라 기계적 중단에 의해 도입되었을 가능성이 높았으며, 또는 플래시가 동결되기 전에 다진 시술 중에 조직 온난화가 발생할 가능성이 있다. 따라서, 다진 조직에 대한 데이터는 신뢰할 수없는 것으로 간주되었다.비교하여, 고질 데이터는 장기간 저장후에도 냉동 큐브 조직에서 얻어졌다. 수확된 조직을 차갑고 촉촉하게 유지하고 신속하게 작업하여 샘플을 동결하는 것이 중요합니다. 또한, 냉동 큐브 조직은 균질화 단계 직전에 해동되어야 한다.냉동 조직 샘플은 예를 들어, 산화 손상 또는 교차 연결을 검출하기 위해 혜성 분석의 수정, 유전자 발현의 변화의 평가를 포함한 다른 다운스트림 응용 분야에 적합합니다. 메스 블레이드를 취급하여 조직을 자르거나 긁어내고 동결 과정에서 액체 질소를 취급할 때주의해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 유해 물질에 노출된 후 DNA 손상을 감지하기 위한 혜성 분석을 보여줍니다. 알칼리성 조건에서는 DNA가 풀리고 변성되며, 전기영동에 따라 손상되지 않은 DNA와 손상된 DNA가 아가로스 겔에서 다르게 이동하여 혜성 모양의 구조를 형성합니다. 천천히 이동하는 손상되지 않은 DNA는 원형 혜성 머리를 형성하고, 빠르게 이동하는 손상된 DNA 조각은 길쭉한 혜성 꼬리를 형성합니다.

세포의 DNA 손상 감지를 위한 Comet Assay

혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트와 hippocampal 뉴런을 포함한 모든 세포의 DNA에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다. 방법은 DNA 손상의 양의 차이로 인해 전기 분야에서 DNA의 차동 마이그레이션을 활용합니다.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

혜성 분석 결과 단일과 이중 가닥 DNA를 포함 하 여 DNA 손상 나누기를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 화학 요법의 치료 효과 평가 하기 위해 암 세포의 DNA 손상을 측정을 설명 합니다.

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

혜성 분석은 DNA 손상을 감지하는 널리 사용되는 수단입니다. 이 연구는 혜성 분석의 대표적인 변형에서 슬라이드를 실행하는 접근 방식을 설명합니다. 이 접근 방식은 샘플 수를 크게 늘리는 동시에 분석 실행 시간, 슬라이드 조작 횟수 및 젤 손상 위험을 줄였습니다.

세포 DNA 손상 평가를 위한 고처리량 혜성 분석 접근법

이 프로토콜은 혜성 분석의 적용을 통해 FLT3 돌연변이 세포에서 유형 I 및 유형 II 억제제에 의해 유도된 DNA 손상의 차이를 정량화하는 효과적인 방법을 설명합니다.

유형 I 및 유형 II FLT3 억제제에 노출된 후 FLT3 돌연변이 발현 32D 세포에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 혜성 분석

표적 DNA 손상은 DNA 손상제를 삼중 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)에 묶음으로써 달성할 수 있습니다. 변형된 TFO를 사용하여, DNA 손상 특이적 단백질 결합, 및 DNA 토폴로지 변형은 본원에 기술된 변형된 염색질 면역침전 분석 및 DNA 슈퍼코일링 분석의 활용에 의해 인간 세포에서 연구될 수 있다.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

이 문서에서는 DNA 분리 및 매우 가난한 품질 DNA의 구조를 포함 하 여 식물 표본 상자 물자에서 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축을 위한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

학습하세요 혜성 분석에서 냉동 조직을 사용하여 DNA 손상을 평가하는 방법을. 냉동 큐브 조직 기법은 숙련된 인력 없이도 기술적 오류와 기계적 DNA 손상을 최소화하여 전임상 약물 개발 및 환경 안전성 평가에 효과적으로 활용됩니다.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

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