Name: 1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화 방법을 통해 HIV 감염자와 건강한 대조군의 면역 기능을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 유세포 분석 분석을 제공하기 위한 환자 샘플 및 세포 면역학 물질 대사 코어를 제공하는 HIV 임상/종양 Biorepository Core에 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH P20GM121288 및 P30GM114732에 의해 투자되었습니다.

아래에 설명 된 모든 방법은 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터 뉴 올리언스 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 혈액은 통보된 동의를 얻은 후에 수집되었습니다.
참고: 전체 절차는 생물 안전 수준 2(BSL2) 시설에서 멸균 조건하에서 수행되므로 생물학적 물질을 처리하는 데 주의가 사용됩니다. 특히, 각 단계는 생물 안전 성 캐비닛 에서 멸균 기술을 사용하여 수행됩니다. 혈액, 혈액 제품, 세포 또는 세포 제품 파이펫팅과 관련된 각 단계 후, 적절한 폐기 전에 후드 내부의 폐기물 용기에서 10 % 표백제로 모든 플라스틱 재료 (즉, 혈청 피펫, 파이펫 팁 및 튜브)를 헹구는 것이 중요합니다.
1. 면역 자기 음성 선택에 의한 1 차적인 인간 단핵구의 격리
<ol><li>4 개의 10 mL 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 진공 관 (튜브 당 혈액 10 mL)에서 신선한 인간 전혈 40 mL (HIV+ 환자 또는 건강한 대조군)을 수집하십시오. 생체 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 40 mL의 혈액을 모두 50 mL 원뿔형 프로필렌 튜브 로 옮니다.</li>
	<li>선택한 인간 단핵구 절연 키트(재료 표)에대한 제조업체의 프로토콜에 따라 키트에 제공되는 단핵구 절연 칵테일 2 mL를 혈액 튜브에 추가하십시오. 소용돌이 자기 구슬은 또한 키트에 30 s에 대해 제공되며, 혈액 튜브에 2 mL를 추가합니다.<ol>
<li>40 mL 미만의 혈액을 사용할 수 있는 경우, 추가된 시약을 축소하십시오. 용액을 혼합하려면 플라스틱 25 mL 혈청학적 파이펫과 파이펫을 위아래로 혼합하고 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈액 혼합물을 4개의 50 mL 튜브로 균등하게 분리하고 각 튜브에 1 mM EDTA를 함유하는 멸균 인산완충식염수(PBS)를 30mL 첨가합니다. 플라스틱 25mL 세로올로지컬 파이펫으로 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요.</li>
	<li>튜브를 자석 홀더에 10 분 동안 놓고 항체 가액 자기 구슬을 제거합니다. 각 튜브마다 하나씩 4개의 자석 홀더를 동시에 사용하여 각 혈액 샘플에 대해 일관된 배양 및 격리 시간을 허용합니다.</li>
	<li>그들은 여전히 자석 홀더에있는 동안, 파이펫을 사용하여, 각 튜브의 중심에서 내용을 그립니다. 적혈구를 그리지 않도록주의하십시오 (10 mL 시작 량의 10 % 이하), 4 개의 새로운 50 mL 튜브 중 하나에 내용물.</li>
	<li>각 50 mL 튜브에 와류 자기 비드 500 μL을 추가합니다. 25 mL 파이펫으로 위아래로 파이펫을 하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 자석 홀더에 넣고 5 분 동안 넣습니다.</li>
	<li>자석 홀더에 있는 동안 각 튜브의 중앙에서 내용물 4개 중 하나로 조심스럽게 내용물 전달합니다. 각 새로운 50 mL 튜브를 자석 홀더에 5 분 동안 직접 놓습니다.</li>
	<li>각 튜브의 중앙에서 4개의 새로운 50mL 튜브 중 하나로 내용물들을 조심스럽게 옮김을 전달합니다. 모든 새로운 50 mL 튜브를 300 x g에서 5 분 동안 회전. 상급자를 흡인하고 총 10 mL의 멸균 PBS에서 4 개의 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>혈세포계를 사용하여 트라이판 블루 배제에 의해 세포를 카운트. 참고: 8-20 x 106 세포는 일반적으로 전혈 40 mL에서 수득됩니다.</li>
</ol>2. 1 차적인 인간 단핵구의 배양
<ol><li>37 °C 수조를 사용하여 따뜻한 혈청이없는 RPMI 1640 매체는 1 % 페니실린 - 스트렙 토신 (펜 / 스트렙)으로 보충하고 (생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 계속 사용하는 동안) 1 x 106 세포 / mL의 농도로이 매체의 단핵 구를 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>6 웰 플레이트 또는 35mm 접시에 각 우물에 1 mL의 재부유 된 세포를 추가하고 (세포의 최종 수는 1 x 106 세포 / 플레이트여야함) 5 %CO2가있는37 °C 인큐베이터에 놓습니다. 세포가 부착될 때까지 0.5-1.0h를 기다립니다.</li>
	<li>37°C 의 수조를 사용하여, 따뜻한 열불활성화(HI) 태아 소 혈청(FBS)을 사용한다. 각 접시에 FBS 100 μL(최종 농도 10%) 추가합니다. 대식 세포 분화를 촉진 하는 세포에 성장 인자를 추가 합니다.<ol>
<li>M1유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 25 ng/mL의 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 미디어에 첨가하였다. M2-유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 50 ng/mL의 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를미디어(28)에첨가하여. 참고: GM-CSF 및 M-CSF 는각각7,28,30에대해 M1 또는 M2에 대한 포라이밍 셀을 프라이밍하는 동안 일반적인 대식세포 표현형(M0)으로 단핵구 분화를 허용한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 문화에서 1 차적인 인간 단핵구를 전위
<ol><li>miRNA를 이용한 트랜스펙트 단핵구는 중합체 계 형질감염 시약(표오브 물질)을함유하는 키트를 사용하여 모방또는 억제제 또는 siRNA를 모방한다.<ol>
<li>형질감염 키트에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라 (그리고 생물 안전 성 캐비닛에서 멸균 기술의 사용을 계속), 먼저 1.83 μM의 최종 농도로 버퍼에서 선택한 miRNA 모방 / 억제제 또는 siRNAs를 희석 1 x 106 세포의 트랜스펙션 당 10 μL을 준비하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제공된 중합체의 1 μL을 신선한 1.5 mL 마이크로원절튜브에 첨가하여 트랜스펙션 시약을 준비하고, 즉시 90 μL의 완충액을 첨가하였다(총 91μL의 트랜스펙트당 시약). 3-5 s에 대 한 소용돌이.</li>
	<li>희석된 miRNA 모방/억제제 또는 siRNA의 10 μL을 함유하는 튜브내로의 형질감염 용액의 피펫 90 μL. 부드러운 파이펫팅으로 섞고 RT에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1 x 106 도금 단핵구의 하나의 우물 (또는 접시)에 100 μL의 형질 감염 복합체를 추가하십시오. 37°C에서 4시간 동안 세포를 배양한 다음, 배지를 3 mL의 완전 배지(RPMI 1640+1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 열 불활성화 FBS)로 대체하여 GM-CSF 또는 M-CSF를 함유한다.</li>
</ol>4. M1/M2 차별화 및 활성화
<ol><li>단핵구는 즉시 배양시 광범위한 M0 대식세포로 분화하기 시작합니다. 도금 후 3일째에, 생물안전성 캐비닛 하에서 멸균 기술을 계속 사용하고 3 mL의 신선한 RMPI 1640 미디어(1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 열 불활성화 FBS, 25 ng/mL GM-CSF로 보충)로 미디어를 교체하여 M1과 같은 편광 또는 50 ng/mL MF를 촉진합니다. 이러한 조건에서 세포를 37°C, 5%CO2에서인큐베이터에서 초기 도금으로부터 총 6일 동안 배양한다.</li>
	<li>M1 대식 세포 표현형으로 프라이밍 세포의 편광을 진행하기 위해, 세포 매체를 5% 열 불활성화 FBS, 1% 펜/스트렙, 100 ng/mL 대장균-유래리포폴리사카라이드(LPS) 및 20 ng/mL 인터페론(IF)을 포함하는 새로운 매체로 대체하여 인큐베이션 6일째에 세포를 활성화합니다.</li>
	<li>M2 대식 세포 표현형으로 프라이밍 세포의 편광을 진행하기 위해, 세포 매체를 5% 열 불활성화 FBS, 1% 펜/스트렙, 10 ng/mL ML M-CSF 및 20 ng/mL 인터류키핀 4(IL-4)를 포함하는 새로운 매체로 대체하여 인큐베이션 6일째에 세포를 활성화합니다.</li>
	<li>24 시간 후 RNA, 단백질 또는 유동 세포 분석 분석을 위해 세포를 수확하십시오.<ol>
<li>세포가 수집 할 준비가되면, PBS로 접시에 세포를 2 배 씻어 (RNA 추출을위한 RT에서 또는 단백질 추출을위해 얼음에 냉각). 분화된 대식세포는 이제 플레이트에 단단히 부착되기 때문에 플레이트에 세포를 직접 용해하여 RNA 및 단백질 분석을 위한 물질을 얻습니다.</li>
		<li>유세포 측정을 위한 재료의 수집을 위해, 접시에 2 mM EDTA를 포함하는 PBS를 추가하고, 37 °C에서 10 분 동안 세포를 배양하고, 접시에서 세포를 부드럽게 긁어 내고, 표준 프로토콜을 진행하기 전에 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 내용물수집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 유세포분석
<ol><li>배양 배지를 제거하기 위해 PBS에서 세포를 헹구는다. 100,000개의 세포(각 유량 세포 분석 조건당)를 스핀다운하고 HuFcR 결합 억제제 2 μL을 함유하는 PBS의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. RT에서 15분 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>50 μL의 염색 완충액을 첨가하고 원하는 항체(여기, CD80, CD83, CD163 및 CD209를 사용하였다)를 권장량에 첨가하였다.</li>
	<li>부드럽게 섞고 4°C에서 30분간 어둠 속에서 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 2x세척하고 시토플루오리미터에서 샘플을 실행하기 전에 150 μL의 PBS에서 염색된 세포를 다시 중단합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638(2016).</li>
<li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+the+Macrophage%3A+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li>
<li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li>
<li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Monocyte%2FMacrophages+during+HIV%2FSIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693(2017).</li>
<li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells%3A+Contribution+to+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+M1%2FM2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264(2013).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097(2017).</li>
<li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage+polarization+in+vitro%3A+maturation+and+activation+methods+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li>
<li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li>
<li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li>
<li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li>
<li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li>
<li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses%3A+possible+pathogenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li>
<li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li>
<li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li>
<li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15(2016).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection%3A+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852(2015).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175(2018).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing%3A+A+Pilot+Study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li>
<li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li>
<li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535(2014).</li>
<li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li>
<li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593(2015).</li>
<li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic%2C+functional%2C+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

제시된 프로토콜은 단핵구 및 대식세포를 공부하기 위한 모형으로 HIV 감염한 과목에서 1 차적인 세포의 사용을 보여줍니다. HIV+ cART를 겪고 있는 환자는 여러 해 동안 감염과 함께 살고 있으며 손상된 면역 체계와 관련된 다른 공동 감염을 가질 수도 있습니다. HIV 만성 감염의 존재에서 면역 조절을 연구하기 위해 세포는 환자로부터 직접 수확되었습니다. miRNA가 세포 발달 및 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났듯이, 프로토콜은 이들 1차 세포에서 miRNA 발현을 조작하는 능력에 초점을 맞추고있다(그림 2, 그림 3, 도 4). 동일한 절차를 사용하여 이 프로토콜은 siRNAs에도 매우 효과적입니다(그림3, 그림 4). 성숙한 대식...

인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1) 감염은 기회 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)으로 이어질 수있는 심각한 면역 기능 장애를 유발합니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염 환자는 낮은 바이러스 하중 및 일반적인 CD4+ T 세포 수에 의해 특징지더라도, 면역 계통의 기능은 암 발전의 증가한 리스크에 연결되는 역기능 면역 반응으로 이끌어 내는 이 개별에서 손상될 수 있습니다1. cART에 HIV 환자에 있는 면역 기능 장애의 기계장치는 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서 환자 유래 면역 세포를 특성화하고 생물학 및 기능을 조사하는 것이 현재 HIV 연구의 중요한 구성 요소입니다.
단핵구와 대식세포는 면역 반응의 주요 조절자이며 HIV 감염2,3,4,5에서근본적인 역할을 합니다. 본질적으로 이질성 및 플라스틱, 대식세포는 고전적으로 활성화(M1) 또는 대안적으로 활성화(M2)로 광범위하게 분류될 수 있다. 이러한 일반적인 분류는 실험 조건을 설정할 때 필요하지만, 대식세포의 편광 상태는다양한사이토카인6,7,8,9에의해 역전될 수 있다. 여러 연구가 단핵구와 수지상 세포에 대한 HIV 감염의 영향을 조사했지만, 단핵구 매개 반응의 분자 세부 사항은 크게 알려지지 않은6,7, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 면역 세포 조절 및 기능에 관여하는 인자 들 중에서, microRNAs (miRNAs), 유전자 발현 후 전사적으로 조절되는 짧은 비코딩 RNA는, 주요 세포 경로의 맥락에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (즉, 성장, 분화, 개발, 및 세포 자멸)20. 이들 분자는대식세포(21)의기능적 편광을 지시하는 데 필수적인 전사 인자의 중요한 조절자로 기술되었다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에서 단핵구에 있는 miRNAs의 잠재적인 역할은 조사되었습니다, 그러나 필드에 있는 진행은22,23,24,25,26를훨씬 더 필요로 합니다 . 이 논문에서는 HIV 에 감염된 환자 및 대조군으로부터 1차 인간 단핵구로 miRNAs 및 siRNAs를 트랜스펙트하는 최적화된 방법에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 시판되는 시약과 키트에 의존하며, 기술 절차의 연속성은 임상 샘플로 작업할 때 불필요한 실험 변수를 제거하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 중요한 팁(즉, 플레이트에 대한 세포의 순착을 촉진하기 위해 무혈청 매체로 도금된 세포 의 수 또는 간략한 인큐베이션)를 제공한다. 또한, 이 프로토콜에 사용되는 편광 조건은 출판된 작업27,28,29에서파생된다.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 플라스틱 혈액 수집 튜브 K2</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>CD14 PerCP</td><td>Invitrogen</td><td>46-0149-42</td><td>유세포 분석 - 접합 항체</td></tr><tr><td>CD163 BV711</td><td>BD Horizon</td><td>563889</td><td>유세포 분석 - 접합 항체</td></tr><tr><td>CD209 BV421</td><td>BD Horizon</td><td>564127</td><td>유세포 분석 - 접합 항체</td></tr><tr><td>CD80 FITC</td><td>BD Horizon</td><td>557226</td><td>유세포 분석 - 접합 항체</td></tr><tr><td>CD83 APC</td><td>BD Horizon</td><td>551073</td><td>유세포 분석 - 접합 항체</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19669</td><td></td></tr><tr><td>EIF4EBP1 mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>EIF4EBP1 siRNA</td>용 단클론 항체Santa <td>Cruz</td><td>sc-29594</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43618</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47724</td> 웨스턴 블롯 HuFcR 결합 억제제<td>에 대한 단클론 항체</td></tr><tr><td></td><td>eBiosciences</td><td>14-9161-73</td><td>유세포 분석 완충액</td></tr><tr><td>Kaluza 분석 소프트웨어</td><td>Beckman Coulter</td><td>B16406</td> Escherichia coli O55의 <td>유세포 분석 데이터</td></tr><tr><td>지질다당류를 분석하는 소프트웨어: B5</td><td>Sigma</td><td>L4524</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA microRNA Mimic has-miR-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>YM00472124</td><td></td></tr><tr><td>MISSION miRNA 음성 대조군</td><td>시그마</td><td>HMC0002</td><td>근적외선 염료와 결합 스크램블 miRNA</td></tr><tr><td>Nunc 35mm 세포 배양 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM-050</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IFN-&감마;</td><td>R& D 시스템</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-4</td><td>R& D 시스템</td><td>204-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 M-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>216-MC-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>10040CVMP</td><td></td></tr><tr><td>스크램블 컨트롤 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Blue Transfection 시약 키트</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 세포 증식 시약</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td>세포 생존율 평가를 위한 비색 분석</td></tr></tbody></table>

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 1990 년대 중반에 결합 된 항 레트로 바이러스 치료 (cART)의 도입에도 불구하고 주요 건강 관심사로 남아 있습니다. 항레트로바이러스 요법은 전신 바이러스 부하를 효율적으로 낮추고 정상적인 CD4+ T 세포 수를 회복시키지만 완전히 기능적인 면역 체계를 재구성하지는 않습니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에 있는 역기능 면역 계통은 면역 성 활성화, 면역 세포의 조기 노화, 또는 지속적인 염증에 의해 특징지어질 수 있습니다. 이러한 조건은 HIV 감염과 관련된 comorbid 요인과 함께 세포 및 동물 모델에서 쉽게 재현 할 수없는 질병에 복잡성을 추가합니다. 이 환자에 있는 면역 기능 장애의 근본적인 분자 사건을 조사하기 위하여는, 시험관에서 인간 1 차적인 단핵구를 문화로 조작하는 체계는 여기에서 제시됩니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 HIV 음성 대조군뿐만 아니라 CART를 받은 HIV 감염 개인으로부터 얻은 1차 CD14+ 단핵구의 배양 및 형질감염을 허용한다. 이 방법은 단핵구 및 단핵구 유래 대식세포의 격리, 배양 및 형질취득을 포함합니다. 시판되는 키트와 시약이 사용되는 동안, 프로토콜은 miRNA 모방 및 억제제뿐만 아니라 siRNAs와 단핵구의 성공적인 준수 및 형질감염을위한 중요한 팁과 최적화 된 조건을 제공합니다.

설명된 절차를 사용하여, HIV에 감염된 개별 및 건강한 기증자에게서 1 차적인 인간 단핵구는 격리되었습니다. 여기에 제시된 모든 데이터는 낮은(&amp;20 카피/mL) 또는 탐지할 수 없는 바이러스 부하 및 일반 CD4+ T 세포 수로 cART를 받는 HIV+ 피험자로부터 얻어졌습니다. 격리 직후, 세포를 염색하고, 세포 집단의 순도를 확인하기 위해 유세포측정을 수행하였다. 결과는 &gt;97%의 세포가 CD14에 대해 양성으로 염색된 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). 대식세포의 편광을 위해, 출판된 프로토콜은28을사용하였다. 1차 인간 단핵구는 6일 동안 GM-CSF 또는 M-CSF의 존재에서 배양되었다. 6일째에, 세포는 M1 또는 M2 대식세포쪽으로 활성화되었다. 24시간 후 활성화, 세포를 수확하고 대식세포 마커의 유세포분석분석으로 염색하였다.
<p class...

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV 감염은 검출 가능한 바이러스없이 항 레트로 바이러스 치료를 받는 개인에서도 면역 기능 장애를 일으킵니다. 이 방법은 면역 반응의 주요 조절기인 단세포 기능의 연구를 가능하게 합니다. 우리는 인간의 기본 단핵구의 격리, 문화 및 트랜스퍼팅을 위해 이 기술을 최적화했습니다.우리는 HIV 감염한 개별에 있는 면역 기능 장애의 분자 기계장치를 이해하기 위하여 이 방법을 이용합니다, 그러나 단색세포와 관련되었던 그밖 면역 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 이것이 인간의 혈액으로 일하는 첫번째 시간인 경우에, 적당한 생물안전 프로토콜을 따르고 가능하게 전염성 물질로 견본전부를 취급하는 것을 기억하십시오. 4개의 10 밀리리터 EDTA 진공 관에서 40밀리리터의 신선한 인간 전혈을 수집한 후, 멸균 기술을 사용하여 모든 혈액을 생물 안전 캐비닛에 있는 50밀리리터 원추형 프로필렌 튜브로 이송합니다.선택한 인간 단화 절연 키트의 제조업체의 지시에 따라 키트에서 혈액 튜브에 단핵 분리 칵테일 2 밀리리터를 추가하고 키트에서 자기 구슬을 30초 동안 소용돌이시다. 두 밀리리터의 구슬을 혈액에 넣고 25밀리리터 세로지피펫을 사용하여 구슬을 혈액과 조심스럽게 섞습니다. 실온에서 5분 후, 혈액을 50밀리리터 튜브 4개 사이에 균등하게 분할하고 각 튜브에 1밀리미터 EDTA로 보충된 멸균 PBS 30밀리리터를 추가합니다.플라스틱 25 밀리리터 세로지오피펫과 다시 섞어 튜브를 자기 홀더에 놓습니다. 10분 후, 파이펫을 사용하여 각 튜브의 중앙에서 1밀리리터 이상의 적혈구를 흡인하지 않도록 주의하고 튜브 내용물 4개를 새로운 50밀리리터 튜브 중 하나로 분배합니다. 각 튜브에 소용돌이가 있는 자기 구슬의 500마이크로리터를 추가하고 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다.튜브를 5분 동안 자기 홀더에 다시 넣은 후 각 튜브의 중앙에서 4개의 새로운 50밀리리터 튜브 중 하나로 조심스럽게 내용물의 내용을 전달합니다. 모든 세포 현탁액이 전달되면 각 새로운 50 밀리리터 튜브를 자석 홀더에 5분 간 배치한 후 튜브 내용내용을 4개의 새로운 50밀리리터 튜브 의 세 번째 세트로 조심스럽게 옮기십시오. 그런 다음 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 계산을위한 멸균 PBS의 총 10 밀리리터에서 모든 4 개의 세포 펠릿을 재중단합니다.계산 후, 37섭씨 37도의 혈청 프리 RPMI 1640 배지의 밀리리터 당 10번에서 6번째 세포로 1회 10회

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 면역자기 음성 분리를 통해 전인의 혈액에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 단핵구는 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

면역자기 음성 선택에 의한 전혈에서 단핵구의 분리

이 비디오는 일차 단핵구를 대식세포로 프라이밍하는 방법을 보여줍니다. 1차 인간 단핵구는 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 사용하여 M1-like 전염증성 표현형으로 분리 및 분화할 수 있으며, 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 M2-like 항염증성 표현형으로 분화할 수 있습니다.

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

이 연구는 체외 수지상 세포(DC)를 얻기 위한 두 가지 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교합니다. 단핵구는 부착에 의해 선택되거나 자기 분리에 의해 음적으로 강화됩니다. MDDC 생존력, 증식 및 CD11c/CD14 표면 마커 발현과 함께 단핵구 수율 및 생존율을 두 방법 간에 비교합니다.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

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이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

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배우세요 1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화 방법을 통해 HIV 감염자와 건강한 대조군의 면역 기능을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

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