CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

amastigote는 의무적인 세포내 기생충이기 때문에 실험에서 T.cruzi의 호스트 감염 단계를 사용하는 것은 어렵습니다. 우리의 배양 기술은 amastigote가 일시적으로 호스트 세포의 외부에 복제할 수 있게 해주므로, 우리는 기생충의 임상적으로 관련있는 단계에서 직접 실험을 수행할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 연구소의 기술자 인 유키 아쿠츠 (Yukie Akutsu)가 될 것입니다.

원고 의 지시에 따라 호스트 기생충 공동 문화를 유지합니다. Cas9 발현 기생충이 분화 할 준비가되면, 상체관을 원상 관으로 수집하고 현미경으로 샘플 품질을 확인하십시오. 세포 외 amastigotes의 상당수가 있는 경우에, 트립pomastigotes를 격리하기 위하여 수영 절차를 수행하십시오.

2, 100 회 G.로 15 분 동안 trypomastigotes와 amastigotes의 혼합물을 스핀 다운 튜브에 매체의 0.5 ~ 1 밀리리터를 떠나, 슈퍼 나탄의 대부분을 폐기. 느슨하게 튜브를 캡, 활성 trypomastigotes 펠릿에서 수영 할 수 있도록 1 ~ 2 시간 동안 섭씨 37도에서 펠릿을 배양. 인큐베이션 후, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 trypomastigotes와 상체를 전송합니다.

그것을 아래로 회전, DMEM의 5 밀리리터와 펠릿을 다시 중단. 기생충을 T-25 배양 플라스크로 옮기고, 가습된 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소 하에서 플라스크를 섭씨 37도에서 배양한다. 기생충의 약 95%는 24시간 후에 amastigotes로 분화할 것입니다.

원심 분리는 세포 외 amastigotes의 문화를 2, 100 배 G에서 15 분 동안, 그리고 상체를 폐기합니다. 밀리리터당 8세포에 10배의 최종 세포 밀도에 대한 보충 용액을 제공하는 전기포기 버퍼로 펠릿을 재연한다. 1.5 리터 미세 원심 분리튜브로 재중단 된 기생충의 Aliquot 100 마이크로 리터.

그런 다음 5~10마이크로그램의 가이드 RNA를 추가하고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 혼합물을 2밀리미터 갭 전기기큐벳으로 옮기고, 전기기공 장치와 펄스를 적용한다. 그런 다음, cuvette 내용을 T-25 플라스크로 옮기고, 5밀리리터의 사전 온진 LIT 매체를 포함하고, 캡을 느슨하게 두고, 5% 이산화탄소 하에서 플라스크를 섭씨 37도에서 배양한다.

축 의 배양의 연속 또는 호스트 세포 감염 후 세포 내 amastigotes로 세포 성장을 모니터링. 축축 아마스티고스로 세포 성장을 모니터링하는 경우, 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포 외 암미고를 용액으로 재일시 중단하고, 문화의 마이크로리터 20개를 마이크로센트리튬 요오드 용액1마이크로리터와 혼합하여 마이크로센트리푸시지 튜브에 넣습니다. 온도가 아마스티고테의 축축증을 가능하게 하는 요인 중 하나이기 때문에 문화 플라스크를 필요 이상으로 인큐베이터 외부에 두지 않는 것이 중요합니다.

이 샘플을 혈류계에 적용하여 형광 현미경으로 관찰합니다. 그런 다음 프로피듐 요오드에 의해 얼룩지지 않는 가능한 아마스티고의 수를 계산합니다. 세포 내 amastigotes로 녹아웃 세포의 성장을 모니터링하려면, DMEM과 12 웰 플레이트에서 시드 호스트 3T3 세포.

전기기분기 후 하루 는 원심분리에 의해 녹아웃 amastigotes를 수집, 상체를 폐기하고, DMEM의 두 밀리리터와 기생충을 다시 중단. 숙주 세포 배양에서 배지를 제거하고 다시 중단된 amastigotes를 추가합니다. 2일 동안 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하여 아마스티고트가 감염을 확립할 수 있도록 합니다.

이틀 후, DMEM을 가진 호스트 세포 밖에서 세포 외 아마스티고를 씻어 내고 신선한 DMEM을 추가하십시오. 추가 2 일 동안 인큐베이션을 계속 한 다음 숙주 세포 및 세포 내 amastigotes의 핵을 시각화합니다. TcGM1에 대한 가이드 RNA와 전염된 T.Cruzi amastigotes가 대조군에 비해 상당한 성장 결함을 보이는 것으로 입증되었다.

세포 내 amastigotes로 성장을 모니터링 할 때, T.Cruzi 핵과 관련된 숙주 핵의 분수는 대조군에 비해 TcCGM1 녹아웃 그룹에서 상당히 낮습니다. 반대로, 파라플래그엘라로드 단백질 TcPAR1에 대한 가이드 RNA의 트랜스포메이션은 4일간의 축절 배양 후 세포 성장에 크게 영향을 미치거나 세포내 amastigotes의 성장을 억제하지 않는다. 그러나, 5일 후 감염, 숙주 세포에서 나오는 트라이포마스티고트의 수는 대조군에 비해 TcPAR1 녹아웃 공동배양에서 현저히 낮다.

더욱이, 대조군내 호스트 셀 내부의 차별화된 트라이포마스티고스가 녹아웃 그룹의 사람들보다 더 활발하게 나타났다. 이 방법은 또한 가이드 RNA를 Cas9 발현 아마스티고테로 이식하는 대신 amastigote 단계에 외인성 유전자의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있으며, 플라스미드를 야생형 아마스티고드로 전환하여 외인성 유전자를 발현할 수 있다.