Name: 쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 학습하세요 고분해능 용융 분석(HRM) 기반 TILLING을 이용한 쌀 돌연변이 식별 방법을. 96웰 PCR 플레이트를 활용한 고처리량 선별로 삽입/결실 및 단일 염기 치환 돌연변이를 효율적으로 검출하여 질병 저항성 등 중요 형질 개량에 활용합니다.

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이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (No. 2016YFD0102103)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (No.31701394)에 의해 지원되었습니다.

1. 준비
<ol><li>
γ선 돌연변이 인구의 발달
	<ol>
<li>약 20,000개의 말린 쌀 씨앗을 치료하십시오(수분 함량은 14%) 100 Gy (1 Gy / min)에서 137Cs 감마선을 가진 자포니카 쌀 라인 (예를 들어, DS552)의 γ 조사 시설 (예를 들어, 감마 세포). 참고: 치료에 사용되는 씨앗은 높은 생존율을 가져야합니다 (예 : 발아율 >85 %). 인디카 쌀에 대한 조사 용량은 150 Gy로 증가 될 수있다.</li>
		<li>모종 침대에서 발아 한 후 조사 된 씨앗을 뿌리고 모종을 개별적으로 논에 이식하고 M1 인구로 성장시킵니다. 참고: M1 공장의 직접 파종은 인건비를 절감하기 위해 드물게 적용 될 수 있습니다. M1 식물이 다른 쌀 품종과 교차하는 것을 방지하여 물리적 또는 생물학적 격리 수단을 사용하십시오.</li>
		<li>M1 식물에서 대량 수확 M2 씨앗, 각 M에서 1-2 씨앗1-2 공황, M을 형성하기 위해2 인구. 참고 : 연습과 단순하기 위해, M1 식물의 모든 씨앗을 수확하고 완전히 혼합 한 후, 부분은 M2 인구를 형성하기 위해 샘플링된다.</li>
		<li>실온에서 약 5,000 M2 씨앗을 물에 담그고 24 (인디카 쌀)-36 (자포니카 쌀) h. 그런 다음 페트리 접시에 축축한 필터 종이에 2 일 동안 37 °C에서 발아 씨앗을 보자. 참고: 돌연변이를 식별 할 확률을 높이기 위해 분석을 위해 더 많은 M2 씨앗을 발아 할 수 있습니다.</li>
		<li>발아 된 씨앗을 작은 구멍이있는 파종 패널에 놓고 Yoshida 등15에서 변형 된 배양 용액에서 3-4 주 동안 수경으로 성장시키고 12 시간 포토 기간 [주간 (30 ±2) ° C 및 밤 (24 ±2) °C]를 가진 유리 하우스에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>잎 조직의 샘플링 : 구멍 펀처를 사용하여 동일한 위치에서 각 시드의 완전히 확장 된 잎에서 하나의 디스크 (Φ ~ 2mm)를 잘라.</li>
	<li>
DNA 추출 솔루션 의 준비
	<ol>
<li>버퍼 A: 5 M NaOH 의 2 mL과 20% 트웬 20의 10 mL를 추가하여 최종 부피를 50 mL로 만듭니다. DNA 추출 전에 버퍼 A를 신선하게 준비합니다.</li>
		<li>버퍼 B: 1M Tris-HCl(pH 8.0)의 20 mL과 0.5M EDTA의 80 μL을 추가하여 최종 부피를 100 mL로 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 프라이머
	<ol>
<li>HRM 분석을 위한 프라이머: 소프트웨어(예: 프라이머 Premier5)를 사용하여 대상 서열을 증폭하고 상업적 회사에 의해 합성하기 위한 설계 프라이머. 참고: HRM은 긴 조각의 분석에 덜 적용하기 때문에 앰플리온은 400 bp 미만이어야합니다. 또는 너무 낮음(&25%) GC 콘텐츠는 HRM 분석에도 좋지 않습니다.</li>
		<li>품질 관리를위한 프라이머 : Peng 등16에서12 쌀 염색체에 분포 된 24 개의 SSR 마커를 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 추출
<ol><li>96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 4개의 리프 디스크를 놓고 버퍼 A 용액(50mL/well)을 추가합니다. 플레이트를 -80°C 냉동고에서 10분 동안 동결합니다.</li>
	<li>실온에서 플레이트를 동결한 다음 95°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 우물에 50 μL의 버퍼 B를 추가하고 소용돌이에 의해 잘 섞어.</li>
	<li>1,500 x g에서 1 분 동안 접시를 원심 분리합니다. 상급PCR에 대한 준비가되어 있습니다.</li>
</ol>3. PCR 증폭
<ol><li>
PCR 최적화
	<ol>
<li>각 PCR에 다음 시약을 잘 추가하십시오: DNA 1 μL(단계 2.4의 상판), 5 μL의 2x 마스터 믹스(2xPCR 완충액, 4 mmol/L MgCl 2, 0.4 mmol/L 2'-deoxyribonucleoside 삼인산염(dNTPs), 및 50 U/mL Taq DNA 1μl, 각 50 μL Taq DNA μmol/L 프라이머, 뉴클레아제 프리 워터를 사용하여 최종 부피를 최대 10 μL까지 만든다.</li>
		<li>그라데이션 가능 열 블록을 사용하여 각 대상 단편에 대한 최적의 어닐링 온도를 결정합니다: 94°C에서 5분, 94°C에서 30s의 40사이클, 52-62°C에서 30초, 72°C에서 30초 , 72°C에서 8분 동안 최종 연장하고 16°C에서 홀드한다.</li>
		<li>최적의 어닐링 온도를 측정하기 위해 1% 아가로즈 젤에 앰플리폰을 검사합니다. 참고:최적의 어닐링 온도는 비특이적 증폭 및 프라이머 이화 없이 대상 단편의 특정 증폭을 가능하게 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HRM 분석을 위한 PCR 참고: 단계 2.4에 기재된 바와 같이 추출된 M2 모종의 HRM 호환 플레이트 및 DNA는 PCR용으로 사용된다.<ol>
<li>DNA(상판제) 1 μL, 2x 마스터 믹스 5 μL, 0.2 μl 각각 10μmol/L 프라이머, 10x 형광 염료 1μL의 최종 부피로 PcR을 수행합니다. 각 플레이트에서 하나의 야생 형 (WT) 부모 샘플 과 하나의 네거티브 (DNA없이) 대조군을 포함한다.</li>
		<li>증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 한 방울을 각 우물에 넣으세요.</li>
		<li>1 분 동안 1,000 x g의 접착제 필름과 원심 분리기로 접시를 밀봉하십시오.</li>
		<li>최적화된 어닐링 온도를 사용하여 PCR을 실행합니다. 참고: 몇 가지 경우 형광 염료가 PCR 증폭에 영향을 줄 수 있으므로 PCR 완료 후 염료가 추가됩니다. 이러한 경우에, 염료는 포스트 PCR 변성 및 어닐링에 의해 DNA 가닥으로 통합됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. HRM 스캐닝 및 돌연변이 확인
<ol><li>플레이트에서 접착필름을 제거하고 플레이트를 HRM 기계에 삽입합니다.</li>
	<li>파일 메뉴에서 새로 실행을 선택하거나 화면 상단의 실행 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>55°C ~ 95°C의 용융에 대한 시작 및 종료 온도를 지정합니다. 참고: 첫 번째 실행 후, 용융 온도의 범위는 특정 조각에 대해 결정 될 수있다; 따라서 시간을 절약하기 위해 동일한 조각의 후속 분석을 위해 용융 온도를 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>고분해능 용융 분석을 위해 샘플을 선택하고 음수 제어와 유사한 샘플을 제외합니다.</li>
	<li>용융 곡선을 정규화하여 동일한 시작 및 끝 형광을 갖습니다. 최소 및 최저 최대 온도 커서가 곡선 영역에 있는지 시각적으로 확인합니다.</li>
	<li>기본 설정에서 F(형광의 차이) 수준을 0.05로 유지합니다.</li>
	<li>표준 선택 목록에서 공통 과 변형을 선택하고 일반 민감도를 선택합니다.</li>
	<li>WT를 컨트롤로 사용합니다. WT에서 ≥0.05의 ≥F 값을 가진 샘플은 돌연변이 식물을 포함하는 것으로 간주됩니다.</li>
	<li>
돌연변이 식물의 식별 및 확인.
	<ol>
<li>각 돌연변이 풀이 만들어진 4 개의 식물을 식별합니다.</li>
		<li>알렌 외17에 따라 CTAB 방법을 사용하여 이들 식물의 각각에서 DNA를 추출하는 것은 약간의 변형. 참고: DNase 없는 RNase 및 NaAc는 알렌 외17에의해 기술된 CTAB 방법을 사용하여 DNA를 추출할 때 사용되지 않으며, DNA 품질은 추가PCR 증폭을 위해 충분히 양호하기 때문에. 분광광도계를 사용하여 정량화 한 후 ~ ~ 25 ng / μL의 최종 농도로 DNA를 조정합니다.</li>
		<li>PCR 프라이머를 사용하여 대상 조각을 증폭하고 HRM 분석과 동일하게 프로그래밍합니다.</li>
		<li>앰플리곤의 Sanger 시퀀싱에 의해 특정 분자 병변을 식별합니다. 참고: PCR 증폭이 완료되면, Sanger 시퀀싱을 위해 회사에 앰플리콘을 보냅니다. 분자 병변은 M2 식물과 WT 사이의 서열을 비교하여 확인할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 분자 마커를 가진 선택된 돌연변이의 질 관리
<ol><li>24개의 SSR 마커에 대해 25 ng의 게놈 DNA(CTAB 프로토콜을 사용하여 추출됨), 5 μL의 2x 마스터 믹스, 10 μM SSR 프라이머 각각의 0.2 μL로 최종 부피에서 PCR을 수행합니다.</li>
	<li>다음 프로그램을 사용하여 PCR을 실행: 94°C에서 5분, 94°C에서 30s, 55°C에서 30s, 72°C에서 30s, 72°C에서 최종 연장72°C에서 7분.</li>
	<li>8 % 폴리 아크릴 아미드 젤에 앰플리컨을 분리하고 은 염색18에의해 증폭 된 조각의 다형성을 드러냅니다.</li>
	<li>선택한 변형과 WT의 SSR haplotype을 비교합니다. 참고: 유도 된 돌연변이체는 종종 WT와 동일한 SSR haplotype을 가지고 있으며, 하나 이상의 SSR 마커가 변이체와 WT 사이에 다른 경우, 변이체는 유도된 것이 아니라 유전 적 오염 물질 (예를 들어, 혼합물 또는 교차 된 식물)일 가능성이 높습니다. 돌연변이18.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

TILLING은 유전자 기능 분석 및 작물 사육을 위한 유도된 돌연변이를 식별하기 위한 강력한 역유전 적 도구임이 입증되었습니다. 쉽게 관찰되거나 결정되지 않은 일부 특성의 경우, 고처리량 PCR 기반 돌연변이 검출을 이용한 틸링은 상이한 유전자에 대한 돌연변이를 얻는 유용한 방법이 될 수 있다. HRM-TILLING 방법은 돌연변이 스크리닝을 위해 토마토12,밀11 및 포도나무20의 EMS 돌연변이 집단에서 사용되어 왔다. 이 논문에서는 인델 및 SBS 돌연변이 스크리닝모두에 적용할 수 있는 더 간단하고 강력한 HRM-TILLING이 입증되었습니다.
효율성을 개선하기 위해 DDNA는 시간과 노동력이 많이 소모되고 독성 화학 약제가 필요한 일반 CTAB 방법 대신 SSF 방법을 사용하여 추출되었습니다. Si 등21은</s...

돌연변이는 식물 기능 유전체학 연구 및 새로운 품종의 번식을위한 중요한 유전 자원이다. 전방 유전학 접근법(즉, 돌연변이 선택에서 유전자 복제 또는 다양한 발달에 이르기까지)은 약 20년 전에 유도된 돌연변이의 사용을 위한 주요 및 유일한 방법이었다. 새로운 역유전학 방법의 개발, TILLING (게놈에서 유도 된 국소 병변 을 표적으로) McCallum et al. 1은 새로운 패러다임을 열었고 이후 많은 수의 동물 및 식물 종2에적용되었습니다. TILLING은 기술적으로 어렵거나 비용이 많이 드는 특성(예: 질병 저항성, 미네랄 함량)을 사육하는 데 특히 유용합니다.
틸링은 처음에 화학적 돌연변이원(예를 들어, EMS1,3)에의해 유도된 스크리닝 포인트 돌연변이를 위해 개발되었다. 여기에는 다음 단계가 포함됩니다. DNA 준비 및 개별 식물의 풀링; 표적 DNA 단편의 PCR 증폭; CEL I 뉴클레아제에 의한 PCR 앰플리톤 및 절단의 변성 및 어닐링에 의한 이혈형성; 돌연변이 개인및 그들의 특정 분자 병변의 확인3,4. 그러나 이 방법은 여전히 비교적 복잡하고 시간이 오래 걸리며 처리량이 낮습니다. 더 효율적이고 높은 처리량으로, 삭제 틸링 (De-TILLING)(표1)1,3,5,6,등 많은 수정 된 틸링 방법이 개발되었습니다. 7,8,9,10,11,12.
DNA 이중의 용융 동안형광 변화에 기초한 HRM 곡선 분석은, 돌연변이 스크리닝 및 유전형 분석(13)을 위한 간단하고비용 효율적이며 높은 처리량 방법이다. HRM은 이미 EMS 돌연변이 유발 에 의해 유도된 SBS 돌연변이를 스크리닝하기 위한 HRM 기반 틸링(HRM-TILLING)을 포함하는 식물 연구에서 널리 사용되고 있다14. 여기에서, 우리는 쌀에 있는 감마 (γ) 광선에 의해 유도된 돌연변이 (인델 및 SBS 둘 다)의 검열을 위한 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시했습니다.

<table><tbody><tr><td>2&시간; Taq plus PCR Master Mix</td><td>Tiangen, 중국</td><td>KT201</td><td>PCR 증폭을 위한 dNTP 및 중합효소</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Bio-rad, 미국</td><td>MSP-9651</td><td>HRM 분석에서 PCR을 위한 특정 플레이트</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>6333000073</td><td>PCR 증폭</td></tr><tr><td>LightScanner</td><td>Idaho Technology, 미국</td><td>LCSN-ASY-0011</td><td>형광 샘플링 및 처리</td></tr><tr><td>CALL-IT 2.0</td><td>Idaho Technology, 미국</td><td></td><td>형광 변화 분석을 위한</td></tr><tr><td>EvaGreen</td><td>Biotium, 미국</td><td>31000-T</td><td>HRM Nanodrop 2000의 형광 염료</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific, 미국</td><td>ND2000</td><td>DNA 정량화를 위해</td></tr></tbody></table>

쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

게놈에서 표적 유도국부 병변 (TILLING)은 유도된 돌연변이의 높은 처리량 스크리닝을 위한 역유전학의 전략이다. 그러나 TILLING 시스템은 삽입/삭제(Indel) 검출에 대한 적용가능성이 적으며, 전통적인 틸링은 CEL I 뉴클레아제 소화 및 겔 전기 영동과 같은 보다 복잡한 단계를 필요로 합니다. 처리량 및 선택 효율을 개선하고 인델 및 단일 베이스 대체(SBS)의 스크리닝을 가능하게 하기 위해 새로운 고해상도 용융(HRM) 기반 틸링 시스템이 개발되었습니다. 여기에서, 우리는 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시하고 돌연변이 검열에 있는 그것의 응용을 보여줍니다. 이 방법은 고온에서 이중 가닥 DNA의 변이를 측정하여 PCR 앰플리컨의 돌연변이를 분석할 수 있습니다. HRM 분석은 추가 처리 없이 PCR 후 직접 수행됩니다. 또한 간단하고 안전하며 빠른 (SSF) DNA 추출 방법은 HRM-TILLING과 통합되어 인델과 SBS를 모두 식별합니다. 단순성, 견고성 및 높은 처리량은 쌀 및 기타 작물의 돌연변이 스캐닝에 잠재적으로 유용합니다.

HRM 스캐닝 및 분석
총 4,560M2 묘목에서 1,140개의 풀링된 DNA 샘플을 생산하고 PCR 증폭을 실시하였다. 195 bp 및 259 bp의 크기의 두 단편은 각각 OsLCT1 및 SPDT에대해 증폭되었다(표 2). 대부분의 시료는 WT(ΔF &lt; 0.05)와 크게 다르지 않은 용융 곡선을 가졌다. WT(ΔF &gt; 0.05)와 현저히 다른 HRM 곡선은 소프트웨어에 의해 WT와 다른색상으로 그룹화되었다(그림 1).
돌연변이 확인 및 빈도
개별 묘목으로부터의 DNA 샘플을 증폭에 사용하였고, 각각의 단편을 서열화하였다. 유전자에 대한 돌연변이 유형 및 위치는 시퀀싱 크로마...

이 문서에서는, 우리는 고분해능 용융 분석 (HRM) 기지를 둔 표적 유도한 게놈에 있는 국소 병변으로 기술되는 프로토콜을 제시합니다 (TILLING). 이 방법은 DNA 이중의 용융 동안 형광 변화를 이용하고 삽입 / 삭제 (Indel) 및 단일 염기 서브 스티션 (SBS)의 높은 처리량 스크리닝에 적합합니다.

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

그것은 기술적으로 어렵거나 질병 저항, 미네랄 함량과 같이 결정되기 위하여 비용이 많이 드는 특성을 사육하기 위하여 아주 유용할 것입니다. 그것은 매우 간단하고 비용 효율적이며 처리량이 높은 기술입니다. 시작하려면 4 개의 잎 디스크를 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 놓습니다.버퍼 A 솔루션 50밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 접시를 영하 80도 냉동고에 10분간 동결합니다. 그런 다음, 상온에서 접시를 동결.섭씨 95도에서 10분간 배양하세요. 버퍼 B 50마이크로리터를 각 웰에 넣고 소용돌이에 잘 섞습니다. 1, 500 배 g에서 1 분 동안 접시를 원심 분리합니다.PCR에 대한 DNA로 상체를 수집합니다. 먼저, PCR 템플릿과 함께 하나의 DNA 상체를 사용하여 어닐링 온도를 최적화합니다. 시약과 각 PCR에 DNA 상수제 1편을 잘 넣습니다.PCR 튜브를 그라데이션 가능 열 블록에 배치하고 원고에 따라 가열 프로그램을 조정하여 각 대상 단편에 대한 최적의 어닐링 온도를 결정합니다. 1%아가로즈 젤에서 PCR 제품에 대한 전기전도를 수행하여 앰플리턴을 검사합니다. 대상 조각의 특정 증폭을 가능하게 하는 최적의 어닐링 온도를 결정합니다.HRM 분석을 수행하기 위해 HRM 호환 플레이트의 각 웰에 10배형광염과 DNA 상주체의 마이크로리터 1개를 포함한 시약을 결합합니다. 각 플레이트에 야생형 부모 샘플 1개와 DNA 없이 1개의 네거티브 컨트롤을 포함합니다. 증발을 방지하기 위해 각 우물에 미네랄 오일 한 방울을 추가합니다.그런 다음 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 원심분리기를 1, 000배 g에서 1분간 밀봉합니다. 최적화된 어닐링 온도를 사용하여 PCR을 실행합니다. 이제 플레이트에서 접착 필름을 제거하고 플레이트를 HRM 기계에 삽입합니다.소프트웨어에서 파일 메뉴에서 새 실행을 선택하거나 화면 상단의 실행 버튼을 누릅니다. 55~95도의 용융 온도에 대한 시작 및 종료 온도를 지정합니다. 고해상도 용융 해석을 위해 샘플을 선택하고 음수 제어와 유사한 샘플을 제외합니다.용융 곡선을 정상화하여 동일한 시작 과 종결 형광을 갖습니다. 시각적으로 낮은 최소 및 낮은 최대 온도 커서가 곡선의 영역에 있는지 확인합니다. 델타 F, 형광의 차이, 05의 기본 설정에서 수준을 유지합니다.표준 선택 목록에서 공통 및 변형을 선택하고 일반 감도를 선택합니다. H12를 선택하여 야생 유형을 컨트롤로 사용합니다. 델타 F 값이 05보다 큰 샘플은 돌연변이 식물을 포함하는 것으로 간주됩니다.그런 다음, CTAB 방법을 사용하여, 용융 곡선이 야생 유형과 크게 다른 돌연변이 풀에서 4개의 식물 각각에서 DNA를 추출한다. 분광계를 사용하여 정량화 한 후, 나노 드롭 2000을 사용하여 DNA를 마이크로 리터 당 약 25 나노 그램의 최종 농도로 조정합니다. PCR 튜브의 DNA 샘플에 PCR 프라이머 0.4 마이크로리터를 추가하고 열 사이클러에 배치하고 대상 단편을 증폭시키기 위해 프로그램을 조정합니다.그런 다음 PCR 제품을 시퀀싱을 위해 회사에 보냅니다. Sanger 시퀀싱 후 M2 식물과 야생 유형 사이의 서열을 비교하여 분자 병변을 비교합니다. 이 연구에서, OSLCT1 또는 SPDT 유전자에 있는 돌연변이를 위한 M2 묘목의 HRM 스캐닝 및 분석은 대부분의 견본이 델타 F 가 05 미만을 가진 야생 모형과 현저하게 다르지 않은 융 곡선이 있었다는 것을 보여주었습니다.돌연변이는 각각 섭씨 90~92도, 섭씨 81.5도에서 83.5도의 온도에서 델타 Fs가 05보다 큰 HRM 곡선을 보였습니다. 4, 560 M2 묘목에서 유전자에 대한 돌연변이 유형 및 위치는 시퀀싱 크로마토그램에 의해 확인되었다. OsLCT1의 4, 304기원쌍에서 G를 A로 돌연변이하는 이종구스 부위가 확인되었다.하나의 단일 뉴클레오티드 A 삽입은 OsLCT1의 4, 240기원쌍에 나타났으며, TTC 트리뉴클레오티드 결실은 사민T의 5, 948 에서 5, 950염의 위치에서 관찰되었다. HRM 분석 전에 PCR을 최적화합니다. 젤의 염료는 약간 유해합니다.젤을 실행할 때 장갑을 착용하는 것을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

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어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한

기재된 것은 돌연변이원으로서 에틸 메탄설포네이트(EMS)를 사용하는 작은 곡물 작물에서 게놈(TILLING) 집단의 표적화 유도국소 병변을 개발하기 위한 프로토콜이다. 또한 Cel-1 분석규를 이용한 돌연변이 검출프로토콜이 제공된다.

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게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

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