Name: CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 학습하세요 Trypanosoma cruzi 아마스티고테에서 CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃 방법을. 숙주 세포 외 배양 기술로 생장 표현형을 분석하고 기생충 생물학 및 치료 표적 연구에 활용하세요.

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이 작품은 Y.T에 JSPS KAKENHI 교부금 번호 18K15141에 의해 부분적으로 지원되었다.

참고: 전체 실험 흐름에 대한 개요는 그림1에 설명되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59962/59962fig01.jpg"> 그림 1: EA를 사용한 녹아웃 실험개요. 조직 배양 유래 trypomastigotes는 EA로 수확되고 분화됩니다. gRNA는 전기 기공에 의해 Cas9 발현 아마스티고테로 형질전환되고, 녹아웃 아마스티고트의 성장 표현형은 축세포 복제또는 에 의해 평가된다. 호스트 세포 침략 후 세포 내 복제. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59962/59962fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 기생충 문화 준비
<ol><li>트라이파노소마 크루지의 툴라후엔 균주는 이 보고서 전반에 걸쳐 사용된다. LIT 배지에서 T. 크루지의 에피마스티고트 유지(FCS 10%, 보충표 1참조). 뚜껑을 단단히 닫고 배양 플라스크를 28°C로 유지합니다.</li>
	<li>Cas9 엔도누슬리스를 항하는 T. 크루지의 형질전환 균주를 생성합니다. Cas9 코딩 서열 및 G418(neo r) 선택마커를 포함하는 발현 플라스미드의 예는 Lander et al.4 및 Peng et al.5에서 확인할 수 있습니다.
	<ol>
<li>재료표에 열거된 키트를 사용하여 상기 플라스미드를 전기 천공에 의해 에피마스티고트로 트랜스펙트한다. 큐벳 1개에 대해 2 x 107 셀을 스핀다운하고 상류물을 버리고 제공된 보충제 용액을 함유한 100 μL의 전기 천공 완충제로 다시 중단하십시오. 참고: 전기 천공 버퍼는 EM 버퍼 24(사이토믹스25 및 인산염 수크로오스 완충액의 3:1 혼합물)로 치환될 수 있다.</li>
		<li>플라스미드 20-40 μg를 넣고 혼합물을 2mm 간격 전기 화기 큐벳으로 옮긴다. X-14 프로그램26을사용하여 전기 개루 장치(재료 표참조)로 펄스를 적용합니다.</li>
		<li>큐벳 내용물 5mL의 LIT 배지(10% FCS)가 들어 있는 T-25 플라스크에 옮김을 옮김을 옮니다. 24 시간 동안 28 °C에서 플라스크를배양합니다.
</li>
		<li>G418을 최종 농도 250 μg/mL에 추가하고 28°C에서 인큐베이션을 계속합니다. 그것은 비 형질 감염 된 epimastigotes를 죽일 약 1 주 걸립니다. 일단 G418 저항하는 인구가 복구하기 시작하면, 포화를 피하고 죽은 세포를 희석하기 위하여 문화를 일주일에 한두 번 통과합니다. 안정한 세포주의 설치는 일반적으로 총 4 주가 걸립니다. 참고: Cas9의 구성발현이 세포(5)에 대한부담이라면, Cas9 오픈 판독 프레임(27)의 하류에 있는 아마스틴 유전자의 3'-UTR을 즉시하류에 결합시킴으로써 아마스티고테 단계에 특이적인 발현을 한다. 아마스티고테 특이적 Cas9 식 플라스미드에 대한 자세한 설명은 타카기 외22에서 확인할 수 있습니다.
</li>
	</ol></li>
	<li>Cas9-발현 T. 크루지 및 포유류 숙주 세포의 숙주 기생충 공동 배양을 확립한다. 이 보고에서, 숙주로서 3T3-스위스 알비노 섬유아세포 세포를 사용한다.
	<ol>
<li>T. 크루시 에피마스티고테스를 메타사이클 트리포마스티고테스로 차별화합니다. 혈세포계를 사용하여 상피 배양의 세포 밀도를 결정하고 2,100 x g에서 15 분 동안 원심분리에 의해 5 x 107 세포를 수집합니다. 상급체를 버리고 RPMI 배지의 10 mL로 세포를 다시 일시 중단합니다. 1 주28에대 한 28 °C에서 기생충을 배양.</li>
		<li>RPMI 매체에 메타 사이클 트리포 마시고테스를 수집합니다. 조심스럽게 플라스크를 기울이고 바닥 면에 부착 된 기생충을 방해하지 않고 용액을 피펫. 2,100 x g에서 15 분 동안 원원수 튜브와 원심 분리기로 매체를 옮긴다. 상급을 버리고 5 mL의 DMEM (10 % FCS)로 기생충을 다시 중단하십시오. 참고: 기생충 인구는 메타 시크 릭 트리포 마 스티 고테의 혼합물, epimastigotes, 그리고 일부 중간 형태. 필요하지는 않지만 DEAE 이온 교환 크로마토그래피(29)에의해 trypomastigote를 분리 할 수 있습니다. 대안적으로, epimastigotes는 활성 혈청으로 기생충을 배양하여 용해(30)를보완하기 위해 그들을 대상으로 함으로써 제거될 수 있다.</li>
		<li>시드 3T3-스위스 알비노 섬유아세포는 T-25 배양 플라스크에서 DMEM(10% FCS)의 5 mL에서 60-70% 동률, 또는 약 1.7-2.0 x 10 6세포를 나타낸다. 성장 배지를 제거하고 단계 1.3.2에서 기생충 혼합물을 적용합니다. 감염을 확립하기 위해 가습 된 인큐베이터에서 5 %CO2 미만에서 37 °C에서 24 시간 동안 배양하십시오.</li>
		<li>DMEM(10% FCS)과 공동 배양을 세척하여 숙주 3T3 세포 외부에 남아 있는 기생충을 2회 제거한다.</li>
		<li>일단 공동 배양이 포화되면, 트립시네화에 의해 아마스티고테-감염된 숙주 세포를 통로에 감염시다. 배지를 흡인하고 PBS로 배양을 한 번 헹구는다. 전체 배양 표면을 커버하기 위해 0.05% 트립신 용액 의 1 mL을 적용하고, 부착 된 숙주 세포가 느슨해질 때까지 실온에서 몇 분 동안 배양한다. 3 mL의 DMEM (10% FCS)을 세포 위로 플러시하여 플라스크 표면으로부터 세포를 분리합니다.</li>
		<li>분리된 숙주 세포를 원유관으로 옮기고, 300 x g에서 3분 동안 원심분리기를 한다. 상월체를 흡인하고 신선한 DMEM (10 % FCS)의 3 mL로 세포를 재중단시. 이 단계는 남아있는 epimastigotes을 제거하는 데 도움이됩니다. DMEM 9mL(10% FCS)를 함유한 깨끗한 T-75 플라스크에 모두 옮김을 옮니다. trypomastigote 문화 상급으로 출시 될 때까지 배양을 계속.</li>
		<li>일주일에 두 번 트립시니화와 함께 통과하여 공동 문화를 유지합니다. 일단 호스트 인구의 70-80%가 감염되면, 배양 악화를 피하기 위하여 5:1(이월:신선)의 비율로 감염되지 않은 호스트 3T3 세포를 정기적으로 추가합니다. 트리포마스티고테는 숙주 세포와 T. 크루지 사이의 균형이 적절히 유지되는 경우 지속적으로 송신한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. EA로 트리포마스티고테스의 차별화
<ol><li>본 실험 전날, 숙주 기생충 공동 배양의 성장 배지를 제거하고 신선한 DMEM(10% FCS)을 첨가하여 이전에 숙주 세포로부터 이미 방출된 EA 및 trypomastigotes를 씻어낸다. 정기적인 실험은 적어도 두 개의 T-75 플라스크가 필요합니다.</li>
	<li>
원추형 튜브에 배양 상류를 수집하여 갓 출현한 trypomastigotes를 수확합니다. 현미경(10x 또는 20x 대물 렌즈)으로 샘플을 확인하여 품질을 확인합니다. 숙주 세포 파편이있는 경우, 샘플을 잠시 원심 분리하고 상구체를 새 튜브로 옮김. 상당한 수의 EA가 있는 경우, 다음 의 스윔아웃 절차에 의해 trypomastigotes를 격리하십시오.
	<ol>
<li>2,100 x g에서 15 분 동안 trypomastigotes와 아마스티고테스의 혼합물을 스핀 다운하십시오. 튜브에 매체의 0.5-1.0 mL를 떠나, 상류의 대부분을 폐기. 참고: 볼륨을 줄이는 것은 선택 사항이지만 다음 단계를 더 쉽게 만듭니다.</li>
		<li>펠렛을 37°C에서 1-2시간 동안 배양하여 활성 트리포마스티고트가 펠릿에서수영할 수 있도록 합니다(그림 2).</li>
		<li>1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 trypomastigotes를 포함하는 상급을 전송합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원원줄기를 2,100 x g에서 15분 동안 원원분리하여 트리포마스티고테스를 수집한다. 스윔 아웃 절차가 위에서 수행된 경우, 1.5 mL 튜브를 4,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 트립포마스티고테를 펠렛한다. 상급제는 버리십시오.</li>
	<li>20 mM MES (pH 5.0)로 버퍼링 된 DMEM 5 mL로 펠릿을 다시 일시 중단하고 0.4 % BSA19로보충하십시오. T-25 배양 플라스크에 기생충을 전송합니다. 뚜껑을 느슨하게 둡니다. 세포 밀도는 과포화로 세포 사멸의 기회를 증가하기 때문에, 주위 또는 아래 1 x 107 세포 / mL이어야합니다. 참고: DMEM의 색상은 주황색이 아닌 노란색이어야 합니다. 원래 DMEM이 높은 버퍼링 용량을 가졌다면, 20 mM MES(pH 5.0)는 pH를 낮추기에 충분하지 않다. 배지의 pH는 이 경우 HCl을 첨가하여 조절되어야 한다. 산성 배지는 4°C에서 유지될 수 있지만, 1개월 이상 보관할 수 없다.</li>
	<li>가습 된 인큐베이터에서 5 %CO2 미만에서 37 °C에서 배양 플라스크를 배양합니다. 기생충의 약 95%는 24 시간 후에 amastigotes로 분화합니다.</li>
</ol>3. EA의 전기 화
<ol><li>전기 개화를 위해 gRNA를 준비하십시오. 이것은 시험관 내 전사에 의해, 또는 단순히 제조 업체에서 합성 RNA 올리고 뉴클레오티드를 구입하여 수행 할 수 있습니다. 이 보고에서는, 통합 DNA 기술, Inc.에서 crRNA 및 tracrRNA가 이용됩니다.</li>
	<li>2,100 x g에서 15 분 동안 EA의 문화를 원심 분리합니다. 상급을 버리십시오.</li>
	<li>1 x 108 셀 /mL의 최종 세포 밀도에 대한 보충 용액을 포함하는 전기 화 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 참고 : EM 버퍼는 재료표에 나열된 전기 개화 버퍼에 비해 더 많은 세포 사망을 일으킵니다. 따라서, amastigote 형질 감염에 대 한 권장 하지 않습니다 (보충그림1).</li>
	<li>Aliquot 100 μL의 재중단 된 기생충 (1 x 107 세포) 1.5 mL 미세 원심 분리튜브튜브. gRNA 5-10 μg를 넣고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>혼합물을 2mm 갭 전기 화기 큐벳으로 옮니다. X-14 프로그램을 사용하여 전기 천공 장치로 펄스를 적용합니다.</li>
	<li>큐벳 내용물 5mL의 미리 따뜻화된 LIT 매체(10% FCS)가 들어 있는 T-25 플라스크에 옮김을 옮니다. 캡을 느슨하게 두고 5% CO2 미만의 37°C에서 플라스크를배양합니다.
</li>
	<li>축배술의 연속에 의해 세포 성장을 모니터링 (섹션 4) 또는 숙주 세포 감염 후 세포 내 amastigotes로 (섹션 5).</li>
</ol>4. 도끼 아마스티고테스로 녹아웃 세포의 성장을 모니터링
<ol><li>EA는 배양 매체의 바닥에 정착, 그래서 부드럽게 용액에 다시 중단 플라스크를 흔들어. 일부 세포가 플라스크에 부착되기 때문에 파이펫팅으로 플라스크 표면을 세척하는 것이 도움이됩니다.</li>
	<li>프로피듐 요오드화물 (PI) 용액 (20 μg / mL)의 1 μL을 20 μL의 아마스티고테 배양과 섞습니다. 참고: 배양 플라스크를 인큐베이터 외부에 오래 두지 마십시오. 온도는 축증증을 가능하게 하는 요인 중 하나이다22.</li>
	<li>샘플을 혈세포계에 적용하고 형광 현미경으로 관찰하십시오. PI는 손상된 세포막에 permeant하지만 살아있는 세포에서 제외됩니다. PI(예:em 570 nm/602 nm)로 얼룩지지 않는 실행 가능한 아마스티고트 수를 계산합니다.</li>
</ol>5. 세포 내 Amastigotes로 녹아웃 세포의 성장을 모니터링
<ol><li>시드 숙주 3T3 세포를 DMEM(10% FCS)을 가진 12웰 플레이트에서 숙주한다. 세포 밀도를 70-80% 동률또는 웰당 약 3 x 105 셀로 조정합니다. 참고: 아마스티고테는 운동성이 아니기 때문에, 숙주 세포에 의해 성장 표면의 대부분을 덮는 것은 감염 효율을 향상시킨다.</li>
	<li>전기개공 후 1일 원심분리에 의해 3.6단계에서 녹아웃 아마스티고테를 모으자. 상급체를 버리고, 2 mL의 DMEM (10 % FCS)로 기생충을 다시 중단하십시오.</li>
	<li>숙주 세포 배양으로부터 배지를 제거하고 다시 일시 중단된 아마스티고테를 적용한다. 감염의 복합성은 20 이상이어야합니다. 37°C에서 5% CO2 미만에서 2일 동안 배양하여 아마스티고트가 감염을 확립할 수 있도록 하였다. 참고: 감염 기간은 목적에 따라 1 일 수 있습니다.</li>
	<li>씻어 제거 EA는 DMEM (10% FCS)으로 숙주 세포 외부에 두 번 남아 있었다.</li>
	<li>숙주 기생충 공동 배양에 신선한 DMEM(10% FCS)을 첨가하고 추가로 2일 동안 37°C에서 배양을 계속한다.</li>
	<li>
감염 효율을 평가하기 위해 숙주 세포 및 세포 내 아마티고테의 핵을 시각화합니다. 참고: 핵은 포화 된 공동 문화에서 중첩되는 경향이 있습니다. 고정 및 염색 전에 낮은 세포 밀도 (예 : 1 :5 희석)에서 세포를 다시 도금하면 핵을 보다 쉽게 계산하는 데 도움이됩니다.<ol>
<li>배양 배지를 제거하고 1 mL의 1 mL을 PBS에 적용하여 세포를 고치도록 하였다. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>포르말린 용액을 1 μg/mL Hoechst 33342 및 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS 의 1 mL로 교체하십시오. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>Hoechst 용액을 제거하고 PBS로 세포를 한 번 헹구어. 신선한 PBS 1 mL을 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 현미경의 밑에 관찰하고 더 작은 기생충 핵과 연관되는 호스트세포 핵을 확인합니다 (그림 4). 2 개 이상의 amastigotes를 포함하는 호스트 세포는 비생산적인 초기 감염 또는 세척되지 않은 EA를 포함하지 않는 감염으로 간주되어야 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

우리는 T. cruzi amastigotes의 축배양이 Cas9 발현 EA로 직접 gRNA를 전기로 전환해서 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃에서 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 이와 같이, amastigote 단계에서 특히 표적 유전자의 본질성은 다른 발달 단계를 거치지 않고 평가될 수 있다.
amastigote 형질감염의 또 다른 유익한 양상은 많은 표적 유전자를 위한 시험에 있는 편의성입니다. 일단 Cas9 발현 T. cruzi 및 호스트 포유류 세포의 공동 배양이 확립되면, 조직 유래 trypomastigotes를 EA 및 transfect gRNA로 변환하여 녹아웃 아마티고테스를 얻는 데 며칠밖에 걸리지 않습니다. gRNA는 각 표적 유전자에 맞추어야 하는 유일한 물자입니다, 그러나 합성 gRNA는 제조자의 수에서 유효합니다, 그래서 단순히 구입해서 가능합니다. 표적 유전자의 단계 특이적 본질성을 분석하는 대안적인 방법은 유...

Trypanosoma cruzi는 라틴 아메리카1에서주로 널리 퍼진 Chagas'질병의 원인 에이전트입니다. T. cruzi는 곤충 벡터와 포유류 호스트2사이를 이동하는 독특한 라이프 사이클 단계를 가지고 있습니다. T. cruzi 혈액 을 빠는 triatomine 버그의 midgut에 epimastigote로 복제 하 고 인간 또는 동물 호스트에 증착 되기 전에 그것의 뒷글에 감염 성 메타 세포 trypomastigote로 분화. trypomastigote 물린 사이트를 통해 또는 점 막을 통해 호스트 몸으로 되 면, 기생충 호스트 세포를 침공 하 고 amastigote 라는 편모 없는 둥근 형태로 변환. amastigote는 호스트 세포 내의 복제하고 결국 trypomastigote로 분화합니다, 이는 호스트 세포에서 파열하고 다른 호스트 세포를 감염시키기 위하여 혈류를 입력합니다.
현재 이용 가능한 화학치료제, 벤즈니다졸 및 니푸르티목스는 부작용을 일으키고 질병의 만성 단계에서효과가 없기 때문에 3, T. cruzi에 대한 새로운 약물 표적을 식별하는 것이 큰 관심사이다. 최근 몇 년 동안, CRISPR/Cas9 시스템은 GRNA 및 Cas9 4를 포함하는 별도의 또는 단일 플라스미드(들)의 형질전환에의해, Cas9의 안정적인 발현에 의해 T. cruzi에서유전자 녹아웃을 효과적으로 수행할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. gRNA5,6,7 또는 gRNA8의전사 템플릿의 도입, 또는 미리 형성된 gRNA/Cas9 RNP 복합체의 전기화에 의해7,9. 이러한 기술 발전은 Chagas'질병의 약물 표적 연구를 가속화할 것으로 기대됩니다.
약물 개발을 진행하기 위해서는 포유류 숙주에서 기생충의 복제 단계이기 때문에 T. cruzi의amastigote에서 표적 유전자 또는 약물 후보 화합물의 효능의 본질성을 검증하는 것이 중요합니다. 그러나, 이것은 도전적인 작업, 때문에 방해 호스트 세포의 존재에 직접 조작 할 수 없습니다. 리슈마니아에서는 T. cruzi와밀접하게 관련된 원생 동물 기생충, 축아제 배양 방법이 개발되었으며 약물 스크리닝 검거 법제10,11,12, 13. 도끼 아마스티고테와 세포 내 아마스티고테스(14)사이의 화합물에 대한 감수성에 약간의 불일치가 있지만, 축배양을 유지하는 능력은 그럼에도 불구하고 연구할 귀중한 실험 도구를 제공합니다. 리슈마니아15,16의임상적으로 관련된 단계의 기본 생물학 . T. cruzi의경우, 자연적으로 발생하는 세포외 amastigotes의 존재에 관한 문헌 (EA)17 및 EA의 체외 생산17,18,19 거슬러 올라간다 수십 년 전. 또한, EA는 20의 전염성능력을 가지는 것으로 알려져 있으며, 이는 트라이포마스티고테보다 적기는 하지만, 아마스티고테 숙주 침공의 메커니즘은 최근 몇 년 동안 해명되었다(본피엠-멜로 등21). 그러나, Leishmania와는달리, EA는 T. cruzi에있는 실험 적인 공구로 이용되지 않았습니다, EA가 의무적인 세포내 기생충으로 여겨졌기 때문에, 따라서 실용적인에서 "복제 양식"으로 간주되지 않았기 때문에 감각.
최근 우리 그룹은 T. cruzi의 EA를 일시적인 축문화(22)로 활용하자고 제안했다. T. cruzi Tulahuen 균주의 아마스티고트는 37°C에서 LIT 배지에서 숙주 세포의 자유로운 복제를 최대 10일 동안 주요 열화 또는 아마티고테 유사 성질의 손실 없이 복제할 수 있다. 숙주 없는 성장 기간 동안, EA는 기존의 전기천공에 의한 외인성 유전자 발현, 트라이파노시드 화합물을 통한 약물 적정 분석, CRISPR/Cas9 매개 녹아웃에 의한 성장 표현형 모니터링에 성공적으로 활용되었다. 이 보고서에서, 우리는 시험관내에서 유래된 EA를 생산하고 녹아웃 실험에서 축산 아마스티고테를 활용하기 위한 상세한 프로토콜을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>20% 포르말린 용액</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>068-03863</td><td>고정 셀</td></tr><tr><td>25cm2 이중 밀봉 캡 배양 플라스크</td><td>AGC 테크노 글라스</td><td>3100-025</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 이중 밀봉 캡 배양 플라스크</td><td>AGC 테크노 유리</td><td>3110-075</td><td></td></tr><tr><td>올인원 형광 현미경</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (대조군용)</td><td>IDT</td><td>맞춤형</td><td>타겟 염기서열 = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (TcCGM1용)</td><td>IDT</td><td>맞춤형</td><td>타겟 염기서열 = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (TcPAR1용)</td><td>IDT</td><td>맞춤형</td><td>타겟 염기서열 = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td>crRNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector 장치</td><td>LONZA</td><td>AAN-1001</td><td>electroporation</td></tr><tr><td>Basic Parasite Nucleofector Kit 2</td><td>LONZA</td><td>VMI-1021</td><td>electroporation</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>in vitro amastigogenesis</td></tr><tr><td>Burker-Turk 일회용 혈구계</td><td>Watson</td><td>177-212C</td><td>세포 계수</td></tr>를 위한 매체의 구성 요소<tr><td>Coster 12-well Clear TC 처리 다중 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>044-29765</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 정의</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>사용 전 열 비활성화</td></tr><tr><td>G-418 황산염 용액</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>077-06433</td><td>형질전환체</td></tr><tr><td>Hemin chloride 선택</td><td>LIT 매체의</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H-5533</td> 구성 요소</tr>, <tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>염색</td></tr><tr><td>핵 간 주입 국물, Difco</td><td>Becton Dickinson</td><td>226920</td><td>LIT 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>MES</td><td>FUJIFILM, Wako Pure Chemical</td><td>349-01623</td><td>in vitro amastigogenesis PBS용 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>(&ndash;)</td><td>후지필름 Wako Pure Chemical</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>사세포 염색</td></tr><tr><td>RPMI 1646</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>메타사이클로제네시스</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi는 주로 라틴 아메리카에서 Chagas' 질병을 일으키는 원인이 되는 병원성 원생 동물 기생충입니다. T. cruzi에대하여 새로운 약 표적을 확인하기 위하여는, 기생충의 포유류 단계에서 표적 유전자의 본질성을 확인하는 것이 중요합니다, amastigote. T. 크루지의 아마스티고테스는 숙주 세포 내부에 복제; 따라서, 다른 발달 단계를 거치지 않고 녹아웃 실험을 수행하는 것은 어렵다. 최근, 우리 그룹은 아마스티고테가 아마스티고테와 같은 특성을 잃지 않고 최대 10 일 동안 축으로 복제 할 수있는 성장 상태를보고했습니다. 이 시간적인 축 식 amastigote 문화를 사용하여, 우리는 성공적으로 유전자 녹아웃을 일으키는 원인이 되기 위하여 Cas9 표현 amastigote에 직접 gRNA를 소개하고 amastigote 단계에서 독점적으로 그들의 표현형을 분석했습니다. 이 보고서에서, 우리는 시험관 내에서 파생 된 세포 외 amastigotes를 생산 하는 상세한 프로토콜을 설명 하 고 CRISPR/Cas9 중재 녹아웃 실험에서 축 배양 활용. 녹아웃 amastigotes의 성장 표현형은 축세포 배양의 세포 수에 의해, 또는 숙주 세포 침략 후에 세포 내 amastigote의 복제에 의해 평가될 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 형질 전환 또는 녹아웃 amastigote생산에 관여하는 기생충 단계 분화를 우회합니다. 시간적 축아제아스티고트 문화의 활용은 T. cruzi에서 단계별 연구의 실험적 자유를 확장할 가능성이 있다.

스윔 아웃 절차에 의한 트라이포마스티고트 격리
수영 아웃 절차에 의해 오래된 EA를 오염에서 신선한 trypomastigotes를 수확하려면, 세포 펠릿은 적어도 인큐베이션 할 필요가 1 시간. 2 시간 이상 에 대한 펠릿을 배양하는 것은 크게 용액에서 수영 trypomastigotes의 수를 증가하지 않습니다 ( 그림2B)를 참조하십시오. 이 특정 실험에서, 초기 혼합물에서 trypomastigote의 비율은 38%, 그리고 수영 후 백분율 이상 이었다 98% 어떤 주어진된 시점에서. 두 개의 T-75 플라스크에서, 우리는 정기적으로이 수영 프로토콜에 의해 순수한 trypomastigote의 3-4 x 107 세포를 얻습니다.
축 문화로 녹아웃 amastigote의 성장 모니터링
<p cl...

여기에서, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여, Trypanosoma cruzi의 세포외 amastigote로 유전자 녹아웃을 소개하는 프로토콜을 기술합니다. 성장 표현형은 축세포 배양의 세포 계수 또는 숙주 세포 침입 후 세포 내 아마스티고테의 증식에 의해 추적될 수 있다.

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

amastigote는 의무적인 세포내 기생충이기 때문에 실험에서 T.cruzi의 호스트 감염 단계를 사용하는 것은 어렵습니다. 우리의 배양 기술은 amastigote가 일시적으로 호스트 세포의 외부에 복제할 수 있게 해주므로, 우리는 기생충의 임상적으로 관련있는 단계에서 직접 실험을 수행할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 연구소의 기술자 인 유키 아쿠츠 (Yukie Akutsu)가 될 것입니다.원고 의 지시에 따라 호스트 기생충 공동 문화를 유지합니다. Cas9 발현 기생충이 분화 할 준비가되면, 상체관을 원상 관으로 수집하고 현미경으로 샘플 품질을 확인하십시오. 세포 외 amastigotes의 상당수가 있는 경우에, 트립pomastigotes를 격리하기 위하여 수영 절차를 수행하십시오.2, 100 회 G.로 15 분 동안 trypomastigotes와 amastigotes의 혼합물을 스핀 다운 튜브에 매체의 0.5 ~ 1 밀리리터를 떠나, 슈퍼 나탄의 대부분을 폐기. 느슨하게 튜브를 캡, 활성 trypomastigotes 펠릿에서 수영 할 수 있도록 1 ~ 2 시간 동안 섭씨 37도에서 펠릿을 배양. 인큐베이션 후, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 trypomastigotes와 상체를 전송합니다.그것을 아래로 회전, DMEM의 5 밀리리터와 펠릿을 다시 중단. 기생충을 T-25 배양 플라스크로 옮기고, 가습된 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소 하에서 플라스크를 섭씨 37도에서 배양한다. 기생충의 약 95%는 24시간 후에 amastigotes로 분화할 것입니다.원심 분리는 세포 외 amastigotes의 문화를 2, 100 배 G에서 15 분 동안, 그리고 상체를 폐기합니다. 밀리리터당 8세포에 10배의 최종 세포 밀도에 대한 보충 용액을 제공하는 전기포기 버퍼로 펠릿을 재연한다. 1.5 리터 미세 원심 분리튜브로 재중단 된 기생충의 Aliquot 100 마이크로 리터.그런 다음 5~10마이크로그램의 가이드 RNA를 추가하고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 혼합물을 2밀리미터 갭 전기기큐벳으로 옮기고, 전기기공 장치와 펄스를 적용한다. 그런 다음, cuvette 내용을 T-25 플라스크로 옮기고, 5밀리리터의 사전 온진 LIT 매체를 포함하고, 캡을 느슨하게 두고, 5% 이산화탄소 하에서 플라스크를 섭씨 37도에서 배양한다.축 의 배양의 연속 또는 호스트 세포 감염 후 세포 내 amastigo

introducing-gene-knockout-directly-into-amastigote-stage-trypanosoma

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Toxoplasma gondii 에서 약물 내성 유전자를 확인하는 데 유전지도를 기반으로하는 QTL 매핑을 사용하는 방법과 게놈 타겟을 효율적으로 편집하는 CRISPR / Cas9 시스템으로 어떻게 검증 할 수 있는지에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 약물 내성 유전자.

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 기술을 사용하여 다중 유전자 녹아웃을 만드는 데 사용되는 하나의 가이드 RNA concatemer 벡터에 여러 단일 가이드 RNA를 복제하는 단계를 설명합니다. 장 organoids에 이중 knockouts의 생성은이 방법의 가능한 응용 프로그램으로 표시됩니다.

CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

우리 glmS생성 하는 방법에 설명- 변형 체 falciparum 게놈 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 최저의 돌연변이 체를 기반으로.

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

기생 선충류 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti 에 대한 기능적 게놈 툴킷에는 트랜스제네시스, CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발 및 RNAi가 포함됩니다. 이 프로토콜은 성선 내 미세주사를 사용하여 전이유전자 및 CRISPR 성분을 S. stercoralis 및 S. ratti에 도입하는 방법을 입증할 것이다.

미세주입에 의한 스트 롱실로이드 종에서 형질전환 및 녹아웃 생성

학습하세요 Trypanosoma cruzi 아마스티고테에서 CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃 방법을. 숙주 세포 외 배양 기술로 생장 표현형을 분석하고 기생충 생물학 및 치료 표적 연구에 활용하세요.

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

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