Name: 철갑상어 지느러미와 턱뼈 매트릭스에서 코티솔 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 학습하세요 철갑상어 지느러미와 턱뼈에서 코티솔을 추출하는 방법을 ELISA 분석을 통해 확인하세요. 이 기술은 도살된 동물의 스트레스 지표로 턱뼈 코티솔 활용 가능성을 보여줍니다.

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이 사업은 농업과학기술개발협력연구프로그램(프로젝트제목: 기후변화에 의한 축산생산성변화분석, 프로젝트번호)의 지원으로 진행되었다. PJ012771), 한국 농촌진흥청. 또한, 이 연구는 보조금에 의해 지원되었다 (아니오. PJ01344604) 동물영양생리학과, 국립동물과학원, RDA, 서울, 대한민국. 저자는 감사페르시아 제스처 CEO 모하마드 하산 살만자데와 그의 팀을 인정, 누가이 연구에서 검사 세 철갑상어 종에서 물고기를 제공.

다음 실험 절차와 방법은 강원대학교 춘천대학교 동물복지윤리청의 승인을 받았습니다.
1. 핀 컬렉션
<ol><li>그물을 사용하여 철갑상어를 부드럽게 캡처하여 부상과 스트레스를 최소화하십시오.</li>
	<li>생선을 깨끗한 물로 조심스럽게 헹구고 안락사 전에 흡수성 수건으로 몸 표면을 닦아냅니다.</li>
	<li>물고기가 기절하거나 의식을 잃게되도록 플라스틱 망치를 사용하여 물고기의 머리를 명중. 칼을 사용하여 머리를 제거합니다.</li>
	<li>체중(g)과 길이(cm)를 측정합니다.</li>
	<li>안락사 후, 멸균 수술 가위를 사용하여 가능한 한 몸에 가깝게 절단하여 지느러미 샘플을 수집합니다. 참고: 각 생선에 대해 재활용되지 않은 흡수성 수건을 사용해야 합니다. 본 연구에서 사용된 종에 대한 설명 통계는 다음과 같다: 벨루가 철갑상어(H. huso):연령 = 18±2.1 개월, 체중 = 2,700±300 g, 및 체길이 = 55±5 cm; 시베리아철갑상어(A. baerii):나이 = 9.6±2.4개월, 체중 = 1,750±250 g, 및 체길이 = 45±5 cm; 세브루가 철갑상어(A. 스텔라투스):나이 = 14 ± 1.3 개월, 체중 = 1,000 ± 100g, 몸 길이 = 65 ± 5 cm.</li>
</ol>2. 코티솔 추출을위한 핀 준비
<ol><li>핀 샘플(티슈당 샘플 1개: ~3g)을 실험실 계량 용지(107mm × 210mm)에 놓고 건조될 때까지 며칠 동안 실온에서 건조시십시오.</li>
	<li>샘플을 알루미늄 호일 시트에 싸서 라벨이 부착된 비닐 봉지에 담아 실험실로 옮김을 옮김을 합니다.</li>
	<li>세척, 코티솔 추출, 건조 및 ELISA 분석을 포함하여 추가 사용을 위해 냉장고에 샘플을 저장합니다(그림2).</li>
</ol>3. 핀 코티솔 분석
<ol><li>디지털 분석 스케일(정확도: 0.0001)을 교정하고 스케일 팬의 계량 용지로 300±10 mg 샘플을 계량합니다.</li>
	<li>샘플을 씻으시다.<ol>
<li>각 샘플을 15L 원엽 폴리프로필렌 튜브로 옮김. 5,000 μL 단일 채널 파이펫을 사용하여 각 튜브에 3 mL의 이소프로판올을 추가합니다.</li>
		<li>코티솔을 씻어 내고 잠재적 인 외부 오염을 제거하기 위해 2.5 분 동안 80rpm에서 튜브를 돌십시오. 이 절차를 두 번 반복합니다.</li>
		<li>세척된 시료를 실온(22-28°C)에서 7일 동안 공기 건조시켰다.</li>
		<li>세척제로 초순수를 사용하여 세척 절차를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뼈 절단 집게를 사용하여 신체 조직에서 턱뼈를 추출합니다. 턱뼈 샘플에 단계 1.5-3.2.4를 적용합니다.</li>
	<li>32분 동안 50Hz에서 비드 비터를 사용하여 말린 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 계량(75±5 mg)합니다.<ol>
<li>100 μL 파이펫을 사용하여 분말 핀 또는 턱뼈를 함유한 각 튜브에 1.5 mL의 메탄올을 전달합니다. 샘플을 튜브 회전자(40rpm)에서 실온에서 18시간 동안 천천히 회전하여 코티솔을 추출하여 연속 혼합합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>코티솔 추출 후, 실온에서 10 분 동안 9,500 x g의 샘플을 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 각 샘플에서 코티솔 (1 mL)을 함유 한 상부 유기 층을 수집하고 별도의 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 넣습니다.<ol>
<li>메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 인큐베이션하여 시료를 건조시다. 추출된 코티솔 샘플을 하룻밤 동안 연기 후드 아래에 보관하여 메탄올이 소멸되도록 합니다. 참고 : 코티솔 함유 층은 일반적으로 색상이 황색입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 핀 코티솔 검출
<ol><li>ELISA 키트를 사용하기 전에 건조된 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 실온에서 1.5시간 동안 해동합니다.</li>
	<li>15분 동안 1,500 x g에 인산염 완충제, 소용돌이 및 원심분리기를 400 μL 추가합니다.</li>
	<li>분석 정확도와 신뢰성을 향상시키기 위해 중복으로 각 샘플 (25 μL)을 실행합니다. 표준 곡선 외부의 데이터를 이상값으로 제거합니다.</li>
	<li>마이크로플레이트 리더를 450 nm로 설정한 다음, μgdL-1로 설정하고 플레이트의 광학 밀도를 판독한다.<ol>
<li>4매개변수 비선형 회귀 곡선 맞춤이 있는 마이크로플레이트 소프트웨어를 사용합니다. 다음 방정식을 사용하여 소프트웨어에서 얻은 샘플의 코티솔 수준을 pg mg-1로 변환합니다. F = 10,000E(A/B) (C/D), 여기서 F=핀 코티솔 수준의 최종 값(pgmg-1),E=건조 추출물을 재구성하는 데 사용되는 분석 버퍼의 부피(mL), A=분석 출력에 의해 제공되는 농도(μgdL-1),B=추가 를 실시한 핀의 중량(mg)을 ction, C =분말 핀에 첨가된 메탄올의 부피(mL)를, D=메탄올의 부피(mL)를 추출물로부터 회수한 후이어서 건조시켰다 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.통계분석
<ol><li>세척 절차 전에 각 샘플을 두 개의 하위 샘플로 나눈 다음 ELISA 키트 분석(샘플당 2 × 2 = 4 관측값) 동안 중복으로 실행하여 테스트의 힘과 결과의 신뢰성을 향상시킵니다.</li>
	<li>SAS 소프트웨어 환경에서 일반 선형 모델(GLM) 절차를 측정데이터(18)에적용하여 두 세척 용매와 이들의 상호작용의 효과를 비교한다.</li>
	<li>p & 0.05의 유의 수준에서 Tukey의 테스트를 사용하는 수단 간의 테스트 차이. 0.05 <lt;0.10을 유의한 차이보다는 경향의 증거로 받아들입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cortisol%3A+a+novel+biomarker+of+hypothalamic-pituitary-+adrenocortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cortisol+study%3A+facial+hair+and+nails%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroids+Hormonal+Sciences%22%5BJournal%5D)">A cortisol study: facial hair and nails.</a> Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).</li>
<li>Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+analysis+of+cortisol+from+human+and+monkey+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).</li>
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<li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wool+cortisol+is+a+better+indicator+of+stress+than+blood+cortisol+in+ewes+exposed+to+heat+stress+and+water+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction.</a> Animal. 8, 128-132 (2014).</li>
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<li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+hair+and+blood+cortisol+in+sheep+and+dairy+cattle+using+RIA+and+ELISA+assay%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Rhythm+Research.+Accepted%22%5BJournal%5D)">Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison.</a> Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

철갑상어는 지난 천년 동안 몇 가지 적응을 전시했기 때문에 때때로 "살아있는 화석"이라고합니다. 철갑상어 속 Acipenser는 캐비어를 생산하는 27 종을 포함; 그러나, 세 종 (벨루가, baerii, 세브루가) 글로벌 캐비어 공급의 대부분을 생산하고 있습니다. 철갑상어는 자연 서식지에서 의 외낚시와 간섭에 취약하기 때문에 다른 어떤 종보다도 더 심각한 멸종 위기에 처해 있습니다. 철갑상어는 1억 5천만 년 동안 존재해 온 가장 오래된 살아있는 척추동물 그룹에 속합니다. Acipenser 종 성숙 하 고 천천히 성장; 일부 (예를 들어, H. huso)100 년 동안 살 수 있고 무게2,000kg을 초과할 수 있습니다. 철갑상어는 비늘이 없는 연골 물고기이며, 입 앞에 있는 스큐와 촉각 바벨이라고 불리는 5열의 큰 뼈판이특징입니다(그림 1). 이 종과 그밖 물고기 사이 생리적인 다름은 환경 스트레스에 감소된 플라즈마 (코르티...

코티솔은 동물의 스트레스를 신뢰할 수 있는 지표입니다. 코 티 솔 추출 스트레스 수준에 스트레스 수준 및 일반적인 패턴을 모니터링 하는 연구원에 대 한 유효한 프레임 워크를 제공 합니다. 예를 들어, 이전 연구는 인간1,2,원숭이3,4,가축5,양6,및 다양한 방법을 사용하여 모발 코티솔 측정의 방법론적 검증을 수행하였다. 금붕어7,8. 물고기 종에서, 비늘 등 매트릭스에서 코 티 솔 측정, 피부 점액, 대변, 그리고 혈액9 물고기 건강에 대 한 정보를 제공 하기 위해 표시 되었습니다. 혈액 샘플링이 문제가 있거나 비늘이 부족할 때, 코티솔 추출을 위한 대체 매트릭스가 필요합니다. 물고기에서, 대체 행렬은 턱뼈, 인간의 치아와 유사한 단단한 조직을 포함할 수있다(10).
생선 스트레스 수준을 결정하는 새로운 행렬 및 검증 된 기술의 개발은 외과 의사가 환경 스트레스 요인에 장기간 노출을 경험할 수있는 캐비어 산업에 특히 관심이 있습니다11. 철갑상어의 성별은 2 세 이전에 결정 될 수 없으며 외과 의사는 비늘이 없습니다. 코티솔은 성장단계2, 7,12동안 고체 행렬에 점차 적으로 축적하기 때문에 지느러미와 턱뼈와 같은 단단한 매트릭스의 장기 코티솔 축적 데이터는 스트레스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 다른 성장 단계에서 수준. 대조적으로, 혈액 코티솔 수준은 죽음의 시간에 긴장 수준의 스냅 샷을 제공하고 정확하게 장기 양육 조건 동안 스트레스를 나타낼 수 없습니다13,14. 캐비어 시장에서 경쟁이 치열해짐에 따라 장기 사육 기간(8-12년 이상)동안 철갑상어 종중 건강한 계란 생산을 위한 스트레스 조건을 개선하기 위한 새로운 접근법이 점점 더 중요한 연구 분야입니다. 철갑상어의 높은 비용으로 인해, 수확 된 샘플은 매우 비용이 많이 듭니다 (종과 성장 단계에 따라 성숙한 물고기 당 $ 8,000-15,000), 연구 프로젝트의 제한 요소. 그러나, 철갑상어 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 적절한 기술의 개발은 양식과 소비를 위한 철갑상어 계란의 수확을 향상시키기 위하여 어류 양식 시스템 및 야생 물고기에 둘 다 유용하게 적용될 수 있었습니다 보존.
신뢰할 수있는 결과6을제공 할뿐만 아니라 적절한 코티솔 추출 기술을 선택하는 것은 시료 준비 중에 매트릭스에 존재하는 다른 화합물이 출력을 혼동하지 않도록하는 것이 매우 중요합니다. 일치하지 않는 결과. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수치가 주변 물의 호르몬 수치에 영향을 받는지 여부를 결정하는 것이 똑같이 중요합니다. Heimbürge 외15 요인의 숫자는 나이 포함 하 여 코 티 솔 수준에 영향을 미칠 수 있습니다 제안, 성별, 임신, 시즌, 색상12,그리고 코 티 솔 추출 되는 신체 영역16. 그러나, 생선 체내에서 코티솔 추출에 대한 용매 세척의 효과에 대한 정보는 거의없으며,철갑상어 계란17을제외하고는 철갑상어에서 이러한 효과에 대해서는 전혀 알 수 없다.
철갑상어의 지느러미와 턱뼈에서 기준선 코티솔 수준을 분석하는 것은 물고기를 안락사시켜야 하지만, 이 접근법은 살아있는 외과 의사에서 혈액 샘플링에 필요한 침습적 기술을 수반하지 않습니다. 지느러미 및 턱뼈 샘플은 쉽게 수집되며 이러한 조직에서 추출하면 신속하게 수행 할 수 있습니다. 마찬가지로, 호르몬 추출 및 분석간단 하 고 거의 전문된 장비를 필요로.
이 연구에서는, 우리는 이 행렬에서 측정된 코티솔 수준이 응력으로 안정적으로 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로, 물고기 지느러미및 턱뼈에서 코티솔의 추출, 세척 및 측정을 위한 새롭고 쉽게 적용된 기술을 제시합니다. 지표. 이 기술의 장점은 쉽고 비 침습적인 8 접근 법, 적은 데이터 변화 및 신뢰할 수있는 출력1,6,8,17을포함한다; 이 기술은 철갑상어와 같은 비늘이없는 물고기 종에 적용 할 수 있습니다. 이 기술은 물고기의 도살, 적절한 세척용매의 선택2,4,샘플3, 5,전문 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)의 적절한 연삭을 필요로한다. 응용 프로그램5,7, 고체 행렬에 코티솔 소스의 통합의 광범위한 지식6.
두 개의 다른 세척 용매 (초순수 및 이소 프로판올)를 적용하여 세 가지 철갑상어 종에서 지느러미의 기저 코티솔 수준을 얻었습니다 : 벨루가(후소 후소),시베리아(Acipenser baerii),그리고 세브루가(A. stellatus) ), 각 종에 대한 표준 환경 조건하에서. H. huso의 턱뼈는 또한 외과 의사에 있는 응력 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이것은 철갑상어 턱뼈에 있는 코티솔 수준을 측정하는 첫번째 연구 결과입니다. 이 연구의 결과는 초기 성장 단계에서 철갑상어 종에 대한 비교 코티솔 데이터를 제공 할 것입니다 (~ 1 년) 섹스 결정 하기 전에.

<table><tbody><tr><td>폐기 라텍스 수술용 장갑</td><td>Ansell</td><td>63754090</td><td></td></tr><tr><td>플랫폼 저울-전자 중량 측정 100kg</td><td>Baskoolnikoo</td><td>101 EM</td><td></td></tr><tr><td>최대 24mL</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>35-7550</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 플레이트 리더(450nm 및 490 - 492nm 기준 필터 포함</td>) <td>BioTek</td><td>8041000</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장 용액</td><td>BrandTech</td><td>703459</td><td></td></tr><tr><td>지퍼 보관 비닐 봉지&nbsp;</td><td>Cleanwrap</td><td>30cm x100m</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필알코올</td><td>대정화학& 금속&nbsp;</td><td>5035-4400</td><td></td></tr><tr><td>메틸알코올</td><td>대정화학공업 금속&nbsp;</td><td>5558-4100</td><td></td></tr><tr><td>튜브 로테이터- MX-RL-Pro</td><td>DLAB Scientific&nbsp;</td><td>824-222217777</td><td></td></tr><tr><td>1.5 및 10 mL</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>M21518D</td><td></td>를 제공하는 정밀 피펫</tr><tr><td>&nbsp; 15 및 25 &mu를 전달하는 정밀 피펫; L</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>R25623C</td><td></td></tr><tr><td>계량지 (107 x 210 mm)</td> <td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>비드 비터, 50/60 Hz 2A</td><td>GeneReach Biotechnology Corp</td><td>tp0088</td><td></td></tr><tr><td>500 rpm 궤도 가능한 플레이트 로테이터</td><td>Hangzhou Miu Instrument&nbsp;</td><td>MU-E30-1044</td><td></td></tr><tr><td>일회용 폴리프로필렌 튜브는 최소 24 mL를 수용할 수 있습니다</td>. 현대 <td>마이크로&nbsp;</td><td>H20050</td><td></td></tr><tr><td>연기 후드</td><td>Kwang Dong Industrial</td><td>KD 901-22128175</td><td></td></tr><tr><td>1500 x g Labo Gene이 가능한 마이크로 원심분리기</td><td></td><td>; 9.900.900.729</td><td></td></tr><tr><td>미니 소용돌이 믹서</td><td>LMS</td><td>VTX-3000L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>롯데 알루미늄 호일 롤&nbsp;</td><td>롯데 알루미늄</td><td>B0722X5FK5</td><td></td></tr><tr><td>디지털 스케일</td><td>메틀러 톨레도&nbsp;</td><td>&nbsp; ME204</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>MDM</td><td>MDM-0110</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>REF 2100.N</td><td></td></tr><tr><td>대형 어망</td><td>연못 H2O</td><td>Hoz135&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>타액 코르티솔 키트</td><td>Salimetrics</td><td>1-3002-4</td><td></td></tr><tr><td>뼈 절단 펜치</td><td>Sankyo</td><td>26-188A</td><td></td></tr><tr><td>정밀 다채널 피펫으로 50 &mu; L 및 200 &mu; L</td><td>VITLAB</td><td>18A68756</td><td></td></tr><tr><td>수건</td><td>Yuhan Kimberly</td><td>1707921546</td><td></td></tr><tr><td>티슈 페이퍼 (107 &times; 210)</td><td>Yuhan Kimberly</td><td>41117</td><td></td></tr></tbody></table>

철갑상어 지느러미와 턱뼈 매트릭스에서 코티솔 추출

Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices

이 연구의 목적은 두 개의 세척 용매 (물과 이소 프로판올)를 사용하여 철갑상어 지느러미에서 코티솔을 추출하는 기술을 개발하고 세 가지 주요 외과 의사 종 중 지느러미 코티솔 수준의 차이를 정량화하는 것입니다. 지느러미는 벨루가7개(후소후소),시베리아 7개(아시펜서바에리이),세브루가 5개(A.stellatus)등 19척의 희생된 철갑상어에서 수확되었다. 철갑상어는 이란 농장에서 2년(2017-2018년)에 자랐으며, 코티솔 추출 분석은 한국에서(2019년 1월~2월) 실시되었습니다. 5 H. 후소에서 턱뼈는 또한 코티솔 추출에 사용되었다. 데이터는 SAS 환경에서 의 일반 선형 모델(GLM) 프로시저를 사용하여 분석하였다. 변이의 인트라-및 인터-분석 계수는 각각 14.15 및 7.70이었다. 간단히, 코티솔 추출 기술은 용매 (초순수 및 이소프로판올)의 3 mL로 시료 (300 ± 10 mg)를 두 번 세척하고, 80rpm에서 2.5 분 동안 회전하고, 7 일 동안 실온 (22-28 °C)에서 세척 된 샘플을 공기 건조하고, 추가 건조를 포함했습니다. 50 Hz에서 비드 비터를 사용하여 32 분 동안 시료를 분말로 분쇄하고 건조 된 분말 (75 ± 5 mg)에 1.5 mL 메탄올을 적용하고, 연속 혼합으로 실온에서 18 시간 동안 느린 회전 (40 rpm)을 적용합니다. 추출 후, 샘플을 원심분리(10분 동안 9,500 x g)하고, 1 mL 상급제를 새로운 미세원심지 튜브(1.5 mL)로 옮겼고, 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 배양하고, 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 분석하였다. . 종 사이 핀 코 티 솔 수준에서 또는 세척 용매 사이 지 느 러 미와 턱뼈 코 티 솔 수준에서 차이가 관찰 되었다. 이 연구의 결과는 철갑상어 턱뼈 매트릭스가 단단한 행렬에 유망한 대체 응력 지표이다는 것을 보여줍니다.

제시된 지느러미 코티솔 추출 기술은 3개의 철갑상어 종을 사용하여 이 연구에서 개발되고 확인되었습니다. 세척 용매로서 초순수 및 이소프로판올을 사용하여 얻은 코티솔 수준을 비교하였다(도2). H. huso 턱뼈에서 코티솔은 철갑상어 턱뼈가 지느러미에 대한 대체 매트릭스로 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 검사되었습니다. 세척 용매, 철갑상어 종 및 이들의 상호 작용의 효과는 표 1에나타내있습니다. 코티솔 수준은 물로 세척한 것보다 이소프로판올로 세척된 핀 샘플에서 더 높은 경향이 있었다(p = 0.089). 철갑상어 종 중 지느러미 코티솔 수준 (p = 0.525)에는 유의한 차이가 없었습니다. 세척 용매와 철갑상어 종 사이에 유의한 상호 작용이 없었다 (p = 0.947). 세척 용매는 H. 후소 외과 (p = 0.45)에서 코티솔 수준에 유의한 영...

이 연구에서는, 우리는 철갑상어 종의 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수준은 ELISA 검소에 선행된 2개의 세척 용매를 비교하여 더 조사되었습니다. 이 연구는 새로운 스트레스 지표로 턱뼈 코티솔의 타당성을 시험.

The aims of this study were to develop a technique for the extraction of cortisol from sturgeon fins using two washing solvents (water and isopropanol) ...

우리의 방법은 새로운 비 플롯 및 머리 행렬에서 코티솔을 측정하기위한 수많은 미래 연구를위한 플랫폼이 될 수있는 새로운 대체 스트레스 지표를 소개합니다. 이 기술의 장점은 단순함과 도살 된 동물에서도 스트레스 수준을 평가하는 데 사용할 수있는 능력입니다. 이 기술을 사용하여 높은 코티솔 수준과 건강한 동물 또는 인간 사이의 관계를 확립하는 것은 일부 질병의 진단에 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 또한 견본 수명 내의 응력 수준을 평가하기 위하여 이 오래된 화석과 같은 수백 년 오래된 생물학 견본을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 코티솔 추출의 경우, 개별 15 밀리리터 원모 튜브에 샘플을 배치하기 전에 0.0001 정확도로 디지털 분석 척도에서 각 샘플의 300 플러스 또는 마이너스 10 밀리그램을 무게. 각 샘플 튜브에 3 밀리리터의 이소프로판올을 추가하고 코티솔을 씻어 내고 잠재적인 외부 오염을 제거하기 위해 분당 80 회전에서 튜브를 회전시 2.5 분 동안 회전합니다.마지막 세척 후, 공기는 각 세척에 대한 신선한 초순수수를 사용하여 입증된 바와 같이 샘플을 세번 더 세척하기 전에 7일 동안 실온에서 샘플을 건조시합니다. 75 플러스 또는 마이너스 5 밀리그램의 말린 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 계량하고 비드 비터를 사용하여 32 분 동안 50 hertz에서 샘플을 갈아 드셔 보십니다. 그런 다음, 가루 지느러미 또는 턱뼈의 각 튜브에 메탄올1.5 밀리리터를 전달하고 실온에서 18 시간 동안 분당 40 회전에서 튜브 회전기에 샘플을 배치합니다.코티솔 추출 후, 원심분리에 의한 샘플 조직을 퇴적시한다. 그리고 각 샘플에서 층을 포함하는 황색, 유기 코티솔의 상단 1 밀리리터를 개별 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 옮킨다. 코티솔 샘플을 밤새 연기 후드에서 섭씨 38도에서 건조하여 메탄올을 증발시다.다음 날 아침, 각 튜브와 소용돌이에 PBS 의 400 마이크로 리터를 추가하고 코티솔을 수집하기 위해 샘플을 원심 분리합니다. ELISA 분석을 위해 추출된 각 표준 코티솔 샘플25마이크로리터를 96웰 ELISA 플레이트의 적절한 우물에 복제하여 적재합니다. Assay 희석제 25마이크로리터를 두 개의 우물에 로드하여 0으로, 각 비특이적 결합에 잘 작용합니다.효소 컨쥬게이트 15마이크로리터를 분석 희석제 24밀리리터와 혼합하고 각 우물에 200마이크로리터의 공주를 추가합니다. 분당 500 회전에서 5 분간 회전기에 접시를 섞습니다. 실온에서 1시간 배양이 이어진다.인큐베이션이 끝나면 잘 1x 워시 버퍼300 마이크로리터로 접시를 네 번 씻으시다. 버퍼를 버리고 종이 타월 더미에 접시를 블롯 한 후 재빨리 접시를 싱크대 위에 반전시다. 마지막 세척 후, TMB 기판 용액 200 마이크로리터를 각 우물에 넣고 분당 500 회전시 5분 동안 접시를 회전기위에 놓습니다.혼합 후, 빛으로부터 보호실온에서 25 분 동안 접시를 배양. 인큐베이션이 끝나면 각 웰에 50 마이크로리터의 스톱 솔루션을 추가합니다. 그리고 회전기의 플레이트 내용기를 분당 500 회전에서 3분 간 또는 모든 우물이 녹색에서 노란색으로 바뀔 때까지 섞는다.그런 다음, 샘플의 광학 밀도를 읽고 마이크로 플레이트 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 코티솔 수준을 밀리그램당 피코그램으로 변환합니다. 본 대표적인 분석에서, 코티솔 수치는 물로 세척된 양면 샘플보다 이소프로판올로 세척된 지느러미 샘플에서 더 높은 경향이 있었지만, 유혈구 코티솔 수치에 는 유의한 차이가 철갑상어 종 사이에서 관찰되지 않았다. 세척 용매와 철갑상어 종 사이에는 상당한 상호 작용이 없었습니다.H.Huso 턱뼈에서 코티솔을 검사하여 철갑상어 턱뼈가 지느러미에 대한 대체 매트릭스로 사용될 수 있는지 여부를 판단하여 세척 용매가 H.Huso의 철갑상어에서 측정된 코티솔 수준에 큰 영향을 미치지 않았다는 것을 밝혀졌습니다. 또한, 데이터는 3개의 철갑상어 종의 지느러미 사이 및 H.Huso 턱뼈에서 높은 유사성을 밝혔습니다. 비드 비터를 사용하여 샘플을 미세 분말로 분쇄하고 코티솔 측정을 위해 적절한 상업용 ELISA 분석 키트를 사용하는 것이 중요합니다.코티솔 레벨 측정이 환경이 동물 생물학에 미치는 영향에 대한 중요한 정보를 제공하기 때문에 이 방법은 치아 및 기타 단단한 행렬에서 코티솔을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 인간의 아이 우유 치아와 소아 내분비학, 정신 생물학, 행동, 고고학 및 법의학 연구에서 코티솔 수준을 평가하는 새로운 접근법으로 사용될 수 있습니다.

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연구

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환경

우리는 PTSD 환자의 특징 neuroendocrine 기능의 영구적 인 변경 및 지연, 장기, 과장된 공포 반응을 보여 후 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)의 쥐 모델을 설명합니다. 동물 모델과 여기에 설명 된 방법은 기계론의이지만 주변 흰색 혈액 세포의 생체과 함께, 환자로 측정 할 수없는 뇌 핵에 생체, 수를 상호 연관 유용합니다.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

코르티솔 (CORT)은 인간과 인간이 아닌 영장류의 성장 머리 갱구에 축적. 우리는 높은 정밀도 및 감도로 머리 CORT를 추출하고 분석하는 방법을 설명합니다. 머리 CORT의 측정은 특히 개월 주 기간 동안 만성 스트레스를 평가하기에 적합합니다.

추출 및 인간과 원숭이의 머리에서 코르티솔 분석

혈액 샘플은 생체 내 생리학적 상태나 질병의 바이오마커를 평가하는 데 유용합니다. 여기에서는 쥐의 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링하는 방법론을 설명합니다. 이 방법은 최소한의 통증과 침습성으로 빠른 샘플을 제공합니다.

쥐의 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링

부신 활성은 코르티코스테론 대사 산물에 대한 대변 분석을 통해 말 종에서 평가할 수 있습니다. 이 방법은 국내 및 자유 방목마 모두에서 장기적인 패턴을 평가할 수 있는 비침습적 옵션을 제공합니다. 이 프로토콜은 관련된 효소 결합 면역 분석 및 관련 생화학적 검증에 대해 설명합니다.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

프로토콜의 목표는 철갑상어 사체에서 이석을 추출하는 효과적인 방법을 보여주는 것입니다.

철갑 상어에서 이석 제거의 다른 방법

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기, 우리는 문화 기본 쥐 프로토콜 부 신 셀을 제시. 그것은 부 신 steroidogenesis와 지질 생 합성의 약의 메커니즘을 조사 하기 위한 좋은 생체 외에서 플랫폼을 수 있습니다.

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

우리는 코알라 모피에서 코티솔을 측정하는 최적의 추출 용매를 결정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에 사용되는 용매는 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올이다. 최적의 추출 용매를 결정하면 모피를 안정적으로 측정하여 코알라에 대한 만성 스트레스의 영향을 결정하는 데 도움이 됩니다.

코알라의 코티솔 측정(파스콜아크토시네레우스)모피

해리 된 해마 세포 배양은 신경 과학에서 중추적 인 실험 도구입니다. 산호 골격이 신경 보호 및 신경 조절 역할로 인해 매트릭스로 사용될 때 배양에서 신경 세포 생존과 기능이 향상됩니다. 따라서 산호 기질에서 자란 신경 세포는 더 높은 내구성을 나타내므로 배양에 더 적합합니다.

생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

우리는 단백질의 분해 및 분해를 최소화하는 극저온 냉동고 밀을 사용하여 효모 또는 다른 세포에서 온전세포 추출물의 제조를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 세포 추출물은 기능성 단백질 복합체의 정화, 프로테오믹 분석, 공동 면역 침전 연구 및 음순 단백질 수정의 검출에 적합합니다.

자동 냉동고 밀에서 냉동 분쇄에 의한 세포 추출물 준비

이 프로토콜은 중세 개인의 5가지 다른 골격 요소(방사성 탄소, 약 1040-1400 CE, 보정된 2-시그마 범위)에 걸쳐 8개의 권장 해부학적 샘플링 위치(주어진 골격 요소의 특정 위치)에서 뼈 분말을 수집하기 위한 일련의 모범 사례 프로토콜을 제시합니다.

고고학적 유적에서 고대 DNA를 검색하기 위한 최적화된 뼈 샘플링 프로토콜

학습하세요 철갑상어 지느러미와 턱뼈에서 코티솔을 추출하는 방법을 ELISA 분석을 통해 확인하세요. 이 기술은 도살된 동물의 스트레스 지표로 턱뼈 코티솔 활용 가능성을 보여줍니다.

철갑상어 지느러미와 턱뼈 매트릭스에서 코티솔 추출

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